濃香型白酒生產(chǎn)區(qū)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的季節(jié)性變化

呂麗茹，王曉平，文 靜，鄒永芳，龔利娟*，周麗洪，陳識澳，扎西尼瑪

（1.四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院，四川宜賓 644005；2.四川省釀酒專用糧工程技術(shù)研究中心，四川宜賓 644005；3.舍得酒業(yè)股份有限公司，四川遂寧 629209）

中國白酒的發(fā)酵是傳統(tǒng)的固態(tài)發(fā)酵工藝[1-2]，白酒生產(chǎn)是利用自然界微生物的過程，多種因素會影響濃香型白酒的質(zhì)量風(fēng)格，在工藝上，曲、窖、糟是影響酒質(zhì)的三大要素，而有益微生物的區(qū)系形成及其功能的發(fā)揮又是其關(guān)鍵所在[3]。中國白酒的制曲工藝和酒窖發(fā)酵分別是開放式和半開放式，與窖外環(huán)境的關(guān)系十分緊密，空氣、土壤、水質(zhì)、氣候等因素都會影響到釀酒微生物區(qū)系的形成，從而對酒質(zhì)和風(fēng)格產(chǎn)生影響[4]。目前對于濃香型白酒的研究側(cè)重于微生物的種類、形成機(jī)制、酒體香味物質(zhì)和口感等品質(zhì)特征[5-6]，對于白酒釀造環(huán)境的研究重點(diǎn)則放在車間內(nèi)外空氣[7-8]和使用器具上[9]。白酒生產(chǎn)車間中空氣微生物菌群主要來自于曲粉、發(fā)酵糟和窖泥、細(xì)菌細(xì)胞、細(xì)菌芽孢和真菌孢子均以氣溶膠形式飄浮于空氣中，并隨著空氣四處流動[10]?？諝庵械募?xì)菌和真菌的孢子飄落到適宜的介質(zhì)上即快速萌發(fā)生長，濃香型白酒釀造車間內(nèi)與外環(huán)境呈半開放狀態(tài)，車間內(nèi)外的微生物經(jīng)由空氣流動相互交換，從而影響空氣中微生物群落結(jié)構(gòu)[7]，然而，空氣中的微生物主要來源于自然界的土壤、水體、動植物和人類[11-13]。對于微生物種類和穩(wěn)定性而言，土壤是微生物的大本營，每克土壤包含數(shù)千個(gè)微生物類群且優(yōu)勢微生物種群相對較穩(wěn)定[14]，而空氣微生物群落結(jié)構(gòu)和物種組成及其濃度極不穩(wěn)定，會隨著各種環(huán)境氣象因素及污染因子的變化而使空氣中微生物的種類、數(shù)量均發(fā)生較大的變化[15]。無論是空氣中還是土壤中的微生物，都不是單獨(dú)存在的，總是通過各種信號轉(zhuǎn)遞、對空間和營養(yǎng)的相互競爭和依賴等作用而形成微生物群落。它們與環(huán)境的相互作用，促進(jìn)了微生物群落的進(jìn)化和演替，從而達(dá)到調(diào)控和優(yōu)化微生物群落的作用。

眾所周知，名酒的釀造離不開當(dāng)?shù)鬲?dú)特的地理環(huán)境、氣候、水源等條件，環(huán)境微生物也是其中的重要部分，現(xiàn)有對于釀酒外環(huán)境的研究主要集中在生產(chǎn)區(qū)內(nèi)外空氣中的微生物，而對與白酒生產(chǎn)區(qū)土壤微生物的研究及其影響因素卻較少。楊代永等[16]研究發(fā)現(xiàn)，習(xí)酒鎮(zhèn)的環(huán)境中存在著大量的釀酒微生物，其可培養(yǎng)的微生物菌群結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定。土壤中常見的可培養(yǎng)細(xì)菌主要有12種，常見的可培養(yǎng)霉菌有11種，常見的可培養(yǎng)酵母菌有4種，但該研究結(jié)果缺乏對釀酒環(huán)境中土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與具體組成的研究，對其季節(jié)性變化趨勢及影響因素是否與現(xiàn)有土壤研究一致還不得而知，并且使用的是傳統(tǒng)的微生物平板分離技術(shù)，獲得培養(yǎng)的生物量遠(yuǎn)遠(yuǎn)要小于實(shí)際微生物的數(shù)量。

本研究以四川省遂寧市沱牌舍得生態(tài)釀酒產(chǎn)業(yè)園區(qū)生產(chǎn)車間外周土壤為研究對象，采用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)對土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)的季節(jié)變化趨勢、影響因子及土壤中是否具有釀酒微生物的存在進(jìn)行初步研究，旨在探究濃香型白酒釀酒生產(chǎn)區(qū)外周的土壤微生物與環(huán)境因子的內(nèi)在聯(lián)系，以期為更深層次探討濃香型白酒酒體特征形成的原因做好釀酒外環(huán)境的研究基礎(chǔ)，并為研究穩(wěn)定釀酒微生態(tài)環(huán)境的技術(shù)措施提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氫氧化鈉、碳酸氫鈉、硼酸、硝酸鈉、四苯硼鈉（均為分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；重鉻酸鉀、高錳酸鉀、硫酸、鹽酸（均為分析純）：成都市科隆化學(xué)品有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AT-710自動電位滴定儀：日本京都電子公司；UV-5100B紫外可見分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；K1100全自動凱式定氮儀、SH220F石墨消解儀：濟(jì)南海能儀器股份有限公司；BSD-YZ2200立式智能精密搖床：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；VeritiFAST梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

圍繞白酒生產(chǎn)車間外周，選取10個(gè)（20 m×20 m）樣地，每個(gè)樣地設(shè)置5個(gè)（2 m×2 m）樣方。于2020年的7月份（夏季（Sum），工廠停產(chǎn)期）和1月份（冬季（Win），工廠繁忙期）中旬采樣，按照“五點(diǎn)取樣法”在每個(gè)樣方中隨機(jī)采集5個(gè)（0～40 cm）混合土樣，并立即混合成單個(gè)土壤樣品，共獲得100個(gè)土樣。土樣過2 mm篩后分成兩份，一部分自然風(fēng)干，用于土壤物理和化學(xué)性質(zhì)的測定；另一部分每一個(gè)樣地混合成1個(gè)樣，兩個(gè)季節(jié)共得20個(gè)土樣，用于微生物測序。

1.3.2 土壤理化性質(zhì)測定

土樣采用LU R K[17]描述的標(biāo)準(zhǔn)土壤試驗(yàn)方法進(jìn)行分析。使用烘箱105℃烘干24h后測定含水量（moisturecontent，MC）和容重；pH采用離子交換法測定；有機(jī)質(zhì)（organic matter，OM）和有機(jī)碳（organic carbon，OC）采用重鉻酸鉀氧化-外加熱法測定；全氮（total nitrogen，TN）采用微量凱氏定氮法測定；速效磷（available phosphorus，AP）采用鉬藍(lán)比色法測定；速效鉀（available kalium，AK）采用比濁法測定。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

細(xì)菌選擇16S rRNA V3-V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，正向引物為V4 515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'），反向引物為806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'），真菌選擇ITS1區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，正向引物為ITS1-F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'），反向引物為（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'），利用Illumina公司的PE300平臺進(jìn)行Miseq測序，比對Silva 16S rRNA數(shù)據(jù)庫（v138）和UNITE數(shù)據(jù)庫，使用RDP classifier[18]對每條序列進(jìn)行物種分類注釋。

根據(jù)樣本序列物種分類注釋結(jié)果，統(tǒng)計(jì)各個(gè)樣本的物種在門、綱、目、科、屬和種各分類單元上的數(shù)量。運(yùn)用上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的云平臺多樣性分析流程（Qiime2流程），將測得序列數(shù)進(jìn)行抽平后，計(jì)算各季節(jié)樣本微生物群落的α多樣性指數(shù)，以表征物種的豐富度（Chao1指數(shù)）和多樣性（Shannon指數(shù)）。

采用R語言Stat包[19]（http：//gffiy 7bd9881e65bf47e3hq unf09xkwkb06nk x.fffb.sus e.c w keji.cn：999/），根據(jù)群落相對豐度數(shù)據(jù)，利用組間差異檢驗(yàn)方法，得到物種豐度差異的顯著性水平。采用CANOCO5.0軟件對環(huán)境因子與微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行冗余分析（redundancyanalysis，RDA），同時(shí)應(yīng)用主軸鄰距法（principal coordinates of neighbor matrices，PCNM）計(jì)算得出不同環(huán)境因子對土壤微生物群落變量構(gòu)建的貢獻(xiàn)率。采用SPSS 20.0對理化指標(biāo)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同季節(jié)土壤理化指標(biāo)

對生產(chǎn)車間夏、冬季的土壤理化因子進(jìn)行分析，結(jié)果見表1。由表1可知，土樣呈中堿性（pH在7～9）。土壤含水量、容重、有機(jī)質(zhì)、速效磷的含量從夏季到冬季呈上升趨勢，而pH、總氮、有機(jī)碳和速效鉀的含量則呈現(xiàn)相反的變化趨勢。進(jìn)一步對理化因子進(jìn)行Wilcox顯著性檢驗(yàn)表明，除土壤總氮含量在夏季和冬季無顯著性差異外（P＞0.05），其余因子均有顯著性差異（P＜0.05）。

表1 生產(chǎn)車間夏季和冬季土壤理化特征Table 1 Physical and chemical characteristics of soil in production workshop in summer and winter

2.2 不同季節(jié)土壤微生物多樣性季節(jié)變化特征

基于observed ASV（sobs指數(shù)）構(gòu)建的稀釋曲線，結(jié)果見圖1。由圖1可知，細(xì)菌和真菌稀釋曲線趨于平緩，說明測序數(shù)據(jù)能夠覆蓋土壤微生物絕大部分物種，能夠滿足分析需要。

圖1 夏季和冬季土壤細(xì)菌（a）和真菌（b）微生物稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curve of bacteria (a) and fungi (b) in the soil of summer and winter

對不同季節(jié)土壤微生物物種豐度進(jìn)行分析，結(jié)果見表2。由表2可知，無論是細(xì)菌還是真菌，冬季微生物群落各分類單元門、綱、目、科、屬、種、擴(kuò)增子序列變異體（amplicon sequence variants，ASV）和序列（sequence）的數(shù)量皆高于夏季。

表2 夏季和冬季土壤微生物群落各分類單元的物種豐富度特征Table 2 Species richness characteristics of each taxonomic unit in soil microbial community in summer and winter

將測序數(shù)據(jù)進(jìn)行抽平后，對夏季（Sum）和冬季（Win）土壤微生物群落進(jìn)行多樣性指數(shù)分析，結(jié)果見圖2。

圖2 夏季和冬季土壤細(xì)菌（a）和真菌（b）群落多樣性指數(shù)分析結(jié)果Fig.2 Diversity indexes analysis results of bacterial(a) and fungal(b)communities in the soil of summer and winter

由圖2a可知，冬季的細(xì)菌Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)皆高于夏季，其中冬季Chao1指數(shù)顯著高于夏季（P＜0.05），表明冬季細(xì)菌微生物群落多樣性和豐富度高于夏季。由圖2b可知，真菌冬季Chao1指數(shù)高于夏季，但Shannon指數(shù)卻相反，夏季Shannon指數(shù)顯著高于冬季（P＜0.05），表明冬季真菌微生物群落豐富度高于夏季，而夏季真菌微生物群落多樣性卻高于冬季。

無論是細(xì)菌還是真菌，冬季微生物數(shù)量都高于夏季。一方面是秋季植被凋落物的大量輸入為冬季微生物的生長提供了足夠的碳源和營養(yǎng)，從而使冬季土壤微生物數(shù)量增加，對川西高原和溫帶土壤研究發(fā)現(xiàn)[20-21]，40%～60%凋落物通常在冬季被分解，植被凋落物的分解腐化降低了微生物生物量氮的含量，增加了細(xì)菌微生物的數(shù)量。另一方面是溫度，川南地區(qū)土壤溫度會隨著季節(jié)性溫度的變化而改變，因此土壤溫度呈現(xiàn)出夏季高、冬季低的特征，不同種類微生物生長的最適溫度不同，土壤溫度的變化導(dǎo)致土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和活性發(fā)生改變。如LIPSON D A等[22]分別取回夏季和冬季的土壤，在22 ℃和0 ℃分別測試其呼吸強(qiáng)度發(fā)現(xiàn)，冬季土壤明顯高于夏季土壤。但也有研究發(fā)現(xiàn)，土壤呼吸與土壤溫度呈正比，微生物群體組成隨溫度升高而改變[23]，某些微生物群落能在較高溫度代謝那些在低溫時(shí)不能被利用的基質(zhì)。對于秦嶺兩種林型[24]和東莞市城市森林[25]土壤微生物季節(jié)性研究發(fā)現(xiàn)，土壤微生物群落多樣性在夏、秋季顯著高于冬、春季，對土壤微生物季節(jié)變化過程的研究結(jié)果并沒有統(tǒng)一的定性規(guī)律，這說明土壤微生物群落不僅受到植被凋謝和環(huán)境因子影響，還會受當(dāng)?shù)貧夂蝾愋秃蜕鷳B(tài)系統(tǒng)影響。

2.3 不同季節(jié)土壤微生物群落組成的季節(jié)變化特征

基于Bray-Curtis距離對不同季節(jié)生產(chǎn)車間土壤微生物群落組成在ASV水平進(jìn)行非度量多維尺度分析（non-metric multidimensional scaling analysis，NMDS），結(jié)果見圖3。

由圖3a可知，細(xì)菌夏季組與冬季組中的樣本顯著分開，組間差異明顯，表明夏季的土壤微生物組成與冬季組存在顯著差異（P＜0.001）；由圖3b可知，真菌夏季組與冬季組中樣本位置距離相近，表明真菌夏季的土壤微生物組成與冬季組存在一定的相似性。結(jié)果表明，季節(jié)變化能夠顯著影響土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)和多樣性，季節(jié)變化對細(xì)菌的影響大于真菌。

圖3 夏季和冬季土壤微生物非度量多維尺度分析結(jié)果Fig.3 Non-metric multidimensional scaling analysis results of soil microorganisms in summer and winter

對生產(chǎn)車間夏季（Sum）和冬季（Win）土壤在門和屬水平TOP15的微生物類群進(jìn)行物種差異分析，結(jié)果分別見圖4和圖5。

由圖4a可知，兩個(gè)季節(jié)細(xì)菌優(yōu)勢菌門為酸桿菌門（Acidobacteriota）和變形桿菌門（Proteobacteria）。不同季節(jié)樣本間，Planctomycetota菌門和Methylomirabilota菌門相對豐度呈極顯著差異（P＜0.01），NB1-j菌門呈顯著性差異（P＜0.05），但優(yōu)勢菌門無顯著性差異（P＞0.05）。由圖5a可知，兩個(gè)季節(jié)細(xì)菌優(yōu)勢菌屬為MND1菌屬、RB41菌屬，不同季節(jié)樣本間，夏季土壤小梨形菌屬（Pirellula）和Subgroup_10菌屬相對豐度顯著高于冬季（P＜0.01，P＜0.05），而冬季土壤組中MND1菌屬、Haliangium菌屬、ADurb.Bin063-1菌屬相對豐度顯著高于夏季（P＜0.05）。

對于土壤微生物細(xì)菌群落組成研究發(fā)現(xiàn)，酸桿菌門（Acidobacteriota）普遍存在于土壤中，被認(rèn)為是土壤主要的細(xì)菌門之一[26]，湖北省神農(nóng)架山闊葉林土壤微生物結(jié)構(gòu)和組成研究[27]表明，在門分類水平上，酸桿菌門（Acidobacteriota）和變形桿菌門（Proteobacteria）是各樣地土壤優(yōu)勢菌群。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)季節(jié)土壤中酸桿菌門（Acidobacteriota）和變形桿菌門（Proteobacteria）為主要優(yōu)勢菌門，相對豐度占比較高，且夏季相對豐度高于冬季，但兩個(gè)季節(jié)并沒有顯著性差異。

由圖4b可知，子囊菌門（Ascomycota）和Mortierellomycota菌門為兩個(gè)季節(jié)絕對優(yōu)勢菌。不同季節(jié)樣本間，子囊菌門（Ascomycota）呈極顯著性差異（P＜0.01），擔(dān)子菌門（Basidiomycota）呈顯著性差異（P＜0.05）。由圖5b可知，兩個(gè)季節(jié)真菌優(yōu)勢菌屬均為被孢霉屬（Mortierella）、枝穗霉屬（Clonostachys），不同季節(jié)樣本間，夏季土壤組的新赤殼屬（Neocosmospora）、木霉屬（Trichoderma）、腐質(zhì)霉屬（Humicola）相對豐度顯著高于冬季（P＜0.05），而冬季土壤組中枝穗霉屬（Clonostachys）、馬利亞霉屬（Mariannaea）相對豐度顯著高于夏季（P＜0.01，P＜0.05）。

圖4 春夏季土壤細(xì)菌（a）和真菌（b）物種在門水平相對豐度差異Fig.4 Difference in relative abundance of soil bacterial (a) and fungal (b) species in spring and summer at phylum level

圖5 春夏季土壤細(xì)菌（a）和真菌（b）物種在屬水平相對豐度差異Fig.5 Difference in relative abundance of soil bacterial (a) and fungal (b) species in spring and summer at genus level

子囊菌門（Ascomycota）為全球范圍內(nèi)土樣的主要優(yōu)勢菌門，其次是擔(dān)子菌門（Basidiomycota）[28]。在本研究中，子囊菌門（Ascomycota）為兩個(gè)不同季節(jié)樣本間主要優(yōu)勢菌群，子囊菌門和擔(dān)子菌門都為腐生菌，是土壤有機(jī)質(zhì)、木質(zhì)素和其他底物的重要分解者，冬季土壤溫度低，水分含量高，為兩種菌生長提供能量和物質(zhì)條件[29-30]。本研究也驗(yàn)證了這一結(jié)論，冬季子囊菌門（Ascomycota）和擔(dān)子菌門（Basidiomycota）相對豐度顯著高于夏季。

2.4 環(huán)境因子對土壤微生物群落的影響

為探究影響微生物群落的主導(dǎo)因子，將土壤環(huán)境因子與樣本微生物群落進(jìn)行冗余分析（RDA），結(jié)果見圖6。由圖6a可知，細(xì)菌RDA兩軸的方差貢獻(xiàn)率分別為17.66%和24.16%，土壤環(huán)境因子共同解釋了41.82%的細(xì)菌群落組成變化。將土壤8個(gè)環(huán)境因子進(jìn)行Variation partitioning[31]分析，從而得到各因子獨(dú)立影響細(xì)菌群落的強(qiáng)度。理化因子對土壤細(xì)菌群落影響的單獨(dú)解釋率見表3。

圖6 土壤細(xì)菌（a）和真菌（b）群落與土壤環(huán)境因子冗余分析結(jié)果Fig.6 Redundancy analysis results of soil bacterial (a) and fungal (b) communities with soil environmental factors

由表3可知，pH是影響細(xì)菌群落組成變化的主要因素，解釋率為12.7%（P=0.004），其次是有機(jī)碳（P=0.016）和水分含量（P=0.018）解釋率分別為10.7%和10.4%，土壤環(huán)境因子對土壤細(xì)菌群落的影響順序?yàn)閜H＞OC＞MC＞AK＞TN＞BD＞OM＞AP。

由圖6b可知，真菌RDA兩軸的貢獻(xiàn)率分別為8.43%和16.56%，土壤環(huán)境因子共同解釋了24.99%的真菌群落組成變化。將土壤8個(gè)環(huán)境因子進(jìn)行Variation partitioning[31]分析，從而得到各理化因子獨(dú)立影響真菌群落的強(qiáng)度。理化因子對土壤真菌群落影響的單獨(dú)解釋率見表3。

表3 環(huán)境因子對微生物群落組成貢獻(xiàn)率Table 3 Contribution rate of environmental factors to microbial community composition

由表3可知，土壤OC是影響真菌群落結(jié)構(gòu)變化的主要因素，解釋率為7.6%（P=0.01），其次是pH（P=0.006）解釋率為7.5%，土壤環(huán)境因子對土壤真菌群落的影響順序?yàn)镺C＞pH＞AK＞AP＞BD＞TN＞OM＞MC。

土壤物理和化學(xué)性質(zhì)、養(yǎng)分有效性、區(qū)域氣候、土地利用方式、植被類型等眾多環(huán)境因素會對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和組成產(chǎn)生影響[32]。土壤pH值是細(xì)菌群落組成的最佳預(yù)測因子，營養(yǎng)狀況是真菌群落組成的最佳預(yù)測因子[33]。在全球尺度上，pH是影響土壤細(xì)菌群落組成和多樣性的關(guān)鍵因素[34-36]，且對于細(xì)菌的影響強(qiáng)于真菌[37]，這與本研究結(jié)果相同，理化因子對細(xì)菌群落變化解釋率的分析結(jié)果表明（表3），pH對土壤細(xì)菌群落組成變化的貢獻(xiàn)率最高，而對于真菌而言，pH是貢獻(xiàn)率第二的環(huán)境因子，原因是細(xì)菌最佳生長的pH范圍較窄，而真菌卻相反具有廣泛的生長范圍（5～9）[38-39]，所以與細(xì)菌相比，真菌與pH值的直接關(guān)系明顯較弱。

水分是微生物原生質(zhì)的重要組成部分，約占90%左右，微生物的生命活動離不開水，通過對奇瓦瓦沙漠草原土壤微生物對7年季節(jié)性降水變化的響應(yīng)表明，季節(jié)性降水變化會影響土壤真菌群落豐度，從而改變微生物群落功能動態(tài)[40]。在本研究中，水分含量是影響土壤微生物群落變化的主要因素。通過對加拿大西部七個(gè)地理氣候區(qū)和加州農(nóng)田研究發(fā)現(xiàn)，土壤水分和有機(jī)質(zhì)含量與微生物群落特征關(guān)系最為密切，是影響微生物群落組成的重要因素[32，41]，這與本研究結(jié)果一致，理化因子對細(xì)菌群落變化解釋率的分析結(jié)果表明（表3），有機(jī)碳和水分含量對細(xì)菌群落的影響僅次于pH，土壤含水量會通過對氧濃度和養(yǎng)分有效性對微生物群落造成直接或者間接的影響[42]。本研究結(jié)果表明（表3），有機(jī)碳對真菌群落變化的解釋率最高為7.6%，碳的有效性是土壤中微生物生長最常見的限制因素[43]，土壤微生物以土壤有機(jī)碳為主要碳源進(jìn)行物質(zhì)代謝并通過分泌酶參與土壤有機(jī)碳的解吸附、解聚、溶解[44]。

2.5 土壤中釀酒微生物類群探究

一直以來，微生物群落結(jié)構(gòu)組成和多樣性，一直是生態(tài)學(xué)和傳統(tǒng)發(fā)酵食品等領(lǐng)域研究的重點(diǎn)，濃香型白酒的生產(chǎn)，窖泥是基礎(chǔ)，大曲是動力，大曲樣品微生物群落受區(qū)域環(huán)境影響較大，表現(xiàn)出明顯的地域性[45]，釀造環(huán)境中的微生物可能通過大曲制曲、貯存富集網(wǎng)絡(luò)、堆積發(fā)酵遷徙進(jìn)入到釀造過程，為白酒釀造提供微生物來源[46]，在不同的環(huán)境中，各種微生物以群落的形式共同生活在特定的區(qū)域，它們之間會相互作用、相互影響[16]。

2.5.1 釀酒細(xì)菌微生物與土樣細(xì)菌微生物類群比對結(jié)果分析

通過查閱文獻(xiàn)可知[45，47]，四川省境內(nèi)濃香型白酒大曲中的主要細(xì)菌微生物類群有芽胞桿菌屬（Bacillus）、片球菌屬（Pedicoccus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）和醋桿菌屬（Acetobacter）。窖泥的好壞直接決定著濃香型白酒酒質(zhì)的優(yōu)劣，甲烷桿菌屬（Methanobacterium）、甲烷袋狀菌（Methanoculleuss）、甲烷粒菌屬（Methanocorpusculum）、甲烷短桿菌屬（Methanobrevibacter）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、梭菌屬（Clostridium）、紫單胞菌屬（Petrimonas）、互養(yǎng)單胞菌屬（Syntrophomonas）、八疊球菌屬（Sporobacter）、紅蝽?xiàng)U菌屬（Coriobacterium）、纖維素單胞菌屬（Cellulomonas）、Sediminibacter、氨基桿菌屬（Aminobacter）、棒桿菌屬（Corynebacterium）、Sporosarcina是窖泥中的主要細(xì)菌菌群，共計(jì)22個(gè)細(xì)菌屬。將上述釀酒細(xì)菌微生物與土樣中細(xì)菌微生物類群測得的結(jié)果進(jìn)行比對，結(jié)果見表4。由表4可知，夏季出現(xiàn)了7個(gè)菌屬，冬季出現(xiàn)了10個(gè)菌屬，兩個(gè)季節(jié)共出現(xiàn)了11個(gè)菌屬，其中有8個(gè)菌屬ASV數(shù)量是冬季高于夏季，瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、芽胞桿菌屬（Bacillus）為兩個(gè)季節(jié)絕對優(yōu)勢微生物。比對結(jié)果表明，冬季土壤中釀酒微生物細(xì)菌類群數(shù)量和ASV數(shù)量都顯著高于夏季。為找出可能影響土壤中釀酒微生物細(xì)菌群落組成的因子，將比對結(jié)果中ASV數(shù)量大于1 000的細(xì)菌釀酒微生物與環(huán)境因子進(jìn)行相關(guān)性矩陣分析，由圖7a可知，芽孢桿菌屬（Bacillus）和瘤胃球菌屬（Ruminococcus）都與MC呈顯著正相關(guān)，與TN呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。

圖7 土壤中優(yōu)勢釀酒微生物菌屬與理化因子相關(guān)性熱圖Fig.7 Heat map of correlation between dominant liquor-making microorganisms genera in soil and physicochemical properties of soil

表4 生產(chǎn)車間外圍土壤中夏季和冬季土壤中釀酒微生物擴(kuò)增子序列變異體數(shù)量Table 4 Number of amplicon sequence variants of soil brewing microorganisms in production workshops in summer and winter

2.5.2 釀酒真菌微生物與土樣真菌微生物類群比對結(jié)果分析

通過查閱文獻(xiàn)可知[48-49]，四川省境內(nèi)濃香型白酒大曲和窖泥中的主要真菌微生物類群有根霉屬（Rhizopus）、曲霉屬（Aspergillus）、莖點(diǎn)霉屬（Phoma）、毛孢子菌屬（Tri chosporon）、念珠菌屬（Candida）、熱孢菌屬（Thermoascus）、柳條霉屬（Wickerhamomyces）、青霉屬（Penicillium）、嗜熱絲孢菌屬（Thermomyces）、德巴利酵母屬（Debaryomyces）、酵母屬（Saccharomyces）、馬拉色菌屬（Malassezia）、毛霉屬（Mucor）、Davidiella、Wallemia、毒枝孢菌屬（Toxicocla dosporium）、鐮刀菌屬（Fusarium）、畢赤酵母屬（Pichia）、枝孢菌屬（Cladosporium）、Xeromyces共計(jì)20個(gè)真菌屬。將上述釀酒真菌微生物與土樣中真菌微生物類群測得的結(jié)果進(jìn)行比對，結(jié)果見表4，由表4可知，夏季出現(xiàn)了14個(gè)真菌屬，冬季出現(xiàn)了18個(gè)菌屬，有10個(gè)菌屬夏季ASV數(shù)量高于冬季，鐮刀菌屬（Fusarium）、曲霉屬（Aspergillus）、枝孢菌屬（Cladosporium）為兩個(gè)季節(jié)的絕對優(yōu)勢菌群，冬季鐮刀菌屬（Fusarium）的ASV數(shù)量相比夏季來說稍有上升，而曲霉屬（Aspergillus）和枝孢菌屬（Cladosporium）卻呈現(xiàn)相反的趨勢，表現(xiàn)為夏季ASV數(shù)量顯著高于冬季。比對結(jié)果表明，冬季土壤中釀酒微生物真菌類群數(shù)量高于夏季，但夏季有10個(gè)菌屬的ASV數(shù)量高于冬季，冬季釀酒真菌微生物的多樣性高于夏季，但是微生物的豐富度卻是夏季優(yōu)于冬季。為找出可能影響土壤中釀酒微生物真菌群落組成的因子，將比對結(jié)果中ASV數(shù)量＞1 000的真菌釀酒微生物與環(huán)境因子進(jìn)行相關(guān)性矩陣分析，結(jié)果見圖7。由圖7b可知，鐮刀菌屬（Fusarium）與pH、BD、OM、AP呈顯著正相關(guān)，與MC、TN、OC、AK呈顯著負(fù)相關(guān)，曲霉屬（Aspergillus）、枝孢菌屬（Cladosporium）、青霉屬（Penicillium）、莖點(diǎn)霉屬（Phoma）和鐮刀菌屬（Fusarium）都與pH呈顯著性正相關(guān)關(guān)系，與MC、BD、TN呈顯著性負(fù)相關(guān)關(guān)系，說明土壤pH、MC、BD、TN含量含量是土壤中釀酒真菌微生物的主要共同影響因子。

2.5.3 分析討論

關(guān)于釀酒微生物，從微生物類群多樣性和豐富度來講，冬季細(xì)菌微生物多樣性和豐富度都高于夏季，這與生產(chǎn)車間外圍總的土壤微生物變化趨勢是一致的（見表2，圖2），然而真菌釀酒微生物卻出現(xiàn)相反的趨勢，冬季釀酒真菌微生物的多樣性高于夏季，但是微生物的豐富度卻是夏季優(yōu)于冬季。一方面含水量過高會使土壤含氧量降低，從而選擇兼性和專性厭氧微生物，而土壤含水量過低，土壤干燥會使微生物的活性降低，從而選擇真菌和孢子[42]，另一個(gè)原因可能是冬季是生產(chǎn)的繁忙期，生產(chǎn)車間空氣中釀酒相關(guān)微生物濃度較高，通過生產(chǎn)車間內(nèi)外空氣流動而在土壤中富集。從微生物相對豐度來講，絕大多數(shù)細(xì)菌釀酒微生物冬季都高于夏季，優(yōu)勢微生物也呈相同趨勢，這與生產(chǎn)園區(qū)土壤微生物的整體趨勢是一致的，但是真菌卻出現(xiàn)相反的趨勢，除了優(yōu)勢菌群鐮刀菌屬（Fusarium）在冬季相對豐度稍高之外，其余絕大數(shù)菌群相對豐度都是冬季要低于夏季。在寒冷地區(qū)，從夏季到冬季，微生物的豐度可能會減少[50-52]，溫度降低可能通過限制土壤水分和養(yǎng)分的有效性直接或間接殺死微生物[53-54]，此外，土壤中微生物之間存在著互生、共生、寄生、拮抗等關(guān)系，而存活下來的微生物適應(yīng)性物種增加了其優(yōu)勢[53]。釀酒外環(huán)境一方面受當(dāng)?shù)丨h(huán)境因子的影響，同時(shí)與生產(chǎn)也具有一定的關(guān)聯(lián)性，微生物的最適性指微生物所具有的各種最適形態(tài)和功能，是在長期進(jìn)化過程中自然選擇的結(jié)果。環(huán)境中釀造微生物會隨著時(shí)間和生態(tài)環(huán)境的變化從而發(fā)生突變和選擇，可能對釀酒等環(huán)境變化有更好的調(diào)節(jié)作用的方式[55]，從而在白酒生產(chǎn)過程中逐漸形成了一個(gè)靠自然給予、異常復(fù)雜并與環(huán)境相適應(yīng)的微生物區(qū)系[16]。

3 結(jié)論

本研究通過Illumina平臺的Miseq高通量測序技術(shù)對四川省遂寧市沱牌舍得生態(tài)釀酒產(chǎn)業(yè)園區(qū)內(nèi)生產(chǎn)車間外圍夏季和冬季土壤對比分析，結(jié)果表明，土壤細(xì)菌和真菌微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性有顯著的季節(jié)性變化，冬季土壤微生物總數(shù)量顯著高于夏季，季節(jié)變化對細(xì)菌的影響大于真菌，pH是影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化的主要環(huán)境因子，有機(jī)碳則是影響真菌群落結(jié)構(gòu)的主要環(huán)境因子。在土壤中發(fā)現(xiàn)有釀酒相關(guān)微生物的存在，細(xì)菌有11個(gè)屬，真菌有18個(gè)屬，其中細(xì)菌相對豐度較高的是瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、芽孢桿菌屬（Bacillus），真菌相對豐度較高是鐮刀菌屬（Fusarium）、曲霉屬（Aspergillus）、枝孢菌屬（Cladosporium），釀酒車間外圍的微生物群落結(jié)構(gòu)和組成可能受到季節(jié)和生產(chǎn)周期變化的影響。