O2/CO2主動自發(fā)氣調(diào)對采后松露貯藏品質(zhì)及微觀結(jié)構(gòu)的影響

蔣方國

胡海洋1

龔曉源1

劉 杰2

李 翔1

(1. 成都大學(xué)食品與生物工程學(xué)院, 四川 成都 610106；2. 重慶建設(shè)汽車系統(tǒng)股份有限公司，重慶 400054)

松露是塊菌屬真菌的子囊果，在土壤或落葉層中與植物根系共生，富含蛋白質(zhì)、維生素、脂肪酸等營養(yǎng)物質(zhì)[1]，并含有具有緩解疲勞、抑制癌細(xì)胞、調(diào)節(jié)女性生理周期等功能的多糖、α-雄烷醇及甾醇類等多種生理活性物質(zhì)[2-4]。由于其獨特且濃郁的香氣備受消費者青睞，歐洲人將其盛贊為“王公貴族之珍饈”[5]。然而，短暫的采收期和保質(zhì)期限制了其市場的向外擴張[6]。松露采后會因機械損傷、環(huán)境脅迫、微生物浸染導(dǎo)致的呼吸作用加劇而極易腐敗變質(zhì)，其腐敗產(chǎn)生的乳酸和乙醇雖然可以保護松露免受表面霉菌和細(xì)菌的侵害，但有香氣變化的潛在風(fēng)險[7]。目前國內(nèi)外多采用氣調(diào)、輻照、保鮮劑等技術(shù)對果蔬進(jìn)行保鮮[8]，但一些化學(xué)保鮮劑具有環(huán)境污染和毒副性[9]；輻照雖能殺滅病原微生物，抑制果蔬的某些代謝活動，保留原有營養(yǎng)和風(fēng)味物質(zhì)，但存在效果不顯著甚至加快果實衰老以及使用劑量的安全性問題[10-12]。

主動自發(fā)氣調(diào)(AMAP)是指通過控制密閉環(huán)境中的氣體成分，利用果蔬自身呼吸從而達(dá)到有利于保鮮目的的氣體環(huán)境的方法[13]。王亮等[14]發(fā)現(xiàn)50% O2+50% CO2AMAP可有效調(diào)節(jié)西蘭花體內(nèi)pH值和呼吸關(guān)鍵酶活性，形成穩(wěn)定的能量代謝，從而維持西蘭花貯藏品質(zhì)。黃雪等[15]采用O2/CO2AMAP處理羊肚菌，貯藏第8天，100% O2處理易造成內(nèi)部白斑，而過高的CO2處理則易出現(xiàn)白化和異味現(xiàn)象。Liu等[16]研究表明80% O2能防止香菇褐變，延緩膜透性和脂質(zhì)過氧化的增加，并能增強抗氧化和氧自由基清除酶的活性。Fagundes等[17]表明櫻桃番茄在AMAP協(xié)同5 ℃條件貯藏，由于CO2和O2的作用，降低了呼吸速率和乙烯的產(chǎn)生，維持組織硬度，并抑制了如糖類、有機酸、番茄紅素等物質(zhì)的化學(xué)反應(yīng)，使櫻桃番茄的衰老得到了有效控制。目前，有關(guān)松露在O2/CO2AMAP中保鮮性能的研究還未見報道。試驗擬探究松露在不同初始比例的O2/CO2氣體密閉環(huán)境中的貯藏品質(zhì)和微觀結(jié)構(gòu)，以期得到一種新型而有效的松露鮮貯方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

松露子實體：采摘于攀枝花市，采后立即置于冰袋低溫盒中運回成都大學(xué)實驗室，短時內(nèi)用濕潤軟毛刷去污、清水沖洗后摘除成熟度低、質(zhì)地軟化、寄生或者損傷嚴(yán)重的個體，于層流空氣中干燥，4 ℃預(yù)冷12 h后選擇質(zhì)量與成熟度相近的松露進(jìn)行試驗，四川品高農(nóng)產(chǎn)有限公司；

三氯乙酸(TCA)、硫代巴比妥酸(TBA)、2,6-二氯靛酚、福林酚、戊二醛、醋酸異戊酯、鄰苯二酚：分析純，成都科隆化學(xué)品有限公司；

食品級PP保鮮盒：220 mm×130 mm×40 mm，重20 g，諸城市萬瑞塑膠有限公司；

密閉不透氣雙層PE薄膜：單層厚0.02 mm，深圳市匯豐包裝科技有限公司；

吸潮紙：昆明大道生包裝材料有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

紫外分光光度計：UV-8000型，上海精密儀器儀表有限公司；

臺式高速冷凍離心機：BY-R20型，北京白洋醫(yī)療器械有限公司；

氣調(diào)包裝機：MAP-JY260型，上海積億機械有限公司；

電導(dǎo)率儀：DDS-307A型，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；

掃描電子顯微鏡：Phenom XL G2型，復(fù)納科學(xué)儀器(上海)有限公司；

硬度計：GY-3型，上海玖榮實業(yè)有限公司；

手持糖度計：WYT-32型，上海易測儀器設(shè)備有限公司。

1.2 試驗設(shè)計

將預(yù)冷完成的松露隨機分為4個氣調(diào)組和1個自然空氣(CK)組，每組5個氣調(diào)保鮮盒，各放入(300±5.00) g樣品，裝載量為1/4，保鮮盒底部墊一層吸潮紙，利用氣調(diào)包裝機按表1將氣體分別充入各保鮮盒，用雙層PE薄膜封口，CK陳放于空氣中，不封口。抽氣時間4.00 s；充氣時間4.00 s；熱封時間2.00 s；熱封溫度152 ℃。于4 ℃、相對濕度為90%～95%冷庫中貯藏，每7 d取樣1次，各相關(guān)指標(biāo)重復(fù)測定3次取平均值。

表1 氣體組分比例Table 1 Radio of gas content %

1.3 相關(guān)指標(biāo)測定

1.3.1 失重率 按式(1)計算松露的失重率[18]。

(1)

式中：

W——失重率，%；

M1——松露貯藏前質(zhì)量，g；

M2——松露貯藏后質(zhì)量，g。

1.3.2 可溶性固形物含量 取10 g松露于研缽，待充分研磨后用4層紗布過濾，使用手持糖度計測定可溶性固形物的百分比含量。

1.3.3 腐爛率 將軟化、霉變、發(fā)黏及異味等現(xiàn)象作為松露腐爛的指示標(biāo)準(zhǔn)，按式(2)計算腐爛率。

(2)

式中：

D——腐爛率，%；

X1——腐爛個數(shù)；

X2——處理總數(shù)。

1.3.4 維生素C含量 按GB 5009.86—2016執(zhí)行。

1.3.5 呼吸速率 參照Ye等[19]的方法。

1.3.6 丙二醛(MDA)含量 參照Yang等[20]的方法。

1.3.7 纖維素(Cx)酶活性

(1) 酶液制取：精確稱取5.000 g松露，剪碎后置于預(yù)冷的研缽中，加入適量磷酸緩沖液研磨均勻后定容，4 000 r/min 離心20 min，上清液于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2) Cx酶活性：參照劉德海等[21]的方法并稍改動，將酶液稀釋10倍待用，取6只10 mL帶塞試管，5只樣品管中加入2 mL CMC溶液，50 ℃預(yù)熱3 min，加入0.5 mL稀釋酶液，50 ℃保溫30 min。待保溫快結(jié)束時取空白管先后加入2 mL CMC溶液和2.5 mL DNS溶液。保溫結(jié)束后向各樣品管中加入2.5 mL DNS溶液并向空白管中加入0.5 mL酶液，沸水浴8 min，冷卻后空白調(diào)零測OD530 nm值。

1.3.8 多酚氧化酶(PPO)活性 參照張菊華等[22]的方法。

1.3.9 掃描電鏡 松露去皮后切成4 mm×4 mm×3 mm 小片，4 ℃下、5%戊二醛固定2 h，用0.1 mol/L磷酸緩沖液沖洗浸泡10 min，重復(fù)操作3次，分別用30%，50%，70%乙醇脫水20 min，用80%，90%，100%乙醇脫水10 min。醋酸異戊酯代替100%乙醇溶液脫水10 min，將試樣取出進(jìn)行CO2臨界點干燥以及離子濺射噴金處理，于掃描電子顯微鏡下觀察。

1.3.10 數(shù)據(jù)處理 所有試驗數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS軟件進(jìn)行顯著性差異分析(P<0.05為差異顯著)，采用Excel 2016軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 對失重率及可溶性固形物含量的影響

由圖1(a)可知，貯藏期間，各處理組的失重率均呈上升趨勢，但AMAP4處理的失重最為嚴(yán)重，貯藏7 d后失重率高于CK處理，可能是隨著呼吸作用的進(jìn)行，蒸騰失水的同時，氣調(diào)包裝中氧氣被快速利用，CO2含量過高致使產(chǎn)生無氧呼吸而造成有機物被過多消耗而導(dǎo)致失重率急劇上升。而其他處理的失重率在整個貯藏期間明顯(P<0.05)低于CK和AMAP4處理，且AMAP1與AMAP2處理相差不明顯，而AMAP3處理在貯藏后期才顯示出一定優(yōu)勢，更適合長期保鮮。

圖1 O2/CO2 AMAP對松露失重率及可溶性固形物含量的影響Figure 1 Effect of O2/CO2 AMAP on weight loss rate and soluble solid content of truffles

由圖1(b)可知，各處理組的可溶性固形物含量均呈先增后減的趨勢，其上升可能是貯藏期間松露的失水和子實體內(nèi)蛋白質(zhì)等大分子向可溶性小分子的轉(zhuǎn)化而導(dǎo)致的，而下降是因為呼吸作用[23]。貯藏期間，4個氣調(diào)組的可溶性固形物含量均顯著高于CK處理(P<0.05)，CK與AMAP4處理的在第7天達(dá)到峰值，后又呈快速下降的趨勢。其余3個處理在第14天達(dá)到峰值，可能與不同氣調(diào)處理影響各種物質(zhì)的活化速度有關(guān)，可以延長松露后熟時間，與員麗蘋等[24]的結(jié)果類似。AMAP3處理的可溶性固形物含量下降平緩且在第28天回落到初始水平，均高于其他4個處理組，說明AMAP3處理有助于降低松露對呼吸底物的消耗速率，從而減緩松露的衰老，保證其食用品質(zhì)。

2.2 對腐爛率的影響

由圖2可知，隨著貯藏時間的增加，各處理組的腐爛率均呈上升趨勢，松露從土壤中挖掘出后就一直暴露在空氣中，失水和病原菌使其變得高度易腐[7]。CK處理在貯藏7 d內(nèi)逐漸出現(xiàn)腐敗，而其他處理組在貯藏7 d后才發(fā)生腐爛且程度明顯低于CK處理，表明O2/CO2主動自發(fā)氣調(diào)在降低腐爛率上具有良好的效果。AMAP3處理的腐爛率最低，保鮮效果最好，表明一些病原微生物可能對AMAP3處理的氣體成分敏感。Hoogerwerf等[25]證實80% O2+20% CO2氣調(diào)處理可明顯抑制灰葡萄孢菌的生長。張玉笑等[26]研究表明O2/CO2主動自發(fā)氣調(diào)可更好地控制果蔬貯藏過程中枝孢菌的危害。

圖2 O2/CO2 AMAP對松露腐爛率的影響Figure 2 Effect of O2/CO2 AMAP on decayrate of truffles

2.3 對松露維生素C含量的影響

由圖3可知，貯藏期間，各處理組維生素C含量均呈下降趨勢，貯藏第7天，AMAP4處理的維生素C含量低于CK處理，且28 d內(nèi)的含量均顯著低于其他3個氣調(diào)組，說明高含量的O2有利于減緩松露維生素C的下降速度且效果明顯，對維持松露的營養(yǎng)價值具有重要作用，而10% O2氣調(diào)處理不僅難以保留松露維生素C含量甚至?xí)觿∑鋼p失，與車東等[27]、楊震峰等[28]的結(jié)論類似。

圖3 O2/CO2 AMAP對松露維生素C含量的影響Figure 3 Effect of O2/CO2 AMAP on VC contentof truffles

2.4 對松露呼吸速率的影響

由圖4可知，松露是一種呼吸躍變型果實，貯藏期間，除CK和AMAP3處理外，其余氣調(diào)組的呼吸速率大體呈“M”型波動。CK處理的呼吸高峰出現(xiàn)在貯藏第7天，而貯藏中、后期急劇下降，可能是因為腐爛程度過高使松露的呼吸系統(tǒng)受到嚴(yán)重破壞。AMAP1、AMAP2和AMAP4處理具有雙呼吸高峰，分別出現(xiàn)在貯藏第7，21天，而AMAP3處理的呼吸高峰只在貯藏第21天出現(xiàn)，且呼吸速率最低。CK處理的平均呼吸速率為205.60 mg/(kg·h)，其他處理的分別為223.58，250.73，187.81，196.69 mg/(kg·h)，AMAP3和AMAP4處理的呼吸作用受到明顯抑制，而AMAP3呼吸波動最弱，表現(xiàn)最好，說明合適的初始?xì)怏w比例形成適宜松露貯藏的微環(huán)境，推遲了呼吸高峰并降低了呼吸速率，維持了營養(yǎng)品質(zhì)。

圖4 O2/CO2 AMAP對松露呼吸速率的影響Figure 4 Effect of O2/CO2 AMAP on respiratoryrate of truffles

2.5 對松露MDA含量的影響

由圖5可知，除CK處理的MDA含量增加外，其余組均呈先增后降再增的趨勢，貯藏前期，MDA含量的升高可能是氣體脅迫導(dǎo)致松露組織產(chǎn)生大量的自由基，積累到一定程度后引起細(xì)胞膜脂過氧化，使膜的結(jié)構(gòu)和功能受到嚴(yán)重?fù)p害，同時生成MDA加重對蛋白質(zhì)、核酸及膜等大分子生物成分的攻擊，進(jìn)一步損傷細(xì)胞膜，增加其透過性[29]。隨后，松露的防御機制啟動，MDA被分解致使含量下降，但隨著自我修復(fù)功能的削弱，MDA又開始合成，含量逐步上升。貯藏第28天，AMAP2和AMAP3處理的MDA含量接近但與AMAP1、AMAP4處理的差異顯著。AMAP4處理的MDA含量最高為11.68 nmol/g，而AMAP3處理的最低為5.26 nmol/g，同時在整個貯藏期間都維持在較低水平，說明其氣體比例有效地降低了MDA的積累，與黃雪等[15]的結(jié)論一致。

圖5 O2/CO2 AMAP對松露MDA含量的影響Figure 5 Effect of O2/CO2 AMAP on MDAcontent of truffles

2.6 對松露Cx酶活性的影響

由圖6可知，貯藏期間，各處理組的Cx酶活性均不斷上升，4個氣調(diào)組的Cx酶活性顯著低于CK組(P<0.05)，且初始氧氣含量在40%及以上氣調(diào)處理的Cx酶活性整體上低于10% O2的，說明較高含量的O2可以更好地抑制松露的軟化。貯藏第28天，AMAP3處理的Cx酶活性最低，分別比AMAP1、AMAP2、AMAP4處理低11.39，15.15，19.50 U/g。因此，AMAP3處理相比較于CK和其他處理，更有效地降低了Cx酶活性，從而維持了松露的硬度。有研究[30]表明，雙孢蘑菇在貯藏后期由于纖維素酶活性升高加快纖維素分解，可能出現(xiàn)菌體自溶現(xiàn)象，而維持較低的纖維素酶活力可以保持良好的質(zhì)地。

圖6 O2/CO2 AMAP對松露Cx酶活性的影響Figure 6 Effect of O2/CO2 AMAP on Cxenzymeactivity of truffles

2.7 對松露PPO活性的影響

由圖7可知，貯藏第7天，4個氣調(diào)組氣體控制條件下松露的PPO活性均顯著高于CK處理的。當(dāng)松露所處的環(huán)境發(fā)生改變后，PPO作為松露體內(nèi)一種應(yīng)激性酶對其作出響應(yīng)，使得PPO活性被激活并在短時間內(nèi)提高從而開啟松露抵御外界傷害的自我保護機制。一旦松露適應(yīng)了這種脅迫，PPO活性將回到原狀態(tài)，故貯藏第14天的PPO活性出現(xiàn)了回降現(xiàn)象，之后，各處理組PPO活性又不斷上升，AMAP1、AMAP2及CK 3組上升迅速，其余2組上升緩慢，且AMAP3處理表現(xiàn)最佳，說明AMAP3處理在貯藏中、后期有效抑制了PPO活性，防止果實發(fā)生褐變。這可能是因為貯藏后期，呼吸產(chǎn)生的高濃度CO2形成了高壓CO2環(huán)境，而高壓CO2可能以改變PPO的三級結(jié)構(gòu)或干擾PPO的疏水活性位點的方式使其失活，從而減弱了PPO活性上升的趨勢[31]。

2.8 對松露微觀結(jié)構(gòu)的影響

由圖8可知，新鮮松露子囊果的子囊孢子壁外表光滑飽滿，相互之間呈致密分布，無凹陷和空洞。貯藏第14天，只有AMAP3處理的子囊孢子壁仍能保持完整飽滿且致密的結(jié)構(gòu)，分布也較為均勻，子囊之間空隙小，說明其有效保留了水分，細(xì)胞壁受損程度低，有利于維持松露正常的生理活動；CK和AMAP4處理因失水過度導(dǎo)致子囊嚴(yán)重干癟，而AMAP1和AMAP2處理的子囊之間黏連在一塊，各子囊的形狀無法清晰分辨出。貯藏第28天，各處理組的子囊均出現(xiàn)一定程度的剝離和皺縮，形成空洞，但CK處理的剝離最為嚴(yán)重，子囊相互之間間隙最大，而AMAP3處理也有空洞和皺縮出現(xiàn)，但程度相對最淺，說明適宜氣調(diào)處理的松露可有效減少質(zhì)量損失，通過維持細(xì)胞的正常形態(tài)進(jìn)而減弱MDA、PPO以及Cx酶等對組織的損傷，與朱繼英等[32]、Wu等[33]的結(jié)論類似。

圖8 O2/CO2 AMAP對松露微觀結(jié)構(gòu)的影響Figure 8 Effect of O2/CO2 AMAP on microstructureof truffles

3 結(jié)論

試驗表明，松露具有呼吸躍變特性，40% O2+60% CO2處理可將呼吸高峰推遲至第21天，有效減緩營養(yǎng)物質(zhì)的損失，并將松露貨架期延長至4周。40% O2+60% CO2處理能夠保持松露子囊較為飽滿的狀態(tài)，降低纖維素酶和丙二醛對細(xì)胞壁膜的破壞，維持正常的生理活動，有利于松露保鮮。這是由于40% O2+60% CO2處理的氣體比例結(jié)合低溫形成的微環(huán)境可使松露的新陳代謝快速到達(dá)平衡，保持低能耗狀態(tài)，高含量的O2可直接抑制厭氧菌的生長繁殖并且緩解CO2的侵害，減少腐爛。后續(xù)可進(jìn)一步優(yōu)化不同初始?xì)怏w比例的保鮮性能，并深入研究O2/CO2主動自發(fā)氣調(diào)保鮮松露的具體機制。