葛 謙,王小麗,王云霞,吳 燕,閆 玥,4,張 靜,茍春林,趙丹青,李彩虹*
(1.寧夏農產(chǎn)品質量標準與檢測技術研究所,寧夏 銀川 750002;2.沙坡頭區(qū)農業(yè)技術推廣服務中心,寧夏 中衛(wèi) 755000;3.銀川市綠化養(yǎng)護管理站,寧夏 銀川 750002;4.寧夏回族自治區(qū)農產(chǎn)品質量標準研究與評價重點實驗室,寧夏 銀川 750002)
香氣質量及其特征是葡萄酒感官品質的重要評價指標之一,反映了葡萄酒的風格和特色,是目前葡萄酒感官、儀器分析的重要內容[1]。葡萄酒香氣質量受氣候、水、土壤、微生物、釀造工藝等因素決定,從而具有一定原產(chǎn)地的地域特征[2]。葡萄酒香氣品質鑒別傳統(tǒng)上采用專業(yè)品嘗員進行評價分析[3],但主觀因素較強,風格特色難以量化,品嘗員規(guī)模小造成評價數(shù)據(jù)偏差大,但大規(guī)模葡萄酒質量鑒定較難組織且費用昂貴[4]。如何從化學角度,通過數(shù)據(jù)挖掘和模式識別挖掘葡萄酒典型地域風格特色、篩選特征香氣從而辨別產(chǎn)區(qū)特色和質量分級成為當下亟待解決的問題之一。
目前,葡萄酒香氣測定的前處理方法主要包括固相微萃取、固相萃取、液液萃取、攪拌棒吸附萃取等[5],儀器方法主要包括一維氣相色譜、全二維氣相色譜等[6],其中固相微萃取-氣質聯(lián)用(solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,SPME-GC-MS)技術在分離、富集目標香氣物質時不易受基質干擾,且操作簡單、靈敏度高,具有極大的廣譜性[7]。對于香氣樣品的分析及產(chǎn)地識別分析方法主要有主成分分析(principal component analysis,PCA)[8]、分層聚類分析(hierarchical cluster analysis,HCA)[9]、偏最小二乘法(partial least squares,PLS)[10]、正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis,OPLS-DA)[11]等。程超等[12]采用PLS-DA法對三種紅茶風味類型進行了預測;唐平等[13]采用PLS-DA法對赤水河流域不同地區(qū)白酒風味進行了識別與區(qū)分,而有關寧夏賀蘭山東麓葡萄酒產(chǎn)區(qū)不同小產(chǎn)地葡萄酒香氣差異分析與產(chǎn)地識別鮮見報道。
賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)葡萄酒2003年被認定為“國家地理標志產(chǎn)品”,2020年葡萄酒入選首批歐盟保護的中國地理標志協(xié)定,因其獨特的風味在國際上屢次獲獎,深受廣大消費者青睞。為深入了解該產(chǎn)區(qū)葡萄酒香氣風味特色,本研究以賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)中石嘴山、銀川、永寧、青銅峽、紅寺堡5個小產(chǎn)地‘赤霞珠’葡萄為研究對象,采用頂空固相微萃取結合氣質聯(lián)用技術,對產(chǎn)區(qū)‘赤霞珠’葡萄酒進行測定分析,通過多元統(tǒng)計方法,解析不同小產(chǎn)地香氣組成與含量之間的差異性,識別其特征香氣,探究區(qū)分不同產(chǎn)地葡萄酒的科學方法,為進一步挖掘該產(chǎn)區(qū)香氣質量與風格形成背景、葡萄酒產(chǎn)地溯源方法提供理論基礎和數(shù)據(jù)支撐。
本試驗所用葡萄酒均為2018年份未經(jīng)陳釀的年輕‘赤霞珠’葡萄酒,產(chǎn)區(qū)均為寧夏賀蘭山東麓葡萄酒產(chǎn)區(qū),產(chǎn)地分別為石嘴山(編號為SZS-1~SZS-5)、銀川(編號為YC-1~YC-5)、永寧(編號為YN-1~YN-5)、青銅峽(編號為QTX-1~QTX-5)、紅寺堡(編號為HSP-1~HSP-5)5個子產(chǎn)區(qū),每產(chǎn)地選取5個代表性酒莊,嚴格按照當?shù)叵嗤芾矸椒ǚN植,適當成熟系數(shù)采收,采用常規(guī)類似工藝釀造[2],未經(jīng)陳釀。每個單品種酒從兩個獨立發(fā)酵的發(fā)酵罐中收集,然后混勻,共取約2 500 mL,以排除葡萄產(chǎn)地風土條件、葡萄園管理條件與葡萄酒發(fā)酵條件的影響,保證實驗結果只反映品種特征。每個酒樣分為三部分,在15 ℃條件下裝瓶保存待分析。
異丁酸乙酯、丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、異戊酸乙酯、3-呋喃甲醇、月桂醇、葵醇、2-呋喃甲醇、2-辛醇、1-戊烯-3-醇、反式-橙花叔醇、2-庚醇、3-甲硫基丙醇、異丁醇、正丁醇、戊醇等標準品(純度均>98%):美國Sigma-Aldrich公司。
GC2030-TQ8050 NX三重四極桿型氣相色譜質譜聯(lián)用儀(配AOC-6000三合一頂空固相微萃取自動進樣器)、InertCap WAX極性色譜柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)、LC-15C高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)儀:日本Shimadzu公司;Milli-Q超純水系統(tǒng):美國Millipore公司;100 μm固相微萃取纖維頭CAR/DVB/PDMS(100 μm carboxen/divinylbenzene/polydimethylsiloxane):美國Supelco公司。
1.3.1 理化指標的測定
葡萄酒理化指標(酒精度、總糖、干浸出物、揮發(fā)酸、二氧化硫)分析測定依據(jù)國標GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》和GB 2758—2012《食品安全國家標準發(fā)酵酒及其配制酒》規(guī)定的方法執(zhí)行。
1.3.2 揮發(fā)性物質的測定[5]
樣品前處理:葡萄酒中香氣物質的萃取采用頂空-固相微萃取法(headspace solid-phase microextraction,HS-SPME)。稱取2 g NaCl于20.0 mL樣品瓶中,準確量取8.0 mL葡萄酒樣品加入頂空瓶中,同時加入內標物4-甲基-1-戊醇[5](終質量濃度為394.08 μg/L),加蓋密封。插入CAR/DVB/PDMS萃取纖維頭,45 ℃條件下吸附30 min后將萃取纖維在GC進樣口250 ℃條件下解吸3 min,進行GC-MS分析。每個樣品重復3次。
氣相色譜條件:色譜柱為InertCap WAX極性色譜柱(60 m×0.25 mm,0.25 μm);升溫程序為:40 ℃保持5 min,以3 ℃/min升至120 ℃,再以8 ℃/min升至230 ℃,保持10 min;載氣為氦氣(He),流速0.8 mL/min,不分流。
質譜條件:電子電離(electronic ionization,EI)源;電子能量70 eV;傳輸線溫度275 ℃;離子源溫度230 ℃;激活電壓1.5 V;燈絲流量0.25 mA;質量掃描范圍33~450 m/z。
定性定量方法[14]:以正構烷烴(C6~C32)為標準,采用Kovats法測定了所有組分的保留指數(shù)。通過與標準物質保留時間、保留指數(shù)、自建庫以及美國國家標準技術研究所(national institute of standards and technology,NIST)14譜庫檢索進行化合物的定性分析,并結合相關文獻報道對化合物定性結果進一步驗證。有標準品的化合物采用外標定量法進行化合物定量分析,沒有標準品的化合物以4-甲基-1-戊醇為內標物質,進行半定量分析。
1.3.3 多元統(tǒng)計分析
為找不同產(chǎn)地‘赤霞珠’葡萄酒的主要特征標志物,對103種揮發(fā)性化學物質以五種產(chǎn)地為分組依據(jù),利用正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)方法進行判別分析,找出區(qū)分五種產(chǎn)地的主要特征標志化學物質。
OPLS-DA最大的特點是去除自變量X中與分類變量Y無關的數(shù)據(jù)變異,使分類信息主要集中在一個主成分中,從而使模型變得簡單和易于理解,其判別效果和主成分得分圖的可視化效果更加明顯。OPLS方法利用響應變量Y中的信息把X分成三部分。即:
式中:TP表示X的預測的得分矩陣,PTP表示X的預測載荷矩陣,TPPTP表示預測部分,TO表示X與Y的正交成分(稱為OPLS成分)的得分矩陣,PTO表示對應的載荷矩陣,TOPTO表示與Y正交的部分,E為殘差矩陣。
第一步,與Y正交的變量從X數(shù)據(jù)矩陣中剔除,即XP=X-TOPTO
式中:TO是與Y正交成分的得分矩陣,PTO是與其對應的載荷矩陣。
第二步,對XP進行偏最小二乘分析。
1.3.4 數(shù)據(jù)分析
GC-MS實驗數(shù)據(jù)采用Lab Solutions工作站結合NIST 14和Wiley譜庫,進行對照分析,同時結合相關文獻進行人工譜圖解析,確認香氣化合物的化學結構式、名稱、CAS等信息。所有揮發(fā)性物質采用標準化處理,利用SIMCA-P 14軟件建立偏最小二乘判別分析模型,對揮發(fā)性物質進行可視化趨勢分析,并篩選重要香氣物質。
理化指標是評價葡萄酒質量的基本依據(jù),主要包括酒精度、總糖(殘?zhí)牵⒏山鑫?、揮發(fā)酸等,其形成主要決定于葡萄品種、生長環(huán)境、葡萄酒的釀造及陳釀工藝[15]。賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)不同小產(chǎn)地葡萄酒理化指標分析結果見表1。由表1可知,依據(jù)國家標準GB 15037—2006《葡萄酒》和農業(yè)行業(yè)標準NY/T 274—2014《綠色食品葡萄酒》,不同產(chǎn)地葡萄酒總糖(殘?zhí)牵┰?.05~3.86 g/L,說明不同單品種葡萄酒發(fā)酵徹底,葡萄酒類型為干型葡萄酒;酒精度為12.06%vol~14.14%vol,符合限量標準要求(>7%vol);總二氧化硫為52.03~99.44 mg/L,符合限量標準要求(干型<200 mg/L,其他類型<250 mg/L),且整體含量水平較低;揮發(fā)酸含量為0.27~0.34 g/L,符合限量標準要求(<1.2 g/L);干浸出物含量為25.70~27.63 g/L,符合限量標準要求(白葡萄酒>16 g/L,紅葡萄酒>18 g/L)且整體較高。總體來講,寧夏賀蘭山東麓不同單品種葡萄酒質量指標和安全指標均符合葡萄酒相關國家標準。
表1 不同單品種葡萄酒信息與理化指標Table 1 Information and physicochemical indexes of different single varieties of wine
感官特性和化學成分是研究葡萄酒地域性差異的主要手段,但感官描述往往具有較強的主觀性,而化學成分相對較為客觀[4]。通過頂空-固相微萃取結合氣相色譜串聯(lián)質譜(HS-SPME-GC-MS)對寧夏賀蘭山東麓5個不同小產(chǎn)地‘赤霞珠’葡萄酒香氣成分進行檢測和分析,不同產(chǎn)地葡萄酒香氣成分的GC-MS分析總離子流色譜圖見圖1,不同產(chǎn)地‘赤霞珠’葡萄酒香氣物質韋恩圖見圖2,香氣物質含量見圖3,種類及數(shù)量見圖4。
圖1 不同產(chǎn)地‘赤霞珠’葡萄酒香氣物質GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of aroma compounds of 'Cabernet Sauvignon' wines from different regions by GC-MS
圖2 不同產(chǎn)地‘赤霞珠’葡萄酒香氣物質韋恩圖Fig.2 Venn diagram of aroma compounds of 'Cabernet Sauvignon'wines from different regions
圖3 不同產(chǎn)地‘赤霞珠’葡萄酒香氣物質含量Fig.3 Aroma compounds contents in 'Cabernet Sauvignon'wines from different regions
圖4 不同產(chǎn)地‘赤霞珠’葡萄酒中香氣物質的種類及數(shù)量Fig.4 Types and content of aroma compounds in 'Cabernet Sauvignon' wines from different regions
由圖2可知,不同小產(chǎn)地葡萄酒揮發(fā)性香氣物質類型較為相似,但含量差異性較大。共有香氣物質為83個,其中石嘴山和青銅峽、紅寺堡和銀川、永寧和銀川、青銅峽和永寧‘赤霞珠’葡萄酒中共有香氣物質分別為2個、2個、1個、2個。由圖3可知,從香氣物質含量分布來看,不同產(chǎn)地葡萄酒香氣物質含量較高的主要為乙基酯類、醇類、酸類、乙酸酯類物質,銀川子產(chǎn)區(qū)‘赤霞珠’葡萄酒具有較高的乙基酯類物質含量。由圖4可知,從香氣物質種類和數(shù)量分布來看,醇類、酯類(乙基酯、乙酸酯、其他酯類)以及酸類物質個數(shù)較多,其中永寧子產(chǎn)區(qū)‘赤霞珠’葡萄酒醇類物質種類較其他子產(chǎn)區(qū)最多。葡萄酒香氣風格特征主要與其揮發(fā)性香氣成分密切相關,主要包括醇類、酯類、醛類、萜烯類、酮類等,這些物質具有不同的香氣特征,彼此互相影響,構成了葡萄酒香氣的復雜性和多樣性。寧夏賀蘭山東麓5個產(chǎn)地的25個‘赤霞珠’葡萄酒,通過HS-SPME-GC-MS分析共檢測出103種揮發(fā)性物質,其中醇類物質29種,乙酯類物質20種,乙酸酯類物質8種,其他酯類物質14種,萜烯類8種、醛類物質7種,酮類物質3種,酸類物質8種,醚類物質2種、其他類4種(表2)。乙基酯類(22.027~25.656 mg/L)、醇類(11.911~16.764 mg/L)、酸類(2.991~4.659 mg/L)是不同產(chǎn)地葡萄酒主要的香氣物質,占所有香氣總含量的89.35%,其中醇類、酸類物質在青銅峽地區(qū)含量最高,乙基酯類、其他酯類、酮類、其他類物質在銀川地區(qū)含量最高,醚類和乙酸酯類在紅寺堡地區(qū)含量最高,醛類和萜烯類物質分別在永寧和石嘴山地區(qū)含量最高。不同產(chǎn)地雖香氣種類差異不大,但不同香氣物質含量差異較大。辛酸乙酯(果香、花香味)[16]在不同產(chǎn)地‘赤霞珠’葡萄酒中含量均較高(8.310~11.513 mg/L,約占14.0%~24.47%),苯乙醇(花香味)[17]除永寧產(chǎn)地,在其他產(chǎn)地葡萄酒含量也較高(5.348~6.927 mg/L),丁二酸二乙酯(果味)[18]在銀川、永寧、石嘴山產(chǎn)地含量較高,己酸乙酯(果味)[19]在紅寺堡產(chǎn)地中含量較高,9-癸烯酸乙酯(肥皂味,略帶奶油芝士味)[20]在青銅峽和永寧產(chǎn)地中含量較高,說明同一品種葡萄酒決定了其葡萄酒香氣組成結構較為相似,但因風土、氣候等產(chǎn)地差異,在不同香氣含量上有所差異。
表2 不同產(chǎn)地‘赤霞珠’葡萄酒的香氣成分Table 2 Aroma compounds in 'Cabernet Sauvignon' wines from different regions
續(xù)表
2.3.1 OPLS-DA
葡萄酒香氣成分主要受葡萄原料、釀造過程以及陳釀過程所影響,取決于功能微生物在釀造過程中的代謝活動,受控于釀造工藝以及陳釀方式對微生物代謝反應及后處理化學反應的調節(jié)[5]。寧夏不同品牌、不同產(chǎn)地‘赤霞珠’葡萄酒由于生產(chǎn)加工方式及陳釀方式的不同,香氣組成會存在一定差異[21],如酚類化合物的濃度取決于葡萄栽培方法、風土、葡萄成熟度(收獲時間)和釀造過程[22]。通過方差分析可知,寧夏5個產(chǎn)地葡萄酒103種揮發(fā)性物質中,共5種物質差異不顯著,其余均為差異性顯著(P<0.05或P<0.001)。OPLS-DA通常用于區(qū)分兩個或更多組樣本的建模與差異分析,是一種基于正交信號校正法的有監(jiān)督模式回歸分析方法,是PLS-DA方法的延伸和擴展[23]。與PLS-DA相比,OPLS-DA的對變量的解釋變得不那么復雜,并且具有良好的分離預測和非預測(正交)變異的能力[24]。對差異性顯著的100種化合物利用SIMCA-P 14基于香氣定量結果建立不同產(chǎn)地葡萄酒正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)模型,對揮發(fā)性香氣物質進行可視化趨勢分析(見圖5)。通過交互殘差驗證方差分析得OPLS-DA的預測模型P為2.87×10-10,模型的解釋變量(R2Y)和預測能力(Q2Y)分別為0.962和0.852,說明模型分類良好,對5個產(chǎn)地‘赤霞珠’葡萄酒香氣風味具有很好的預測能力。不同產(chǎn)地‘赤霞珠’葡萄酒樣品被明顯的區(qū)分為4類,提取的2個成分累計貢獻率為86.7%,能夠較好反映總體原始變量的絕大部分信息和5個產(chǎn)地的總體情況。青銅峽和石嘴山產(chǎn)地的葡萄酒樣品相互聚攏程度較大,為一類,分布在第二象限,說明樣品間差異相對較小。
由圖5A可知,從主成分得分結果來看,紅寺堡、永寧、銀川產(chǎn)地葡萄酒樣品分別為一類,分布在第一、三、四象限,說明樣品間差異較大。青銅峽和石嘴山從地理位置來講,其距離遠大于永寧和銀川之間,但樣品間的風味特征卻有一定相似性,說明葡萄酒風味之間的差異,對于小產(chǎn)地來講,并不一定與地理位置的遠近有關,這可能還與土壤類型、釀造工藝、微生物種類等多因素有關,從而造就葡萄酒不同的香氣風格。
OPLS-DA分析是基于偏最小二乘法回歸的一種判別方式,以預設分組變量,作為有監(jiān)督的分析,彌補PCA方法的不足,強化組間的差異,OPLS-DA 變量重要性投影(vari able importance in the projection,VIP)值可以量化OPLS-DA的每個變量對分類的貢獻度,便于篩選重要的特征物質[25]。不同產(chǎn)地‘赤霞珠’葡萄酒重要香氣物質VIP 值分布圖見圖5B。由圖5B可知,VIP 值越大,變量在不同產(chǎn)地間差異越顯著。為了篩選地區(qū)差異重要影響的風味物質,以VIP 值>1為指標,確定對地區(qū)區(qū)分有重要貢獻香氣物質共17種,包含正庚醇(VIP=3.679 24)、辛酸乙酯(VIP=3.280 74)、丁二酸二乙酯(VIP=2.889 74)、癸酸乙酯(VIP=2.820 19)、9-癸烯酸乙酯(VIP=2.817 93)、己酸乙酯(VIP=2.733 88)、苯乙醇(VIP=2.400 73)以及乙酸異戊酯、正己醇、異丁醇、異丁酸乙酯、丙酮、2,4-二叔丁基苯酚、丁二酸單甲酯、辛酸、乙酸、乙酸丙酯,這17種物質可以作為5個產(chǎn)地之間相互區(qū)分的主要標志物。其中,辛酸乙酯具有花香味、梨果味、菠蘿味;丁二酸二乙酯具有焦糖、水果味;癸酸乙酯、己酸乙酯具有水果、甜果味;苯乙醇具有花香味。這些香氣物質對葡萄酒香氣具有重要貢獻,是區(qū)分不同產(chǎn)地葡萄酒香氣特征的重要參考指標,決定著不同地區(qū)‘赤霞珠’葡萄酒香氣風格走向。
圖5 不同產(chǎn)地‘赤霞珠’葡萄酒香氣成分正交偏最小二乘判別分析結果Fig.5 Orthogonal partial least squares discriminate analysis results of aroma components of 'Cabernet Sauvignon' wines from different regions
不同香氣物質(X)與不同產(chǎn)地(Y)載荷矩陣OPLS-DA主成分載荷二維坐標圖見圖5C,表示各個主成分與原始變量的相關系數(shù),代表了該主成分對該類物質反映程度的大小。對應的載荷值越大,離中心點位置越遠代表對產(chǎn)地的區(qū)分貢獻越大,且對應的VIP值就越大。由圖5C 可知,己酸乙酯、乙酸異戊酯、癸酸乙酯在第一主成分正向端的載荷值較大,表明與紅寺堡、銀川葡萄酒樣品呈正相關;正庚醇、9-癸烯酸乙酯在第一主成分負向端的載荷值較大,與青銅峽葡萄酒樣品呈正相關;丁二酸單甲酯、苯乙醇在第二主成分負向端的載荷值較大,與永寧葡萄酒樣品呈正相關。
200次重抽樣R2與Q2擬合置換圖見圖5D。由圖5D可知,是對OPLS-DA進行200次的置換交叉驗證試驗(permutation test),驗證擬合優(yōu)度(R2)(左)與真實擬合優(yōu)度R2(最右側)在一條回歸直線上,截距為0.527>0.5,驗證Q2與真實Q2在一條回歸直線上,截距為-1.09<0.05,則認為沒有出現(xiàn)過擬合,所建模型正確。
2.3.2 層次聚類分析
為了進一步驗證寧夏賀蘭山東麓5個小產(chǎn)地差異化合物對產(chǎn)區(qū)葡萄酒的區(qū)分,對優(yōu)選出的VIP值>1的17個關鍵化合物進行聚類分析,結果見圖6。由圖6可知,5個不同產(chǎn)地的25份葡萄酒能夠很好的區(qū)分,其中紅寺堡和銀川、永寧和石嘴山產(chǎn)地葡萄酒具有一定相似性,青銅峽產(chǎn)地葡萄酒能夠完全被分類獨立的一類。與2.3.1中基于所有揮發(fā)物的主成分分類結果相比,17種關鍵化合物對不同產(chǎn)地的區(qū)分,彌補了石嘴山和青銅峽不能很好區(qū)分的不足,進一步降低了產(chǎn)地葡萄酒身份識別的成本。
圖6 不同產(chǎn)地赤霞珠葡萄酒層次聚類分析結果Fig.6 Hierarchical cluster analysis results of 'Cabernet Sauvignon'wines from different regions
本研究以揮發(fā)性香氣物質為基礎,以寧夏賀蘭山東麓‘赤霞珠’葡萄酒為研究對象,圍繞石嘴山、銀川、永寧、青銅峽、紅寺堡5個產(chǎn)地的25個不同酒莊的葡萄酒樣品,共檢測出103種揮發(fā)性物質,其中醇類物質29種,乙酯類物質20種,乙酸酯類物質8種,其他酯類物質14種,萜烯類8種,醛類物質7種,酮類物質3種,酸類物質8種,醚類物質2種,其他類4種,不同地區(qū)‘赤霞珠’葡萄酒主要香氣種類基本相似,含量差異較大。通過103種揮發(fā)性香氣物質進行正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)與可視化趨勢分析,建立了不同地區(qū)‘赤霞珠’葡萄酒分類模型,不同地區(qū)‘赤霞珠’葡萄酒樣品呈現(xiàn)明顯的分離趨勢,明確了正庚醇、辛酸乙酯、丁二酸二乙酯、癸酸乙酯、9-癸烯酸乙酯、己酸乙酯、苯乙醇等共17個化合物為區(qū)分不同產(chǎn)地‘赤霞珠’葡萄酒的主要特征標志物。同時OPLS-DA能夠將紅寺堡、銀川、永寧地區(qū)‘赤霞珠’葡萄酒很好區(qū)分,基于17個主要特征標志物的聚類分析可實現(xiàn)青銅峽與石嘴山的準確分類,說明通過OPLS-DA與主要特征標志物的聚類分析能夠更全面、客觀地對寧夏賀蘭山東麓不同產(chǎn)地‘赤霞珠’葡萄酒進行區(qū)分和評價。