面包酵母自交提升耐高糖發(fā)酵力的研究

孫雅芳，王 龍，郭天芬，陳莉婷，覃先武*

（安琪酵母股份有限公司 酵母功能湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 宜昌 443000）

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）因其具有容易培養(yǎng)、清潔安全和有高經(jīng)濟(jì)價(jià)值代謝產(chǎn)物等優(yōu)點(diǎn)，一直以來都是生物工業(yè)發(fā)展的主力軍[1-2]。其在工業(yè)上的食品應(yīng)用、醫(yī)學(xué)研究、環(huán)境保護(hù)以及能源開發(fā)等領(lǐng)域?yàn)槿祟愖龀隽酥匾呢暙I(xiàn)[3-5]，無論是提升發(fā)酵率，提高發(fā)酵乙醇產(chǎn)量和質(zhì)量還是提升發(fā)酵活力和保存率等，都是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。目前，提升酵母特性的遺傳操作策略很多，主要包括隨機(jī)誘變、進(jìn)化工程、代謝工程和雜交育種等[6-9]。而雜交育種無論在方向性還是自覺性方面，比誘變和進(jìn)化都前進(jìn)了一大步。不僅可消除某一菌株在經(jīng)過長期誘變后所出現(xiàn)的產(chǎn)量上升緩慢的現(xiàn)象，而且因模擬自然選擇的過程，克服了生物基因改造在商業(yè)應(yīng)用中的難題[10]。

在雜交育種中，近交與人工選擇相結(jié)合一直是提高優(yōu)勢的重要手段之一[11-12]，近交的優(yōu)勢在于促使等位基因純合、保持優(yōu)良個(gè)體血統(tǒng)、提高群體同質(zhì)性等[13]，我國的水稻、小麥、棉花等作物采取這樣的連續(xù)選擇，已先后育成許多新的優(yōu)良品種[14-16]。但同時(shí)近交衰退現(xiàn)象也會有所體現(xiàn)，因此把握應(yīng)用時(shí)機(jī)、防止近交衰退發(fā)生能更充分的發(fā)揮近交的有利功能。

對于釀酒酵母而言，從四分體分析入手，能更清楚的了解控制目標(biāo)性狀等位基因的分離情況[17]，有目的的雜交能更加有效的獲取提升性狀的菌株，提高雜交效率。

面包酵母的耐高糖發(fā)酵力是一種在工業(yè)中受到高度關(guān)注的特性，其機(jī)理較為復(fù)雜，涉及蔗糖酶活力[18]、耐高滲能力[19]和糖酵解的多方面因素。本實(shí)驗(yàn)從四分體分析出發(fā)，以利用工業(yè)面包酵母BH3自交來提升其耐高糖發(fā)酵力為例驗(yàn)證方法，探討復(fù)雜基因控制性狀下工業(yè)酵母菌開發(fā)的研究思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

工業(yè)耐高糖面包酵母BH3：保藏于安琪酵母菌種研究室。

面粉（小麥粉）：河北五得利面粉集團(tuán)有限公司；10%蝸牛酶（酶活0.5 U/μL）：華東醫(yī)藥公司；2×Taq聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）Mastermix（0.1 U/μL）：天根生化科技有限公司。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：酵母膏10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L。

YPD固體培養(yǎng)基：YPD液體培養(yǎng)基加入2%瓊脂。

菌體收集搖瓶培養(yǎng)基：酵母膏20 g/L，蔗糖100 g/L，磷酸氫二鉀1 g/L，七水硫酸鎂1 g/L，pH4.7～4.9，每瓶培養(yǎng)基300 mL。

孢前培養(yǎng)基：酵母膏8 g/L，蛋白胨3 g/L，葡萄糖100 g/L，瓊脂20 g/L。

產(chǎn)孢培養(yǎng)基：醋酸鉀10 g/L，酵母膏1 g/L，葡萄糖0.5 g/L，瓊脂20 g/L。

以上培養(yǎng)基均在121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

ZWYR-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；LXJ-IIB低速大容量多管離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；SPX-II300生化培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；Risograph酵母活性產(chǎn)氣測定儀：美國National Mfg公司；MSM400酵母顯微操作工作站：英國Singer instrument公司；DYY6C凝膠電泳系統(tǒng)、GelDocXR+凝膠成像系統(tǒng)：美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母產(chǎn)孢

將親本菌株BH3接種于孢前培養(yǎng)基1 d，用來儲備營養(yǎng)。然后將長出的菌體刮下轉(zhuǎn)移到產(chǎn)孢培養(yǎng)基于22 ℃恒溫培養(yǎng)5 d左右，待其產(chǎn)生較多的四分體。

1.3.2 有性孢子的分離

于產(chǎn)孢培養(yǎng)基取適量菌體置于100 μL的無菌水中，加入20 μL的10%蝸牛酶（終含量2%），37 ℃水浴15 min后立即放置冰上，終止酶解。將菌液適量稀釋后滴加到Y(jié)PD固體培養(yǎng)基，置于顯微操作儀上，用微針解剖子囊，將同一子囊的4個(gè)孢子在YPD固體培養(yǎng)基上排成一列并做好標(biāo)記。

1.3.3 孢子接合型鑒定

使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測孢子MAT基因型[20]。挑取其單菌落作為脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）模板，根據(jù)GenBank中釀酒酵母性別決定的MAT-a和MAT-α基因座及附近基因序列設(shè)計(jì)3條引物：MAT-F：5'-AGTCACATCAAGATCGTTTATGG-3'是位于MAT基因座右側(cè)的序列；MAT-α：5'-GCACGGAATATGGGACTACTTCG-3'是位于MAT-α和HML-α之間的序列；MAT-a：5'-ACTCCACTTCAAGTAAGAGTTTG-3'是位于MAT-a和HMR-a之間的序列。

PCR擴(kuò)增體系：25 μL PCR體系中加入適量細(xì)胞，三種引物各1 μL，2×TaqPCR MasterMix預(yù)混液12.5 μL和雙蒸水（ddH2O）7.5 μL進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性45 s，55 ℃復(fù)性60 s，72 ℃延伸70 s，32個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

1.3.4 單倍體交配

a型和α型的單倍體經(jīng)過YPD培養(yǎng)基培養(yǎng)后，各取5 mL加入50 mL YPD培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)箱中30 ℃靜置培養(yǎng)，期間觀察啞鈴型結(jié)合子的形成和細(xì)胞的凝集狀況，靜置4～6 h后用無菌水稀釋混合菌液至適宜倍數(shù)，滴加在YPD固體培養(yǎng)基，使用顯微操作儀挑取“啞鈴”狀長出了接合管的酵母細(xì)胞，作為疑似雜合子，待其于30 ℃在YPD固體培養(yǎng)基上長出菌落，用步驟1.3.3所述方法進(jìn)行鑒定。

1.3.5 酵母的培養(yǎng)與生物量測定

將單倍體及雜合子接種于5 mL YPD培養(yǎng)基中，在30 ℃條件下180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)16 h，然后以1%的接種量接種于菌體收集搖瓶培養(yǎng)基，在30 ℃條件下180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)20 h。5 000 r/min離心5 min收集酵母，計(jì)算其生物量，以濕質(zhì)量計(jì)。

1.3.6 耐高糖發(fā)酵力性能的測定

對單倍體及雜合子進(jìn)行耐高糖發(fā)酵力評估，選擇面團(tuán)實(shí)驗(yàn)對酵母進(jìn)行發(fā)酵力測定，面團(tuán)實(shí)驗(yàn)方法如下：稱取280.0 g小麥粉倒入和面機(jī)，另稱取1%氯化鈉和16%白砂糖至一干凈三角瓶，加入120 mL蒸餾水溶解。按面粉1%干酵母的使用量稱取收集的酵母，與上述糖鹽水混勻后倒入和面機(jī)中，混合攪拌5 min，面團(tuán)溫度控制在30 ℃立即放入Risogragh產(chǎn)氣儀測定其120 min的產(chǎn)氣總量（mL，30 ℃、760 mm Hg條件下）。

2 結(jié)果與分析

2.1 單倍體菌株制備

由圖1A可知，親本菌株BH3在產(chǎn)孢培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d后，產(chǎn)生許多孢子，其中產(chǎn)生了4個(gè)孢子的菌體被稱為四分體。由圖1B可知，用蝸牛酶對四分體進(jìn)行破壁處理，使用顯微操作儀挑出孢子，有序排列，培養(yǎng)24 h，單倍體即可長成菌落。由圖1C可知，1號單倍體在404 bp處有條帶，為MAT-α型，2號、3號單倍體在544 bp處有條帶，為MAT-a型，經(jīng)過鑒定后，確認(rèn)獲得51株MAT-a型單倍體和51株MAT-α型單倍體共102株單倍體。

圖1 單倍體菌株制備Fig.1 Preparation of haploid strain

2.2 四分體特性分析

在得到孢子后，首先對孢子群體進(jìn)行分析，一般可以采取隨機(jī)孢子分析法[21]或者四分體分析法。本研究在顯微操作儀下進(jìn)行四分體分析，即在得到完整的子囊孢子分離株后，進(jìn)行接合型檢測和性狀分析。一組四分體包含了親本所有基因，對完整四分體中單倍體進(jìn)行分析，能判斷基因的連鎖和性狀的顯隱性分離，還有助于實(shí)現(xiàn)目標(biāo)性狀的基因定位。

2.2.1 單倍體生物量分析

對所有單倍體搖瓶富集，統(tǒng)計(jì)其生物量，其中有21組完整的四分體孢子，共計(jì)84個(gè)單倍體，將生物量高于生物量平均值（50.61 g/L）的單倍體稱為較高生物量單倍體，記為（+）；低于這個(gè)數(shù)值的單倍體稱為較低生物量單倍體，記為（-）。單倍體生物量與生物量平均值的絕對偏差見表1，（+）標(biāo)記數(shù)值為正值，（-）標(biāo)記數(shù)值為負(fù)值。

表1 單倍體生物量分析Table 1 Analysis of haploid biomass

由表2可知，較高生物量單倍體40個(gè)，占比47.6%；較低生物量單倍體44個(gè)，占比52.4%。在大多數(shù)四分體組中，生物量性狀（+）與（-）分離呈現(xiàn)2∶2的比例，因此如果子囊數(shù)2∶2的比例居多，可以初步判斷是一對等位基因的分離造成的。雖不能證明在此酵母中生物量僅有一對等位基因控制，但可以看出控制生物量的主基因在四分體中的分離情況，并且這個(gè)基因在BH3酵母中是雜合的。

酵母接合型是由第III條染色體MAT基因座上的等位基因MATa和MATα所控制的，在菌株BH3的四分體中，a型與α型的比例是2∶2正常分離的，與生物量性狀結(jié)合來看，a（+）∶a（-）∶α（+）∶α（-）=33∶9∶7∶35，因此對其分配進(jìn)行卡方檢驗(yàn)[22]，χ2用于衡量實(shí)際值與理論值的差異程度，結(jié)果見表2。

表2 卡方檢驗(yàn)基因連鎖Table 2 Gene linkage of Chi-square test

由表3可知，這兩對基因各自的分離都符合1∶1分離比率，但從總χ2來看，這兩對基因的傳遞規(guī)律不符合獨(dú)立遺傳，說明他們之間存在連鎖關(guān)系?？梢耘袛嗫刂粕锪啃誀畹闹餍Щ蚺cMAT基因是連鎖的，其中MATa與控制較高生物量的主效基因連鎖，MATα與控制較低生物量的主效基因連鎖，這兩對基因的交換值也就是其重組頻率為重組單倍體占總單倍體比例即（9+7）/84=19%。全部單倍體生物量分布見圖2。

圖2 單倍體生物量Fig.2 Biomass of haploid

由圖2可知，親本生物量水平為（55.27±0.11）g/L，略高于單倍體生物量均值（50.61 g/L），單倍體的生物量分離體現(xiàn)出控制生物量性狀的等位基因的不完全顯性。

2.2.2 單倍體耐高糖發(fā)酵力分析

對102株單倍體進(jìn)行面團(tuán)的發(fā)酵力測試，先對21組四分體進(jìn)行分析。用與生物量同樣的分析方法，耐高糖發(fā)酵力比均值（610.13 mL）高的單倍體記為（+），耐高糖發(fā)酵力比均值低的單倍體記為（-）。單倍體耐高糖發(fā)酵力與其均值的絕對偏差如表3所示，（+）標(biāo)記數(shù)值為正值，（-）標(biāo)記數(shù)值為負(fù)值，同表1。

表3 單倍體耐高糖發(fā)酵力分析Table 3 Analysis of fermentation activity of haploid with high sugar tolerance

由表3可知，統(tǒng)計(jì)得到較高發(fā)酵力單倍體43個(gè)，占比51.2%；較低生物量單倍體41個(gè)，占比48.8%?？刂破淠透咛前l(fā)酵力的主效基因分離情況與生物量的分離類似，四分體內(nèi)大多也呈現(xiàn)了“兩高兩低”這種2∶2的分離比例。與a/α這對等位基因結(jié)合來看，a（+）∶a（-）∶α（+）∶α（-）=26∶16∶17∶25，同樣進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，結(jié)果如表4所示。

表4 卡方檢驗(yàn)基因連鎖結(jié)果Table 4 Gene linkage results of Chi-square test

由表4可知，控制耐高糖發(fā)酵力的主要基因也是按照1∶1正常分離的，從總χ2來看這對基因和MATa/α之間的連鎖可能性較低。單倍體的耐高糖發(fā)酵力分布如圖3所示。

圖3 單倍體耐高糖發(fā)酵力Fig.3 Fermentation activity of haploid with high sugar tolerance

由圖3可知，與親本菌株比較，這些單倍體的耐高糖發(fā)酵力都低于親本菌株，主要原因可能是由于單倍體與雙倍體本身區(qū)別。有人猜測，通過將能量匯集到基因的復(fù)制和蛋白質(zhì)合成，而不是細(xì)胞分裂和膜的合成，多倍體增加了組織的新陳代謝能力[23]，相反由于單倍體酵母菌株較低的熱穩(wěn)定性，對酸、堿、乙醇和其他抑制劑的耐受能力都很低[24-25]。雖然所有的單倍體發(fā)酵活力都低于親本，但將有優(yōu)勢的單倍體進(jìn)行交配是有意義的。

此菌株的單倍體后代在生物量和耐高糖發(fā)酵力上出現(xiàn)了性狀分離，在四分體中優(yōu)劣性狀大多呈現(xiàn)了2∶2的比例分配，推測這些性狀分離是由于等位基因的分離，說明BH3這株菌在這兩對性狀上的主效QTL基因是雜合的。

2.3 選擇性交配提升耐高糖發(fā)酵力

從102株中優(yōu)選耐高糖發(fā)酵力良好的單倍體18株，以提升耐高糖發(fā)酵力為目的進(jìn)行配對交配，所選單倍體見表5。

表5 交配用單倍體選擇情況Table 5 Selection of haploid for mating

由表5可知，優(yōu)選耐高糖發(fā)酵力良好的單倍體18株中11株為a型，7株為α型；18株單倍體的生物量為33.43～73.39 g/L，發(fā)酵力為728.17～1 000.92 mL。雖然所有的單倍體發(fā)酵活力都低于親本，但通過大批量的單倍體篩選，優(yōu)選的單倍體體現(xiàn)了足夠的優(yōu)勢用于交配。

將這些不同配型的單倍體菌液按照不同的組合混合在液體YPD培養(yǎng)基中交配后，用顯微操作儀挑取如圖4A所示形態(tài)的細(xì)胞，待其長出菌落后，利用菌落PCR驗(yàn)證配型，產(chǎn)生如圖4B所示雙條帶，即成功得到了雜合子。

圖4 雜合子的挑取與鑒定Fig.4 Selection and identification of heterozygotes

利用以上單倍體共構(gòu)建27個(gè)交配組合，將得到的雜合子用同樣的方式測試耐高糖發(fā)酵力，結(jié)果見表6。

表6 雜合子的耐高糖發(fā)酵力測定結(jié)果Table 6 Determination results of fermentation activity with high sugar tolerance of heterozygous

由表6可知，有11個(gè)交配組合的新菌株的耐高糖發(fā)酵力達(dá)到親本水平及以上，最高能超過親本菌株16.73%，說明菌株BH3在純系育種上還有一定的上升空間。但是從其他自交組合二倍體的耐高糖發(fā)酵力可以看出，與親本相比有所減弱，這可能是近交衰退現(xiàn)象。

3 結(jié)論

酵母的雜交是非常經(jīng)典的遺傳育種方式，但現(xiàn)有研究中對酵母的雜交選育還有優(yōu)化空間。本研究著重于交配前的酵母四分體分析，分析基因連鎖和性狀分離情況，得出親本菌株BH3在生物量和耐高糖發(fā)酵力基因上是雜合的，主效應(yīng)QTL在四分體中呈現(xiàn)2∶2的基因分離比，其中生物量主效應(yīng)基因和MAT基因極大可能是連鎖遺傳的。在交配前的酵母四分體性狀與基因連鎖分析可以有效指導(dǎo)設(shè)計(jì)交配組合，更高效率得到優(yōu)勢性狀菌株。

雜交和人工選擇相結(jié)合是遺傳學(xué)上的經(jīng)典思路，本文以此為依據(jù)，利用工業(yè)高糖面包酵母BH3生孢自交來提升其耐高糖發(fā)酵力。制備了102株單倍體，優(yōu)選18株單倍體構(gòu)成27個(gè)組合進(jìn)行交配，最終得到11株耐高糖發(fā)酵力高于親本的新菌株，可以從中精選出用于純系品種選育的下一個(gè)世代親本。同時(shí)，即便進(jìn)行了單倍體優(yōu)選，依然有不少新菌株不如親本，這是近交衰退的表現(xiàn)。自交系進(jìn)行連續(xù)的純合選育，可進(jìn)一步促使性狀分離固定，開發(fā)更優(yōu)性狀工業(yè)酵母菌株。