薊馬取食誘導(dǎo)對紫花苜蓿次生代謝物含量及防御酶活性的影響

吳芳，師尚禮，康文娟，陳曉梅，阿蕓，張輝輝，李自立

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室，中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070）

隨著我國從“糧-經(jīng)”種植結(jié)構(gòu)到“糧-經(jīng)-飼”種植結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變，草產(chǎn)業(yè)呈現(xiàn)出強(qiáng)勁的發(fā)展勢頭，被稱為“牧草之王”的紫花苜蓿（Medicago sativa）種植面積也逐年增加。甘肅省作為紫花苜蓿生產(chǎn)的第一大省，紫花苜蓿種植面積占全國的1/3，尤其在金昌、張掖和酒泉等河西地區(qū)形成了苜蓿主產(chǎn)區(qū)［1］。然而，薊馬類害蟲是紫花苜蓿主產(chǎn)區(qū)最常見的害蟲之一［2-4］。調(diào)查發(fā)現(xiàn)為害紫花苜蓿的薊馬種類分別有牛角花齒薊馬（Odontothrips loti）、苜蓿薊馬（O.phateratus）、普通薊馬（Thrips vulgatissiums）、花薊馬（Frankliniella intonsa）、煙薊馬（T.tabaci）等，其中牛角花齒薊馬為優(yōu)勢種［5-8］。薊馬通過銼吸式口器主要將苜蓿的心葉、嫩葉等幼嫩組織的表皮挫破，引起葉片畸形、褪色，嚴(yán)重時(shí)卷曲發(fā)白，導(dǎo)致草產(chǎn)量損失、營養(yǎng)價(jià)值降低。此外，因薊馬個(gè)體微小、隱蔽性強(qiáng)、繁殖速度快、易產(chǎn)生抗藥性，單一的殺蟲劑難以取得理想的防治效果［9］。因此，選育抗薊馬苜蓿品種是防治該蟲的重要策略和有效方法，而探索和挖掘紫花苜蓿自身形成的抗薊馬生理機(jī)制是抗蟲育種的基礎(chǔ)。

植物受到害蟲為害后，其植株體內(nèi)防御途徑中的信號分子會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生其下游化學(xué)防御物質(zhì)，防御酶和某些次生代謝物會(huì)在極短的時(shí)間內(nèi)迅速合成并大量積累，從而激活誘導(dǎo)型防御機(jī)制，增強(qiáng)自身抗性［10-12］。植物體內(nèi)的黃酮、單寧和木質(zhì)素等次生代謝產(chǎn)物能阻礙害蟲取食，影響害蟲生長、發(fā)育和繁殖，其含量與植物抗蟲性密切相關(guān)［13-14］。王小珊［15］研究表明不同蟲口壓力牛角花齒薊馬為害后，抗薊馬苜蓿無性系R-1和感薊馬苜蓿無性系I-1葉片中的總酚、黃酮、縮合單寧和木質(zhì)素含量均高于對照。駱桂芬等［16］和蔣桂華等［17］研究指出植物受到蟲害或病害侵染時(shí)，可以誘導(dǎo)木質(zhì)素含量升高。孫興華等［18］研究表明黃瓜（Cucumis sativus）受南美斑潛蠅（Liriomyza huidobrensis）為害后，其葉片的黃酮和單寧含量隨著為害程度增強(qiáng)而顯著增加。吳巖等［19］研究發(fā)現(xiàn)木瓜秀粉蚧（Paracoccus marginatus）為害木薯（Manihot esculenta）前后，抗蟲木薯品種的單寧含量均顯著高于感蟲木薯品種。以往的研究證實(shí)過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）是植物次生代謝過程中的關(guān)鍵酶，它們在植物抵抗害蟲方面起著重要的保護(hù)作用［20-21］?？芙瓭龋?2］研究指出薊馬為害后，抗、感薊馬苜蓿無性系R-I和I-1的POD、PAL和PPO活性升高可能是一種誘導(dǎo)抗性的表現(xiàn)。蘆屹等［23］研究指出棉蚜（Aphis gossypii）取食脅迫后，抗蚜棉花品種的POD、PAL和PPO活性顯著高于感蚜棉花品種。武德功等［24］研究指出隨著玉米蚜（Rhopalosiphum maidis）密度的增加，玉米（Zea mays）抗蚜品種的PAL和PPO活性呈上升趨勢。然而，薊馬取食誘導(dǎo)對不同抗薊馬紫花苜蓿品種次生代謝物質(zhì)含量與防御酶活性的影響很少報(bào)道。

因此，本研究以3種不同抗薊馬紫花苜蓿品種為材料，研究不同薊馬頭數(shù)為害對紫花苜蓿苗期的次生代謝物質(zhì)（黃酮、單寧、木質(zhì)素）含量和防御酶（POD、PAL、PPO）活性的影響，以期闡明薊馬為害紫花苜蓿的誘導(dǎo)型防御的生理機(jī)制，為篩選紫花苜蓿關(guān)鍵抗蟲次生代謝物提供理論基礎(chǔ)，為薊馬綜合防治提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試蟲源：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)牧草實(shí)訓(xùn)基地田間自然發(fā)生的薊馬成蟲（牛角花齒薊馬為優(yōu)勢種）。

供試紫花苜蓿品種分別為抗薊馬紫花苜蓿品種甘農(nóng)9號（M.sativacv.Gannong No.9）［25］、感薊馬紫花苜蓿品種甘農(nóng)3號（M.sativacv.Gannong No.3）［4］和高感薊馬紫花苜蓿品種WL363HQ（M.sativacv.WL363HQ）［26］。甘農(nóng)9號和甘農(nóng)3號種子由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，WL363HQ由北京正道種子公司提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1紫花苜蓿幼苗生長試驗(yàn)2020年6月至8月在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)牧草實(shí)訓(xùn)基地8 m×6 m×2 m的網(wǎng)室中進(jìn)行。將營養(yǎng)土∶草炭土∶蛭石按比例2∶1∶1混合均勻，稱取750 g裝入花盆（高度為18 cm，直徑為12 cm）中，將花盆的2/3埋入土中，置于田間環(huán)境條件下發(fā)芽和生長。將0.1% HgCl2消毒后的飽滿、大小均勻的種子，播種于花盆中，出苗后每盆保留生長一致的5株幼苗。根據(jù)需要每隔2～3 d澆水1次，隔7 d澆灌100 mL/盆 Hoagland營養(yǎng)液，保證幼苗正常生長。為了排除薊馬及其他害蟲，將紫花苜蓿幼苗保護(hù)在覆蓋有60目防蟲網(wǎng)的網(wǎng)室中。紫花苜蓿生長45 d后，開始接入薊馬成蟲進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)處理中3個(gè)品種隨機(jī)擺放，每個(gè)品種4盆，相鄰處理間的間距為50 cm，重復(fù)3次。紫花苜蓿每個(gè)枝條分別接種4頭、5頭、6頭薊馬成蟲，每個(gè)處理單獨(dú)用60目防蟲網(wǎng)罩住以防薊馬逃逸，對照組不接蟲（CK），也罩上防蟲網(wǎng)。由于薊馬體長1.5 mm或更小，接蟲時(shí)盡量避免對薊馬的傷害。薊馬為害5 d后隨機(jī)收集紫花苜蓿植株的葉片，迅速置于液氮中冷凍20 min，然后保存于超低溫-80 ℃冰箱中，每個(gè)處理重復(fù)3次，用于測定次生代謝物含量、防御酶活性等。

1.3 測定指標(biāo)

次生代謝物含量測定：黃酮含量采用亞硝酸鈉—硝酸鋁比色法測定［27］；單寧和木質(zhì)素含量采用蘇州格銳思試劑盒測定。

防御酶活性測定：過氧化物酶活性參照鄒琦［28］的方法，采用愈創(chuàng)木酚法測定；苯丙氨酸解氨酶參照參考劉佳［29］方法測定；多酚氧化酶采用蘇州格銳思試劑盒測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2016整理數(shù)據(jù)并作圖，采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 薊馬取食誘導(dǎo)對不同抗薊馬性紫花苜蓿品種次生代謝物的影響

隨著薊馬頭數(shù)的增加，甘農(nóng)9號的黃酮含量呈上升趨勢，而甘農(nóng)3號和WL363HQ的黃酮含量呈先增后減的變化趨勢（圖1）。薊馬取食誘導(dǎo)顯著增加了供試紫花苜蓿品種的黃酮含量（P＜0.05），甘農(nóng)9號的黃酮含量較CK分別提高了1.03%，2.86%，6.89%；甘農(nóng)3號的黃酮含量較CK分別提高了4.16%，6.47%，5.71%；WL363HQ的黃酮含量較CK分別增加了3.09%，5.15%，4.17%。在6頭/枝條處理下甘農(nóng)9號的黃酮含量顯著高于甘農(nóng)3號和WL363HQ（P＜0.05），增幅分別為1.79%，2.13%。在4、5頭/枝條處理下，供試紫化苜蓿品種的黃酮含量差異不顯著。

圖1 薊馬取食誘導(dǎo)后紫花苜蓿品種的黃酮含量Fig.1 The flavonoids contents of alfalfa cultivars after infecting by thrips

薊馬取食誘導(dǎo)顯著增加了供試苜蓿品種的單寧含量（P＜0.05）（圖2）。與CK相比，4頭/枝條處理下甘農(nóng)9號、甘農(nóng)3號和WL363HQ的單寧含量增幅分別為74.18%，28.22%，35.18%，表明薊馬取食脅迫后甘農(nóng)9號的單寧含量變化較甘農(nóng)3號和WL363HQ敏感。甘農(nóng)9號的單寧含量在5頭/枝條處理下達(dá)最高（2.23 mg/g），較CK顯著提高了83.75%；而甘農(nóng)3號和WL363HQ的單寧含量均在4頭/枝條處理下增至最高。相同薊馬頭數(shù)取食誘導(dǎo)處理下甘農(nóng)9號的單寧含量均顯著高于甘農(nóng)3號和WL363HQ（P＜0.05），較甘農(nóng)3號提高了31.28%，53.49%，47.70%；較WL363HQ增加了34.06%，71.52%，58.60%。

圖2 薊馬取食誘導(dǎo)后紫花苜蓿品種的單寧含量Fig.2 The tannin contents of alfalfa cultivars after infecting by thrips

薊馬取食誘導(dǎo)后供試苜蓿品種的木質(zhì)素含量變化與單寧相似，均呈先增后減的變化趨勢，且顯著高于CK（P＜0.05）（圖3）。與CK相比，甘農(nóng)9號的木質(zhì)素含量顯著增加了16.14%，21.72%，18.16%；甘農(nóng)3號的木質(zhì)素含量顯著提高了18.01%，15.90%，11.94%；WL363HQ的木質(zhì)素含量增幅分別為16.45%，19.83%，15.82%（P＜0.05）。5、6頭/枝條處理下，甘農(nóng)9號的木質(zhì)素含量顯著高于甘農(nóng)3號和WL363HQ（P＜0.05），較甘農(nóng)3號和WL363HQ分別增加了5.60%，3.50%；6.13%，3.96%，但甘農(nóng)3號和WL363HQ的木質(zhì)素含量未達(dá)顯著差異。

圖3 薊馬取食誘導(dǎo)后紫花苜蓿品種的木質(zhì)素含量Fig.3 The lignin contents of alfalfa cultivars after infecting by thrips

2.2 薊馬取食誘導(dǎo)對不同抗薊馬苜蓿品種防御酶活性的影響

甘農(nóng)9號、甘農(nóng)3號和WL363HQ的POD活性隨著薊馬頭數(shù)的增加呈上升趨勢，且顯著高于CK（P＜0.05）（圖4）。與CK相比，薊馬取食誘導(dǎo)后甘農(nóng)9號的POD活性增幅分別為3.44%，14.42%，28.76%；甘農(nóng)3號的POD活性增幅分別為10.91%，15.09%，26.32%；WL363HQ的POD活性增幅分別為12.24%，13.99%，26.74%（P＜0.05）。相同薊馬頭數(shù)處理下供試苜蓿品種的POD活性存在顯著差異（P＜0.05）。WL363HQ的POD活性在4頭/枝條處理下較甘農(nóng)9號和甘農(nóng)3號分別顯著提高7.47%，3.44%；而5和6頭/枝條處理下甘農(nóng)9號的POD活性較甘農(nóng)3號和WL363HQ分別顯著增加2.60%，1.36%；5.19%，2.58%（P＜0.05）。

圖4 薊馬取食誘導(dǎo)后紫花苜蓿品種的POD活性Fig.4 POD activities of alfalfa cultivars after infecting by thrips

隨著薊馬頭數(shù)的增加，甘農(nóng)9號的PAL活性呈持續(xù)上升趨勢，甘農(nóng)3號和WL363HQ的PAL活性呈先升后降的變化趨勢（圖5）。與CK相比，薊馬取食誘導(dǎo)顯著提高了供試苜蓿品種的PAL活性（P＜0.05），甘農(nóng)9號PAL活性的增幅分別為16.40%，22.12%，26.37%；甘農(nóng)3號PAL活性的增幅分別為8.99%，31.60%，25.88%；WL363HQ的PAL活性增幅分別為6.98%，14.94%，10.77%。4、5和6頭/枝條處理下甘農(nóng)9號的PAL活性均顯著高于甘農(nóng)3號和WL363HQ（P＜0.05），較 甘 農(nóng)3號 分 別 提 高 了16.35%，1.09%，9.36%；較WL363HQ分別增加了6.04%，3.54%，11.18%（P＜0.05）。

圖5 薊馬取食誘導(dǎo)后紫花苜蓿品種的PAL活性Fig.5 PAL activities of alfalfa cultivars after infecting by thrips

供試苜蓿品種的PPO活性隨薊馬頭數(shù)的增加均呈下降趨勢，且顯著低于CK（P＜0.05）（圖6）。與CK相比，甘農(nóng)9號的PPO活性分別顯著降低了13.59%，22.63%，25.66%；甘農(nóng)3號的PPO活性分別顯著減少了12.63%，23.43%，24.58%；WL363HQ的PPO活性分別顯著下降了12.04%，16.87%，41.25%（P＜0.05）。4、5頭/枝條處理下WL363HQ的PPO活性較甘農(nóng)9號分別顯著增加了3.18%，8.91%，較甘農(nóng)3號分別顯著提高了5.49%，13.76%（P＜0.05）；而6頭/枝條處理下甘農(nóng)9號的PPO活性較甘農(nóng)3號和WL363HQ分別顯著提高了1.89%，24.84%（P＜0.05）。

圖6 薊馬取食誘導(dǎo)后紫花苜蓿品種的PPO活性Fig.6 PPO activities of alfalfa cultivars after infecting by thrips

3 討論

昆蟲取食誘導(dǎo)是植物防御系統(tǒng)啟動(dòng)的重要誘因。昆蟲口腔分泌物中的誘導(dǎo)子使植物對危害信號進(jìn)行識別，進(jìn)而啟動(dòng)防御系統(tǒng)產(chǎn)生誘導(dǎo)抗性，如通過 POD 、PAL、PPO及 LOX等多種防御酶的催化，誘導(dǎo)植物體內(nèi)酚類、生物堿、萜類等多種有毒次生代謝物質(zhì)的積累，從而直接或間接提高抗蟲能力［30-32］。酚類物質(zhì)是高等植物中普遍存在的次生代謝產(chǎn)物，其中黃酮是一類對昆蟲有毒的酚類物質(zhì)，可以影響昆蟲的取食，延緩昆蟲的生長發(fā)育，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致昆蟲中毒甚至死亡［33］。張華峰［34］研究表明隨著松墨天牛（Monochamus alternatus）為害程度的加劇，馬尾松（Pinus massoniana）針葉的黃酮含量呈先上升后下降的變化特點(diǎn)。馬榮金等［35］研究指出不同抗性黃瓜（Cucumis sativus）材料被蚜蟲侵染后，黃酮含量呈先增后減的變化趨勢。本研究發(fā)現(xiàn)抗薊馬苜蓿品種甘農(nóng)9號的黃酮含量呈上升趨勢且顯著高于CK，而感薊馬苜蓿品種甘農(nóng)3號和高感薊馬苜蓿品種WL363HQ的黃酮含量呈先升后降趨勢，說明甘農(nóng)9號合成的黃酮較甘農(nóng)3號和WL363HQ多，從而對薊馬的取食產(chǎn)生不利影響，抵御了薊馬為害，因此甘農(nóng)9號表現(xiàn)出良好的抗性。

單寧被認(rèn)為是一類有效的防御化合物，它主要干擾昆蟲的腸道消化、抑制多種消化酶的活性，破壞昆蟲的正常代謝，從而影響昆蟲對食物的利用［36-37］。賈彥霞等［38］研究指出5個(gè)辣椒品種葉片的單寧含量隨西花薊馬（F.occidentalis）取食誘導(dǎo)表現(xiàn)為先升后降的變化特點(diǎn)，抗性品種74-82和嬌龍的單寧含量顯著高于其他品種。本研究結(jié)果表明，薊馬取食誘導(dǎo)顯著提高了供試苜蓿品種的單寧含量，這與賈彥霞等［38］的研究結(jié)果一致，即抗薊馬品種甘農(nóng)9號的單寧含量顯著高于甘農(nóng)3號和WL363HQ。王小珊等［39］研究表明牛角花齒薊馬（O.loti）為害后，抗薊馬苜蓿R-1和感薊馬苜蓿I-1葉片的木質(zhì)素含量均升高，且R-1的木質(zhì)素含量增加率均高于I-1。蔡沖等［40］研究指出煙粉虱（Bemisia tabaci）脅迫9 h后番茄抗蟲品種（Hongshengnv，HSN）的葉片木質(zhì)素含量顯著高于感蟲品種（Huangshengguo，HSG）。在本研究中，薊馬取食誘導(dǎo)后，供試苜蓿品種的木質(zhì)素含量顯著增加，表明受害葉片細(xì)胞壁木質(zhì)化增加、機(jī)械組織增強(qiáng)。當(dāng)每枝條超過4頭薊馬時(shí)甘農(nóng)9號的木質(zhì)素含量顯著高于甘農(nóng)3號和WL363HQ，這與王小珊等［39］和蔡沖等［40］的研究結(jié)果一致。本研究說明薊馬取食誘導(dǎo)可誘導(dǎo)苜蓿葉片中黃酮、單寧和木質(zhì)素含量增加，該結(jié)果為進(jìn)一步揭示寄主植物苜蓿與薊馬之間的防御機(jī)制提供了基礎(chǔ)。

過氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）和多酚氧化酶（PPO）是植物在生物脅迫和非生物脅迫的防御酶，POD參與木質(zhì)素的合成，PAL參與黃酮、單寧和木質(zhì)素等的合成和積累，PPO可促進(jìn)多酚的合成［41-43］。He等［44］研究發(fā)現(xiàn)在接種蚜蟲的早期，菊花（Dendranthema morifolium）3個(gè)品種通過提高PAL和PPO活性來對蚜害做出快速響應(yīng)。沈登榮等［45］研究表明端大薊馬（Megalurothrips distalis）取食脅迫顯著提 高 了 菜 豆（Phaseolus vulgaris）、豇 豆（Vigna unguiculata）和蠶豆（Vicia faba）的POD活性。本研究發(fā)現(xiàn)薊馬取食誘導(dǎo)后不同抗薊馬苜蓿品種的POD和PAL活性顯著上升，而PPO活性顯著下降。此外，當(dāng)薊馬頭數(shù)超過4頭/枝條時(shí)，抗薊馬苜蓿品種甘農(nóng)9號的POD和PAL活性顯著高于感薊馬苜蓿品種甘農(nóng)3號和高感薊馬苜蓿品種WL363HQ，說明隨著薊馬為害程度的加劇，POD和PAL活性增強(qiáng)可誘導(dǎo)木質(zhì)素、黃酮的大量合成，有助于提高甘農(nóng)9號的抗性。然而，植物誘導(dǎo)型防御是一個(gè)復(fù)雜的過程，從植物誘導(dǎo)防御的整體性和系統(tǒng)性方面考慮，薊馬對誘導(dǎo)次生代謝物質(zhì)的代謝通路有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

隨薊馬頭數(shù)的增加，甘農(nóng)9號的黃酮含量、POD和PAL活性呈持續(xù)增加趨勢，單寧和木質(zhì)素含量呈先升后減的趨勢，PPO活性呈下降趨勢；而甘農(nóng)3號和WL363HQ的POD和PAL活性呈上升趨勢，黃酮、單寧和木質(zhì)素含量均呈先增后減的變化特點(diǎn)，PPO活性不斷下降。此外，5和6頭/枝條處理下甘農(nóng)9號的單寧、木質(zhì)素含量和POD、PAL活性均顯著高于甘農(nóng)3號和WL363HQ，因而甘農(nóng)9號表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗性。