珍稀食用菌紫陀螺菌三峽區(qū)域資源調(diào)查與化學(xué)成分分析*

譚愛(ài)華，李方橋**，鄧夢(mèng)勻，胡飛飛

（1.湖北三峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖北 宜昌 443000；2.三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 宜昌 443002）

紫陀螺菌 [Gomphus purpuraceu(Iwade)Yokoyamas]隸屬于擔(dān)子菌亞門(mén)（Basidiomycotina） 非褶菌目（Aphyllophorales） 陀螺菌科（Gomphaceae） 陀螺菌屬（Gomphus）[1]。作為一種珍稀食用菌，紫陀螺菌味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，且含有蛋白質(zhì)、維生素、糖類以及微量元素等多種營(yíng)養(yǎng)成分，同時(shí)具有易保鮮、易加工等特點(diǎn)，在食品和藥品領(lǐng)域具有很大的開(kāi)發(fā)價(jià)值[2]。但是目前國(guó)內(nèi)對(duì)紫陀螺菌的研究報(bào)道甚少，據(jù)現(xiàn)有對(duì)紫陀螺菌子實(shí)體化學(xué)成分的研究報(bào)道[3]，已從紫陀螺菌子實(shí)體中分離得到6種化合物，分別為 ergosta-4，6，8 （14），22-tetraen-3-one、4-hydroxy-4-methylpentan-2-one、5，8-epidioxyergosta-6，22-dien-3-ol、methyl 1H-indole-3-carboxylate、3β，5α，9α-trihydroxyergosta-7，22-diene-6-one、purpuracolide?；谏鲜霰尘?，對(duì)紫陀螺菌的形態(tài)特征、生長(zhǎng)環(huán)境及分布進(jìn)行了初步調(diào)查。現(xiàn)將紫陀螺菌三峽區(qū)域的資源調(diào)查及其化學(xué)成分的提取、分離與鑒定情況報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

紫陀螺菌子實(shí)體來(lái)源于中國(guó)三峽地區(qū)西陵峽河谷區(qū)，由珍稀食用菌紫陀螺菌菌種繁育技術(shù)研究課題組保存。

1.2 試驗(yàn)儀器

FA2204B（0.1 mg）電子分析天平，上海越平科學(xué)儀器有限公司；N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，日本EYELA儀器公司；Bruker-ARX-400核磁共振譜儀，瑞士Bruker公司；Waters高效液相色譜儀1525EF，美國(guó)WATERS；Dionex高效液相色譜儀Ultimate 3000，美國(guó)Dionex；制備型色譜柱： YMC-Pack ODS-A C18，5 Y，100?，100?C-Pa；薄層層析用硅膠GF254：200目～300目柱層層析硅膠，青島海洋化工廠生產(chǎn)；Sephadex LH 20葡聚糖凝膠，Merk公司產(chǎn)品；甲醇、石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷均為分析純。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 紫陀螺菌三峽區(qū)域的資源調(diào)查

對(duì)西陵峽河谷區(qū)紫陀螺菌資源現(xiàn)狀進(jìn)行了走訪和實(shí)地調(diào)查，觀察并記錄紫陀螺菌的地理分布、生長(zhǎng)環(huán)境及主要形態(tài)特征。此外，在紫陀螺菌生長(zhǎng)地宜昌市兆吉坪村八組林地進(jìn)行定點(diǎn)觀測(cè)，選擇了3個(gè)樣地，觀測(cè)其地形、海拔、植被、氣候、土壤等環(huán)境因子與紫陀螺菌生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)系。

1.3.2 化學(xué)成分的提取與分離

取干燥的紫陀螺菌子實(shí)體粉末160 g，用3倍體積甲醇浸提，共3次，每次12 h。提取液合并后減壓濃縮得到總浸膏10 g，將浸膏在水中充分混懸后，分別用石油醚（料液比1∶2）、二氯甲烷（料液比1∶3）、乙酸乙酯（料液比1∶2） 等有機(jī)溶劑萃??；減壓濃縮后得到石油醚萃取相2.304 3 g、二氯甲烷萃取相0.716 0 g、乙酸乙酯萃取相0.272 0 g、水相6.844 8 g。經(jīng)HPLC分析，二氯甲烷和水相片段化學(xué)成分較為單一，適合快速分離鑒定。

二氯甲烷萃取浸膏經(jīng)葡聚糖凝膠柱層析，二氯甲烷∶甲醇為洗脫劑梯度洗脫，得到23個(gè)洗脫片段（GD1～GD23），經(jīng)TLC分析，合并洗脫片段GD10～GD15和GD16～GD23，分別標(biāo)記為GD10（621 mg）和GD16（351.3 mg）。GD10經(jīng)正相硅膠柱層析和薄層硅膠層析分離純化，得到純度較高的片段G10-1，為化合物1。GD16經(jīng)正相硅膠柱層析分離純化得到洗脫片段1～21，經(jīng)TLC分析，合并洗脫片段3～5，標(biāo)記為G16-3，經(jīng)HPLC分離純化（HPLC條件：甲醇10%，波長(zhǎng)254 nm；流速2 mL·min-1；洗脫時(shí)間20 min），得到純度較高的片段G16-3-2，為化合物2。

水相浸膏以甲醇溶液（0～100%）為洗脫劑，分段洗脫，經(jīng)反相硅膠柱層析分離，純化得到40個(gè)洗脫片段（GOP-Z-W-1～GOP-Z-W-40）；后經(jīng)HPLC分析（HPLC條件：10%～100%乙腈溶液梯度洗脫40 min，100%乙腈洗脫10 min，波長(zhǎng)254 nm；流速1 mL·min-1），合并得到純度較高的片段GOP-Z-W-1，為化合物3，片段GOP-Z-W-18經(jīng)HPLC制備得到化合物4。

將紫陀螺菌菌株進(jìn)行適宜條件發(fā)酵，發(fā)酵液用乙酸乙酯萃取，減壓濃縮得到乙酸乙酯萃取相。乙酸乙酯萃取相經(jīng)HPLC（以24%甲醇30 min變梯度到80%甲醇為洗脫條件，變梯度制備）分離，得到化合物5。

1.3.3 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

通過(guò)核磁共振譜儀對(duì)化合物1（G10-1）、化合物2（G16-3-2）、化合物3（GOP-Z-W-1）、化合物4（GOP-Z-W-18）、化合物5進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，分析得到各化合物的結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 分布范圍和生長(zhǎng)環(huán)境

紫陀螺菌主要分布在西陵峽南岸、海拔400 m～800 m的山脊及山腰中（碑埡、鮑家樁、兆吉坪一帶）。子實(shí)體為單生、叢生或者群生于林中地，且大多呈帶狀分布，長(zhǎng)達(dá)數(shù)米。易生長(zhǎng)在直徑20 cm以上的青岡櫟、黃櫨樹(shù)或馬尾松樹(shù)蔸附近。

2.2 發(fā)生季節(jié)與氣候特征

紫陀螺菌子實(shí)體的發(fā)生季節(jié)一般為每年的6月下旬～9月中旬（最遲可延至11月上旬），前后共發(fā)生三潮～四潮，高峰期為7月上中旬。子實(shí)體生長(zhǎng)期間的日平均氣溫為20℃～28℃，空氣相對(duì)濕度為75%～85%。其發(fā)生量還與降雨密切相關(guān)，若長(zhǎng)期干旱或下雨，發(fā)生量較少；晴雨交替，發(fā)生量較大。紫陀螺菌子實(shí)體生長(zhǎng)速度緩慢，成熟期15 d～20 d，若光線較強(qiáng)其生長(zhǎng)速度更慢。由此可見(jiàn)，紫陀螺菌子實(shí)體易生長(zhǎng)在光線陰暗且潮濕的林地。

2.3 定點(diǎn)觀測(cè)結(jié)果

實(shí)地采樣的紫陀螺菌子實(shí)體見(jiàn)圖1。

圖1 紫陀螺菌子實(shí)體Fig.1 Fruit body of Gomphus purpuraceus

紫陀螺菌生長(zhǎng)地多為闊葉混交林（以青岡櫟、黃櫨樹(shù)為主），林高7 m左右，林間郁閉度70%～80%。林地土壤為碳酸鹽類黃棕壤，偏酸性，pH 6.0左右，可能與其他微生物的活動(dòng)、共生植物根系的分布及土壤松散多石、透氣性較好有關(guān)。

2.4 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定與分析

2.4.1 鄰苯二甲酸-雙（2’-乙基庚基） 酯

化合物1（G10-1） 為鄰苯二甲酸-雙（2’-乙基庚基）酯[phthalic acid-bis（2’-ethyl heptanyl）easter]，黃色油狀物，化學(xué)式為C26H42O4，其化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖2。

圖2 化合物1的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.2 Chemical structures of compound 1

化合物1的核磁共振圖譜數(shù)據(jù)如下。

1）1H-NMR（400 MHz，CDCl3）的化學(xué)位移（δ）：7.71 （2H，dd，J=3.2，5.6 Hz，H-3，6），7.53（2H，dd，J=3.2，5.6 Hz，H-4，5），4.30（4H，m，H-1′，1″），1.72 （2H，m，H-2′，2″），1.39 （20H，m，10×CH2），0.96（6H，t，J=7.6 Hz，H-b′，b″），0.90（6H，t，J=6.4 Hz，H-7′，7″）。

2）13C-NMR（100 MHz，CDCl3）的化學(xué)位移（δ）：167.7（2 × C=0），132.5（C-1，2），130.9（C-3，6），128.8 （C-4，5），68.1 （C-1′，1″），38.7 （C-2′，2″），30.4 （C-3′，3″），29.7 （C-4′，4″），28.9 （C-5′，5″），23.7 （C-6′，6″），23.0 （C-a′，a″），14.1（C-7′，7″），11.0（C-b′，b″）。

根據(jù)G10-1的碳譜、氫譜數(shù)據(jù)，與參考文獻(xiàn)[5]報(bào)道的譜圖數(shù)據(jù)基本吻合，由此確定化合物1為鄰苯二甲酸-雙（2’-乙基庚基）酯。

2.4.2 鄰苯二甲酸-二（2-乙基己基）酯

化合物2（G16-3-2） 為鄰苯二甲酸-二（2-乙基己基）酯[Bis（2-ethlhexyl）phthalate]，又稱鄰苯二甲酸二辛酯，無(wú)色透明液體，化學(xué)式為C24H38O4，其化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖3。

圖3 化合物2的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.3 Chemical structures of compound 2

化合物2的核磁共振圖譜數(shù)據(jù)如下。

1）1H-NMR（400 MHz，CDCl3）的化學(xué)位移（δ）：7.72 （2H，dd，J=3.4，5.7 Hz，H-2），7.52（2H，dd，J=3.4，5.7 Hz，H-3），4.26（4H，d，J=6.5 Hz，H-1′），1.77 （2H，m，H-2′），1.26 （16H，m，H-3′，4′，5′，7′），0.94 （6H，t，J=7.4 Hz，H-8′），0.88（6H，t，J=7.8Hz，H-6′）。

2）13C-NMR（100 MHz，CDCl3）的化學(xué)位移（δ）：167.8（CO），132.4（C-1），130.9（C-3），128.8 （C-2），68.2 （C-1′），38.8 （C-2′），30.4（C-3′），29.0（C-4′），23.8（C-7′），23.0（C-5′），14.0（C-6′），11.0（C-8′）。

根據(jù)G-16-3-2的碳譜、氫譜數(shù)據(jù)，與參考文獻(xiàn)[4]報(bào)道的譜圖數(shù)據(jù)基本吻合，由此確定化合物2為鄰苯二甲酸-二（2-乙基己基） 酯。

2.4.3 D-半乳糖醇

化合物3（GOP-Z-W-1） 為D-半乳糖醇（D-galactitol），無(wú)色結(jié)晶粉末，化學(xué)式為C6H14O6，分子量182.17，其化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖4。

圖4 化合物3的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.4 Chemical structures of compound 3

核磁共振波譜分析數(shù)據(jù)如下。

1）1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）的化學(xué)位移（δ）：3.36（2H，m，2，5-CH），3.49（2H，m，3，4-CH），3.64（4H，m，l，6-CH2），4.18（2H，d，3，4-OH），4.29 （2H，t，2，5-OH），4.42（2H，d，1，6-OH）。

2）13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）的化學(xué)位移 （δ）：64.3（C-1，6），70.0（C-2，5），71.8（C-3，4）。

根據(jù)GOP-Z-W-1的碳譜、氫譜數(shù)據(jù)，與參考文獻(xiàn)[6]報(bào)道的譜圖數(shù)據(jù)基本吻合，由此確定化合物3水相GOP-Z-W-1為D-半乳糖醇。

2.4.4 腺苷

化合物 4（GOP-Z-W-18） 為腺苷 （Adenosine），又稱9-β-D-呋喃核糖基腺嘌呤，白色或類白色結(jié)晶性粉末，化學(xué)式為C10H13N5O4，其化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖5。

圖5 化合物4的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.5 Chemical structures of compound 4

化合物4的核磁共振波譜分析數(shù)據(jù)如下。

1）1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）的化學(xué)位移（δ）：8.35 （1H，s，H-8），8.13 （1H，s，H-2），5.88（1H，d，J=6.4 Hz，H-1′），4.62（1H，d，J=6.0 Hz，H-2′），4.14 （1H，dd，J=2.8 Hz，J=4.8 Hz，H-3′），3.96 （1H，dd，J=12.8 Hz，J=26.4 Hz），3.68 （1H，dd，J=13.6 Hz，J=28.4 Hz，H-5′a），3.56 （1H，dd，J=3.6 Hz，J=7.9 Hz，H-5′b）。

2）13C-NMR（150 MНz，DМSО-d6）的化學(xué)位移 （δ）：156.7（С-6），152.9（С-2），149.6（C-4），140.4 （C-8），119.8 （C-5），88.4 （C-1′），86.4（C-4′），73.9（C-2′），71.1（C-3′），62.1（C-5′）。

根據(jù)GOP-Z-W-18的碳譜、氫譜數(shù)據(jù)，與參考文獻(xiàn)[7]報(bào)道的譜圖數(shù)據(jù)基本吻合，由此確定化合物4水相GOP-Z-W-18為腺苷。

2.4.5 吲哚-3-羧酸甲酯

化合物5為吲哚-3-羧酸甲酯（indole-3-carboxylate methyl ester），又名3-吲哚甲酸甲酯，白色結(jié)晶（甲醇），化學(xué)式為C10H9NO2，分子量175.184，其化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖6。

圖6 化合物5的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.6 Chemical structures of compound 5

核磁共振波譜分析數(shù)據(jù)如下。

1）1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）的化學(xué)位移（δ）：11.97（1H，brs，1-NH），8.07（1H，s，H-2），7.99（1H，d，J=6.9 Hz，H-7），7.48（1H，d，J=6.9 Hz，H-4），7.19 （2H，m，H-5，6）。

2）13C-NMR（125 MHz，DMSO-d6）的化學(xué)位移 （δ）：165.2（C=O），136.8（C-2），132.9（C-8），126.1 （C-9），122.8 （C-4），121.1 （C-6），120.87（C-5），112.8（C-7），106.8（C-3），51.1（-OCH3）。

根據(jù)化合物5的碳譜、氫譜數(shù)據(jù)，與參考文獻(xiàn)[8]報(bào)道的譜圖數(shù)據(jù)基本吻合，由此確定化合物5為吲哚-3-羧酸甲酯。

3 結(jié)論與討論

紫陀螺菌為單生或叢生，菌肉淡紫色，子實(shí)體表呈紫色，長(zhǎng)橢圓形[9]。其生長(zhǎng)環(huán)境潮濕，光線陰暗，常生長(zhǎng)在青岡櫟等附近[10]。三峽地區(qū)山高林茂，地形復(fù)雜，氣候溫和適宜，是紫陀螺菌良好的生長(zhǎng)地[11]。紫陀螺菌的生長(zhǎng)速度慢、周期長(zhǎng)，需要適宜的環(huán)境才能大規(guī)模培養(yǎng)優(yōu)質(zhì)菌種。此次在三峽地區(qū)調(diào)查其生長(zhǎng)環(huán)境及分布，為以后紫陀螺菌的人工培養(yǎng)及開(kāi)發(fā)利用提供方向，對(duì)提高珍稀野生食用菌產(chǎn)量、品質(zhì)及保護(hù)真菌資源具有重要意義。紫陀螺菌含有蛋白質(zhì)、維生素、微量元素等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[12]，可充分利用其食用價(jià)值，提高三峽地區(qū)農(nóng)民的經(jīng)濟(jì)收入。國(guó)內(nèi)外對(duì)紫陀螺菌化學(xué)成分的研究較少，作者對(duì)紫陀螺菌的化學(xué)成分進(jìn)行深入研究，得到化合物鄰苯二甲酸-雙（2’-乙基庚基） 酯、鄰苯二甲酸-二（2-乙基己基） 酯、D-半乳糖醇、腺苷、吲哚-3-羧酸甲酯。紫陀螺菌含有的化學(xué)成分中含有豐富的藥理活性[13]，加大對(duì)其化學(xué)成分的研究，提高提取工藝的精簡(jiǎn)性，為開(kāi)發(fā)藥理性保健品及研制出新的抗癌抑菌藥物提供了重要依據(jù)。