產(chǎn)果香風(fēng)味酵母的分離鑒定及其生長特性分析

孔垂琴，范洪臣*，唐 慧，石彥國，張 娜

（哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品工程學(xué)院 黑龍江省普通高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗室，黑龍江 哈爾濱 150076）

精釀啤酒（craft beer）也稱為工坊啤酒，指由生產(chǎn)規(guī)模較小的商業(yè)化企業(yè)或作坊生產(chǎn)且釀造工藝、原料、酵母種類獨(dú)特的啤酒產(chǎn)品[1]。目前，果味啤酒是新型工坊啤酒開發(fā)的熱點(diǎn)，如比利時和林德曼啤酒[2]。為增加啤酒中的果香味，釀造工藝中常添加果汁、酒花和產(chǎn)香酵母以提升風(fēng)味[3-4]，其中產(chǎn)香酵母菌起到關(guān)鍵作用[5]。

產(chǎn)香酵母主要包括漢遜酵母（Hanseniasporasp.）、球擬酵母（Torulopsissp.）、克勒克酵母（Kloeckerasp.）、假絲酵母（Candidasp.）和畢赤酵母（Pichiasp.）等[6-8]，其在發(fā)酵過程產(chǎn)生的酯類、高級醇和低級脂肪酸等能夠賦予啤酒濃郁的醇、酯香味[9-12]。產(chǎn)香酵母在發(fā)酵過程中能生成大量風(fēng)味物質(zhì)前體物，何松等[13]采用非釀酒酵母發(fā)酵水蜜桃，發(fā)現(xiàn)果酒中產(chǎn)生了大量的芳香類物質(zhì)，改善了果酒的發(fā)酵風(fēng)味。目前，精釀果啤生產(chǎn)所使用的酵母多為工業(yè)用啤酒酵母，使用單一啤酒酵母發(fā)酵會造成產(chǎn)品風(fēng)味單調(diào)、口味平淡[14-15]，非釀酒酵母和商業(yè)化啤酒酵母混合使用在保證了精釀啤酒基礎(chǔ)風(fēng)味的前提下可增加酯香風(fēng)味物質(zhì)[16-18]。因此，產(chǎn)香酵母菌種的優(yōu)化、培育、篩選對啤酒品質(zhì)具有重要的意義[19]。目前，已發(fā)現(xiàn)的生香酵母大多從固態(tài)酒、調(diào)味品釀造中分離而來[20]，而從谷物中篩選出產(chǎn)香酵母并應(yīng)用到啤酒釀造中的研究鮮見報道。

因此，本研究利用嗅聞技術(shù)和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrography，GC-MS）法檢測技術(shù)，從傳統(tǒng)谷物大米發(fā)酵液中篩選具有濃郁果香風(fēng)味的酵母，通過形態(tài)觀察、生理生化試驗和分子生物學(xué)技術(shù)對其進(jìn)行鑒定，并對其耐受性進(jìn)行分析，以期為果香味精釀啤酒提供優(yōu)良的酵母菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

大米發(fā)酵液：哈爾濱某工廠；大麥芽：哈爾濱廣匯生活超市。

1.1.2 試劑

ExTaq酶RR001：南京建成生物工程研究所；脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）Mix、10×ExTaqBuffer：日本TaKaRa公司；引物：上海生物工程有限公司；DL2000脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Marker：北京博邁德生物技術(shù)有限公司；真菌基因組DNA提取試劑盒：杭州愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

孟加拉紅固體培養(yǎng)基[4]：蛋白胨5 g/L、葡萄糖10 g/L、磷酸二氫鉀1 g/L、硫酸鎂0.5 g/L、孟加拉紅0.03 g/L、氯霉素0.1 g/L、瓊脂20 g/L、蒸餾水1 L，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基[9]：蛋白胨20g/L、酵母浸粉10g/L、葡萄糖20g/L、蒸餾水1 L，固體培養(yǎng)基中添加2%的瓊脂。121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

麥芽汁糖化液[21]：將原料大麥芽粉碎調(diào)漿（料水比為1∶2（g∶mL））后，攪拌均勻，升溫至65 ℃糖化30 min，濾去纖維渣后煮沸15 min至糖度達(dá)12°Bx左右。

1.2 儀器與設(shè)備

YXQ-70A型立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；H1650型醫(yī)用離心機(jī)：湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；JEI002型電子天平：上海浦春計量儀器有限公司；DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱、DHG-9203A型電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科技有限公司；UV-2450紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；HDL型超凈工作臺：北京市東聯(lián)哈爾儀器制造廠；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：杭州郎基科學(xué)儀器有限公司；HH-S4型恒溫水浴鍋：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；3730XL型測序儀：美國ABI公司；HP6890/5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Agilent公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 酵母菌的分離純化

在無菌條件下，取100 μL大米發(fā)酵液，采用無菌水按10倍梯度稀釋至10-6，分別取發(fā)酵稀釋液100 μL涂布于孟加拉紅固體培養(yǎng)基上，于28 ℃條件下培養(yǎng)24 h。待菌落長出后，挑取肉眼可見不同形態(tài)的單個菌落劃線接種于YPD固體培養(yǎng)基中，反復(fù)純化得到純菌落。

1.3.2 產(chǎn)果香酵母菌的篩選

將已純化的菌株分別接種于YPD固體培養(yǎng)基，28 ℃條件下培養(yǎng)48 h。由經(jīng)過專業(yè)訓(xùn)練的嗅覺靈敏的試驗人員與國家一級品酒師組成感官評價小組，采用嗅香技術(shù)對不同發(fā)酵培養(yǎng)基中的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行評價，以期篩選產(chǎn)香菌株[22]。

1.3.3 酵母菌產(chǎn)香發(fā)酵試驗

將產(chǎn)香菌株接種于YPD液體培養(yǎng)基，28 ℃、120 r/min條件下培養(yǎng)24 h后。按照2%（V/V）的接種量將活菌數(shù)為2.32×108CFU/mL的產(chǎn)香菌液接種于麥芽汁糖化液中，在25 L發(fā)酵罐中混合均勻，于10 ℃條件下靜置發(fā)酵6 d，命名為樣品A，以未接菌的麥芽汁糖化液為空白組，命名為樣品a。

1.3.4 揮發(fā)性香氣物質(zhì)的測定

采用GC-MS對樣品A、a的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行測定[23]。

樣品前處理：稱取適量樣品置于頂空瓶中，加3 mL飽和NaCl溶液密封，于80 ℃條件下平衡30 min，用固相微萃取針萃取30 min。待萃取結(jié)束后，萃取針在進(jìn)樣口解吸5 min，萃取結(jié)束后采用分液漏斗分液，收集下層溶液并濃縮至5 mL，使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測定揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。

色譜條件：TG-5MS非極性毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升溫程序為起始溫度45 ℃保持4 min，以6 ℃/min的速率升至130 ℃保持5 min，再以10 ℃/min的速率升至240 ℃保持8 min；進(jìn)樣口溫度240 ℃；載氣為氦氣（He）（純度99.99%），流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量1 μL；不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件：離子源溫度230 ℃；四級桿溫度180 ℃；電子電離（electronic ionization，EI）源；電子能量70 eV；掃描方式為全掃描；質(zhì)譜掃描范圍為40～600 amu。

定性定量分析：采集到的質(zhì)譜圖利用美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（national institute of standards and technology，NIST）譜庫進(jìn)行檢索，鑒定樣品中的揮發(fā)性成分，并利用峰面積歸一化法分析各成分的相對含量。

1.3.5 產(chǎn)果香酵母菌的鑒定

（1）形態(tài)學(xué)觀察

根據(jù)《酵母菌的特征與鑒定手冊》[24]，觀察并記錄產(chǎn)香酵母菌株的菌落顏色、形狀、大小、濕潤度、透明度、邊緣是否整齊、菌落質(zhì)地等特征，記錄菌體形態(tài)、大小、出芽情況等，對產(chǎn)香菌株進(jìn)行初步判斷。

（2）生理生化鑒定

參照《酵母菌的特征與鑒定手冊》[24]和《真菌鑒定手冊》[25]對產(chǎn)香酵母菌株進(jìn)行生理生化試驗。

（3）分子生物學(xué)鑒定

采用真菌基因組DNA提取試劑盒提取產(chǎn)香酵母菌株的DNA，以其為模板，采用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）、ITS4R（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）對其ITS rDNA基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：10×ExTaqBuffer 5.0 μL，2.5 mmol/L dNTP Mix 4.0 μL，引物ITS1（10 μmol/L）2.0μL，引物ITS4R（10 μmol/L）個2.0 μL，DNA聚合酶0.5 μL，菌液2 μL，雙蒸水（ddH2O）34.5 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，共25個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測序。將測序得到的基因序列提交至美國國立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫中，采用基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）進(jìn)行同源性搜索比對，選取同源性較高的模式菌株的ITS rDNA基因序列，采用MAGE-x軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并采用Bootstrapin法評估其準(zhǔn)確性。

1.3.6 產(chǎn)果香酵母菌生長曲線的測定

將產(chǎn)香菌株接種于YPD液體培養(yǎng)基，28 ℃、120 r/min條件下培養(yǎng)24 h作為種子液（菌體濃度2×107CFU/mL），備用。

按2%（V/V）的接種量將種子液接種于YPD培養(yǎng)基，28 ℃、120 r/min條件下培養(yǎng)24 h，每2 h取樣測定OD600nm值，以發(fā)酵時間（x）為橫坐標(biāo)，OD600nm值（y）為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。

1.3.7 產(chǎn)果香酵母菌株的耐受性試驗

葡萄糖耐受性：按2%（V/V）的接種量，將產(chǎn)果香酵母菌的種子液分別接種于葡萄糖含量分別為10%、20%、30%、40%、50%、60%的YPD培養(yǎng)基中，28 ℃、120 r/min條件下培養(yǎng)24 h，測定OD600nm值。

酸耐受性：按2%（V/V）的接種量，采用乳酸調(diào)節(jié)YPD培養(yǎng)基pH值，將產(chǎn)果香酵母菌的種子液接種于pH分別為3.5、4.0、4.5、5.5、6.0的YPD培養(yǎng)基中，28 ℃、120 r/min條件下培養(yǎng)24 h，測定OD600nm值。

乙醇耐受性：按2%（V/V）的接種量，將產(chǎn)果香酵母菌的種子液接種于乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為0、2%、4%、6%、8%、10%的YPD培養(yǎng)基中，28 ℃、120 r/min條件下培養(yǎng)24 h，測定OD600nm值。

溫度耐受性：按2%（V/V）的接種量，將產(chǎn)果香酵母菌的種子液接種于YPD培養(yǎng)基中，分別于溫度為15 ℃、18 ℃、21 ℃、24 ℃、27 ℃、30 ℃條件下，120 r/min培養(yǎng)24 h，測定OD600nm值。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均平行測定3次，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示；利用SPSS26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；利用Origin 9.0軟件繪制圖形。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)果香酵母菌的分離篩選

通過平板涂布、劃線分離和嗅聞技術(shù)[26]，從大米發(fā)酵液樣品中分離篩選出一株產(chǎn)濃郁果香風(fēng)味的酵母菌，命名為QL-2。

2.2 產(chǎn)果香酵母菌QL-2發(fā)酵液的香氣成分分析

采用GC-MS聯(lián)用法檢測樣品A和a的揮發(fā)性香氣成分，GC-MS分析總離子流色譜圖見圖1，分析結(jié)果見表1。

圖1 產(chǎn)果香酵母菌QL-2發(fā)酵液中揮發(fā)性風(fēng)味成分的GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.1 Total ion flow chromatographic of volatile flavor components in fermentation broth of fruity-producing yeast QL-2 analyzed by GC-MS

表1 產(chǎn)果香酵母菌QL-2發(fā)酵液中揮發(fā)性風(fēng)味成分的GC-MS分析結(jié)果Table 1 GC-MS analysis results of volatile flavor components in fermentation broth of fruity-producing yeast QL-2

續(xù)表

由圖1及表2可知，樣品中共檢測出36種揮發(fā)性風(fēng)味成分。試驗組A中共檢出26種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，包括酯類8種、醇類5種、酸類5種、醛類5種、酚類2種、呋喃類1種，相對含量分別為29.17%、51.72%、4.97%、3.64%、1.17%、5.51%。其中相對含量較高的是乙酸乙酯（23.26%）、乙醇（20.27%）、苯乙醇（20.07%）、異戊醇（7.80%）、2-正戊基呋喃（5.51%）、乙酸異丁酯（3.46%）、3-苯基丙烯酸（3.31%），推測濃郁梨清香和香甜味可能與乙酸乙酯和苯乙醇有關(guān)；空白組a中共檢測出25種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，包括酯類1種、醇類6種、酸類6種、醛類6種、酮類1種、酚類4種和呋喃類1種，相對含量分別為0.10%、28.09%、5.56%、3.51%、2.95%、49.14%、0.29%，其中相對含量較高的風(fēng)味物質(zhì)是2,5-二叔丁基酚（25.32%）、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚（18.10%），這兩種物質(zhì)可能是麥芽汁的主要特征風(fēng)味物質(zhì)。通過對比發(fā)現(xiàn)，空白組的酚類相對含量較多，酯類含量較少，而發(fā)酵后的酯類和醇類生成相對較多，說明發(fā)酵前后酚類物質(zhì)在發(fā)酵過程中發(fā)生了一系列反應(yīng)生成具有特征風(fēng)味物質(zhì)的酯類，形成獨(dú)特的風(fēng)味體系[26]，并且酵母菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生了大量的醇，導(dǎo)致發(fā)酵后醇類物質(zhì)增多。由此可見，接入酵母菌株QL-2在麥芽汁糖化液中能增加果香風(fēng)味物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)啤酒風(fēng)味的作用。

2.3 產(chǎn)果香酵母菌的鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定

產(chǎn)果香酵母菌QL-2在YPD培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)見圖2。由圖2可知，菌株QL-2的菌落中央凸起、邊緣整齊、表面光滑、濕潤易挑起、呈現(xiàn)奶油狀；細(xì)胞呈橢球狀，單邊出芽。

圖2 菌株QL-2的菌落（a）及細(xì)胞（b）形態(tài)特征Fig.2 Colony (a) and cell (b) morphological characteristics of strain QL-2

2.3.2 生理生化試驗

產(chǎn)果香酵母菌QL-2的生理生化試驗結(jié)果見表2。由表2可知，在碳源同化試驗中，菌株QL-2能利用葡萄糖、蔗糖、半乳糖、可溶性淀粉、麥芽糖、棉子糖、海藻糖、乙醇，不能利用纖維二糖、乳糖、鼠李糖、山梨糖、甘露醇、山梨醇進(jìn)行生長；在氮源同化試驗中，菌株QL-2能利用尿素、硝酸銨、硫酸銨，而不能利用亞硝酸鉀進(jìn)行生長；除了吲哚試驗和尿素試驗結(jié)果呈現(xiàn)陽性外，重氮基蘭B試驗、脲酶試驗、甲基紅試驗、明膠水解試驗和硫化氫試驗結(jié)果皆為陰性，參照《酵母菌的特征與鑒定手冊》[24]可初步判定該菌株為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），但僅通過生理生化還不能精確判斷到具體菌種，因此還需要進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。

表2 菌株QL-2的生理生化試驗結(jié)果Table 2 Physiological and biochemical tests results of strain QL-2

2.3.3 分子生物學(xué)鑒定

基于ITS rDNA基因序列產(chǎn)果香酵母菌QL-2的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。

圖3 基于ITS rDNA基因序列菌株QL-2的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain QL-2 based on ITS rDNA gene sequences

由圖3可知，菌株QL-2與屬于釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）（KC544499.1）等聚于一個分支，親緣關(guān)系最近，同時結(jié)合測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中blast序列進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)菌株QL-2與菌株S.cerevisiae（KC544499.1）具有100%的相似度，并結(jié)合形態(tài)觀察、生理生化試驗，最終鑒定菌株QL-2為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

2.4 產(chǎn)果香釀酒酵母QL-2的生長特性

2.4.1 生長曲線

產(chǎn)果香釀酒酵母QL-2的生長曲線見圖4。由圖4可知，菌株QL-2在0～8 h處于延遲期，8～16 h為對數(shù)生長期，16 h后處于穩(wěn)定期。

圖4 釀酒酵母QL-2的生長曲線Fig.4 Growth curve of Saccharomyces cerevisiae QL-2

2.4.2 耐受性分析

（1）葡萄糖耐受性試驗

在麥芽汁發(fā)酵過程中，添加葡萄糖有利于酵母菌的生長，有利于在啤酒發(fā)酵后期酒精度和風(fēng)味物質(zhì)的增加，因此，葡萄糖耐受較好的酵母菌對于發(fā)酵至關(guān)重要。有研究表明，葡萄糖耐受較好的酵母菌能夠快速生長繁殖，延滯期更短，有利于工業(yè)化的生產(chǎn)[27]。釀酒酵母QL-2對葡萄糖的耐受性見圖5。由圖5可知，隨葡萄糖含量的增加，釀酒酵母QL-2的OD600nm值不斷降低，二者呈負(fù)相關(guān)。但在葡萄糖含量為60%時，釀酒酵母QL-2仍可生長，說明該菌種葡萄糖耐受性較好，具有良好的環(huán)境適應(yīng)性，可用于工業(yè)生產(chǎn)發(fā)酵。

圖5 釀酒酵母QL-2的葡萄糖耐受性Fig.5 Glucose tolerance of Saccharomyces cerevisiae QL-2

（2）酸耐受性試驗

李棒等[28]研究發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母具有一定的酸耐受性有利于提升酵母的發(fā)酵速率，因此，酵母是否具有耐酸性對釀造啤酒品質(zhì)具有至關(guān)重要的作用。釀酒酵母QL-2對酸的耐受性見圖6。由圖6可知，釀酒酵母QL-2可在pH為3.5～6.0的條件下生長，隨著環(huán)境pH不斷升高，菌株QL-2的OD600nm值呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在pH為5.5時菌株的生長狀況最佳，pH為6.0時菌株的生長相對下降，說明該菌株可能更適合在稍酸的環(huán)境中生長且具有一定的耐酸性，可耐受pH 3.5。

圖6 釀酒酵母QL-2的酸耐受性Fig.6 Acid tolerance of Saccharomyces cerevisiae QL-2

（3）乙醇耐受性試驗

耐乙醇能力強(qiáng)的酵母能夠促使發(fā)酵更加完全、徹底[29]。釀酒酵母QL-2對乙醇的耐受性見圖7。由圖7可知，釀酒酵母QL-2在乙醇體積分?jǐn)?shù)為0～10%的范圍內(nèi)均能生長，且在乙醇體積分?jǐn)?shù)為6%時生長情況最佳，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%時生長相對下降但仍具有生長力，說明釀酒酵母QL-2具有一定乙醇耐受性。

圖7 釀酒酵母QL-2的乙醇耐受性Fig.7 Alcohol tolerance of Saccharomyces cerevisiae QL-2

（4）溫度耐受性試驗

有研究表明，溫度會直接影響酵母的生長繁殖，如果溫度較高，酵母生長較快容易加速衰亡，風(fēng)味物質(zhì)也會相應(yīng)減少；相反，一定的低溫條件有利于促進(jìn)產(chǎn)香酵母產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)[30-31]。釀酒酵母QL-2對低溫的耐受性見圖8。由圖8可知，釀酒酵母QL-2在15～30 ℃范圍內(nèi)均能生長，且在24 ℃條件生長情況最好，說明釀酒酵母QL-2具有一定的低溫耐受性，可耐受低溫15 ℃，通過對低溫發(fā)酵試驗結(jié)果進(jìn)行嗅聞發(fā)現(xiàn)，該菌株在低溫條件下發(fā)酵確實(shí)能產(chǎn)生較怡人的風(fēng)味物質(zhì)，與之前嗅聞結(jié)果符合，可應(yīng)用于麥芽汁低溫發(fā)酵豐富風(fēng)味物質(zhì)。

圖8 釀酒酵母QL-2的溫度耐受性Fig.8 Temperature tolerance of Saccharomyces cerevisiae QL-2

3 結(jié)論

通過嗅聞技術(shù)和GC-MS檢測技術(shù)從大米發(fā)酵液中篩選獲得1株產(chǎn)果香的酵母菌，編號為QL-2，利用該菌株發(fā)酵麥芽汁糖化液后發(fā)現(xiàn)呈果香風(fēng)味物質(zhì)的種類及含量增加，其中乙酸乙酯相對含量最高（23.26%）。通過形態(tài)觀察、生理生化試驗及分子生物學(xué)技術(shù)鑒定菌株QL-2為釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae），其對生長環(huán)境具有一定的耐受性，可在pH 3.5、乙醇體積分?jǐn)?shù)10%、葡萄糖含量60%、溫度為15 ℃條件下正常生長，可作為理想的精釀啤酒產(chǎn)果香風(fēng)味的酵母并應(yīng)用到工業(yè)化生產(chǎn)。