2種微米級(jí)聚苯乙烯顆粒對(duì)菘藍(lán)幼苗生長(zhǎng)及土壤群落結(jié)構(gòu)的影響

楊雅杰，褚玲瓏，宋新山，趙曉祥

東華大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 201620

微塑料(microplastics)是指粒徑<5 mm的塑料顆粒和碎片，目前對(duì)微塑料的研究已逐步從海洋環(huán)境轉(zhuǎn)向土壤環(huán)境[1]，Boyle和?rmeci[2]的研究表明陸地中微塑料的聚集量有可能達(dá)到海洋中的4倍～23倍，微塑料難降解會(huì)在土壤中長(zhǎng)期存在，此外還會(huì)釋放增塑劑等污染物[3]，微塑料對(duì)土壤微生物的運(yùn)輸、代謝等均有影響[4-5]。尤其是微塑料可以進(jìn)入食物鏈[6]，從而對(duì)作物和人體健康產(chǎn)生威脅。塑料地膜覆蓋和污泥的土地利用是土壤中微塑料最主要的兩大來源[7]。聚苯乙烯被廣泛應(yīng)用于各行各業(yè)，但其殘余價(jià)值低，不易循環(huán)再生，會(huì)對(duì)環(huán)境以及其中的動(dòng)植物和微生物造成極大的影響[8]。

納米塑料已被證明可以穿透植物細(xì)胞壁[9]，每種植物對(duì)微塑料的吸收取決于多種因素，如根體積、密度和表面積，木質(zhì)部體積和表面積、汁液酸堿度、蒸騰作用、細(xì)胞質(zhì)和液泡的酸堿度[10-11]。目前一些與微塑料尺寸、形狀和表面官能團(tuán)相似的工程碳質(zhì)納米顆粒的研究已經(jīng)在植物中開展[12]，研究表明微塑料可能是通過胞間連絲的內(nèi)吞作用、離子轉(zhuǎn)運(yùn)通道、載體蛋白或水通道蛋白以及土壤碳[13]或根際分泌物的調(diào)節(jié)進(jìn)入植物體內(nèi)[9, 14]。菘藍(lán)是十字花科草本植物，俗稱“板藍(lán)根”，有很好的清熱解毒功效，被廣泛使用在醫(yī)療領(lǐng)域。目前關(guān)于聚苯乙烯納米塑料對(duì)菘藍(lán)的影響探究較少。本研究擬通過盆栽實(shí)驗(yàn)研究聚苯乙烯微塑料(PS-NPs)對(duì)菘藍(lán)幼苗的生長(zhǎng)特性、生理指標(biāo)的影響，及土培植物根際土壤微生物群落對(duì)PS-NPs脅迫的響應(yīng)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 供試材料

供試聚苯乙烯微塑料(PS-NPs)購(gòu)買自東莞市樟木頭廣弘高分子材料公司，對(duì)材料進(jìn)行掃描電子顯微鏡(SEM)表征，其粒徑分別為(775.90±61.66) nm (S組)與(50.07±1.29) μm (B組)，S組PS-NPs表面較為光滑，B組PS-NPs顆粒表面粗糙程度較高(圖1)。2種粒徑的供試材料都分布均勻，且形貌規(guī)則、無雜質(zhì)，純度較高，故視為純品。實(shí)驗(yàn)前將2種微粒進(jìn)行超聲處理(33 kHz，1 h)，使其均勻分散在超純水中。

圖1 2種聚苯乙烯微塑料(PS-NPs)掃描電子顯微鏡(SEM)表征圖注：(a) S組PS-NPs(放大×100 k)；(b) B組PS-NPs(放大×5.00 k)；(c). S組PS-NPs(放大×20.00 k)；(d) B組PS-NPs(放大×15.00 k)。Fig. 1 Scanning electron microscope (SEM) characterization images of polystyrene microplastics (PS-NPs)Note: (a) S group PS-NPs (×100 k); (b) B group PS-NPs (×5.00 k); (c) S group PS-NPs (×20.00 k); (d) B group PS-NPs (×15.00 k).

供試菘藍(lán)(Isatisindigotica)種子購(gòu)自安國(guó)市萬草同源苗木花卉有限公司，挑選大小均一，顆粒飽滿的種子用體積分?jǐn)?shù)為10%的次氯酸鈉溶液浸泡10 min后沖洗3～5次，再置于超純水中浸泡30 min，用濾紙吸干表面水份后均勻放置在土樣中，種子埋深約為2 cm，用霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液保持土壤含水量60%左右，模擬室溫條件(26±2) ℃，發(fā)芽期間避光培養(yǎng)，發(fā)芽后的生長(zhǎng)階段采用光譜植物生長(zhǎng)燈對(duì)植物進(jìn)行光照(12 h∶12 h；輻射量(30±5) W·m-2)。

1.2 供試土壤

土壤采集于上海市松江區(qū)農(nóng)田的表層土(采樣深度約為20～25 cm)，除去可見植物殘?jiān)筮^2 mm篩，采用常規(guī)方法[15]測(cè)定土壤理化性質(zhì)，結(jié)果如表1所示。

表1 供試土壤理化性質(zhì)Table 1 Physical and chemical properties of experimental soil

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

針對(duì)2種粒徑的PS-NPs分別設(shè)置4個(gè)濃度的污染土壤(10、100、500和1 000 mg·kg-1)(標(biāo)號(hào)為B10、B100、B500、B1000；S10、S100、S500、S1000)，以不添加PS-NPs的土壤為對(duì)照(CK)。將處理后的菘藍(lán)種子播種在配制好PS-NPs土樣里，對(duì)照實(shí)驗(yàn)中將種子固定在不含PS-NPs的土壤中，每組重復(fù)3次。

1.3.1 種子發(fā)芽實(shí)驗(yàn)

發(fā)芽試驗(yàn)每盆設(shè)置300 g土，每盆播種種子50粒，當(dāng)胚芽均超過2 mm時(shí)視為發(fā)芽，連續(xù)3 d沒有新芽時(shí)視為發(fā)芽結(jié)束。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后計(jì)算種子發(fā)芽率。

1.3.2 植株表型實(shí)驗(yàn)

菘藍(lán)種子發(fā)芽后繼續(xù)培養(yǎng)，共暴露70 d，培養(yǎng)結(jié)束后將植株從土壤中小心取出，用自來水沖洗后再用去離子水沖洗3次，濾紙擦干后擺放整齊進(jìn)行拍照，用image J軟件測(cè)量不同處理下菘藍(lán)的株高，稱量鮮質(zhì)量，再將新鮮植株置于65 ℃烘箱24 h后取出，稱量質(zhì)量得到干質(zhì)量數(shù)據(jù)。計(jì)算各處理下的幼苗含水率和抑制率。

(1)

(2)

1.3.3 指標(biāo)測(cè)定

生長(zhǎng)試驗(yàn)每盆設(shè)置500 g土，待菘藍(lán)種子長(zhǎng)出四片真葉后再暴露14 d收樣。取菘藍(lán)葉片用去離子水再?zèng)_洗3次后用濾紙拭干表面水份，剩余葉片置于-80 ℃冰箱保存待測(cè)。

用電導(dǎo)儀測(cè)定外滲液的電解質(zhì)含量，以表征脅迫對(duì)植物細(xì)胞膜的傷害。可溶性蛋白測(cè)定用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法[16]、超氧陰離子含量測(cè)定參考高俊鳳[16]等的方法，丙二醛(MDA)含量測(cè)定用硫代巴比妥酸法[17]。葉片抗氧化酶活性測(cè)定[18]中，SOD活性測(cè)定用氮藍(lán)四唑法，POD活性測(cè)定用愈創(chuàng)木酚分光光度法，CAT活性測(cè)定用高錳酸鉀滴定法。

分別取PS-NPs處理下的土壤(S100、S1000和B100、B1000)及不添加塑料微粒的空白組(CK)土壤，委托上海派森諾生物科技有限公司在Illumina平臺(tái)對(duì)群落DNA片段進(jìn)行二代雙端(Paired-end)測(cè)序，測(cè)序引物為F: ACTCCTACGGGAGGCAGCA；R: TCGGACTACHVGGGTWTCTAAT，測(cè)序區(qū)域?yàn)?6S_V3V4，選用Silva_132數(shù)據(jù)庫，原始數(shù)據(jù)以FASTQ格式保存，進(jìn)行DADA2序列去噪和Vsearch聚類，獲得OTU代表序列后對(duì)其長(zhǎng)度分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，再進(jìn)行物種分類學(xué)注釋。

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均進(jìn)行單因素方差分析，并用誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)誤差，用Microsoft Excel和SPSS13.0進(jìn)行處理，用Origin 2018作圖，圖中所示數(shù)據(jù)均為3組平行實(shí)驗(yàn)的平均值。

2 結(jié)果(Results)

2.1 不同濃度聚苯乙烯對(duì)菘藍(lán)種子發(fā)芽率和生長(zhǎng)表型的影響

2.1.1 不同濃度聚苯乙烯對(duì)菘藍(lán)種子發(fā)芽率的影響

種子萌發(fā)是指種子從吸脹作用開始的一系列的生理過程，了解種子的萌發(fā)情況對(duì)播種后早出苗、出全苗極為重要。在為期25 d的發(fā)芽過程里，2種PS-NPs添加下菘藍(lán)種子的發(fā)芽率如圖2所示?？梢奝S-NPs對(duì)菘藍(lán)種子的發(fā)芽有顯著促進(jìn)作用，10 mg·kg-1B組PS-NPs對(duì)發(fā)芽的促進(jìn)作用最明顯，其發(fā)芽率比CK高約30.00%。1 000 mg·kg-1脅迫濃度下S組、B組之間對(duì)發(fā)芽的促進(jìn)無顯著差異，約比CK高出20.00%。

圖2 PS-NPs對(duì)菘藍(lán)種子發(fā)芽率的影響注：字母不同表示差異顯著，P<0.05。Fig. 2 The germination rate of Isatis indigotica seeds treated with different particle sizes of PS-NPsNote: Different letters indicate significant differences, P<0.05.

實(shí)驗(yàn)中菘藍(lán)種子日發(fā)芽情況如圖3所示，將發(fā)芽過程分為初(3～9 d)、中(11～19 d)、后(19～25 d)3個(gè)時(shí)期。與CK相比，S處理中發(fā)芽初期1 000 mg·kg-1的促進(jìn)作用明顯，中期10 mg·kg-1的處理組發(fā)芽數(shù)最多；B處理組中發(fā)芽初期PS-NPs對(duì)發(fā)芽率影響不明顯，中后期10、100、1 000 mg·kg-1處理下種子的發(fā)芽數(shù)接近，均高于CK組。

圖3 不同PS-NPs處理下菘藍(lán)種子日發(fā)芽情況注：(a)S組PS-NPs處理下菘藍(lán)的日發(fā)芽數(shù)；(b)B組PS-NPs處理下菘藍(lán)的日發(fā)芽數(shù)；字母不同表示差異顯著，P<0.05。Fig. 3 Daily germination of Isatis indigotica seeds treated with different PS-NPs Note: (a) Daily germination numbers of Isatis indigotica with treat-S PS-NPs; (b) Daily germination numbers of Isatis indigotica with treat-B PS-NPs; different letters indicate significant differences, P<0.05.

2.1.2 不同濃度聚苯乙烯對(duì)菘藍(lán)植株株高、質(zhì)量和含水率的影響

株高和鮮質(zhì)量、干質(zhì)量是植物學(xué)形態(tài)調(diào)查的基本要素。如表2所示，不同濃度S處理均促進(jìn)了幼苗株高、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量，隨著脅迫濃度的升高，促進(jìn)效果減弱；如表3所示，100、500和1 000 mg·kg-1的B處理抑制了幼苗株高，但1 000 mg·kg-1處理對(duì)鮮質(zhì)量的促進(jìn)率低于500 mg·kg-1；2種PS-NPs對(duì)含水率都幾乎無影響。

表2 S組PS-NPs處理對(duì)菘藍(lán)幼苗生物量的影響Table 2 Effects of S group PS-NPs treatments on biomass of Isatis indigotica seedlings

表3 B組PS-NPs處理對(duì)菘藍(lán)幼苗生物量的影響Table 3 Effects of B group PS-NPs treatments on biomass of Isatis indigotica seedlings

2.2 不同濃度聚苯乙烯對(duì)菘藍(lán)幼苗抗逆性的影響

2.2.1 不同濃度聚苯乙烯對(duì)菘藍(lán)葉片細(xì)胞膜傷害率的影響

由圖4可知，處理組植株葉片細(xì)胞膜傷害率均顯著高于CK，且S處理對(duì)菘藍(lán)葉片細(xì)胞膜的傷害率均大于B處理，10、100和500 mg·kg-1的S組PS-NPs比B組對(duì)細(xì)胞膜的傷害率分別高出11.48%、5.55%和5.24%，此外隨著濃度的增加微塑料對(duì)細(xì)胞膜的傷害率逐步增加，當(dāng)PS-NPs的濃度為1 000 mg·kg-1時(shí)，S組、B組對(duì)細(xì)胞膜的傷害率達(dá)到最大，分別為76.97%和76.30%，約為CK的2.53倍和2.51倍。

圖4 PS-NPs對(duì)菘藍(lán)葉片細(xì)胞膜傷害率的影響注：字母不同表示差異顯著，P<0.05。Fig. 4 Effects of PS-NPs on cell membrane damage rate of Isatis indigotica leavesNote: Different letters indicate significant differences, P<0.05.

2.2.2 不同濃度聚苯乙烯對(duì)菘藍(lán)葉片可溶性蛋白含量的影響

可溶性蛋白是重要的調(diào)節(jié)物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其積累可以提高細(xì)胞的保水能力，對(duì)細(xì)胞的生命物質(zhì)及生物膜起到保護(hù)作用。如圖5所示，10、100和500 mg·kg-1不同PS-NPs脅迫下的菘藍(lán)葉片可溶性蛋白含量與CK無顯著差異；PS-NPs濃度為1 000 mg·kg-1時(shí)S處理可溶性蛋白含量為2.54 mg·g-1，B處理為2.90 mg·g-1，分別比CK高出29.81%和48.25%。

圖5 PS-NPs對(duì)菘藍(lán)葉片可溶性蛋白含量的影響注：字母不同表示差異顯著，P<0.05。Fig. 5 Effects of PS-NPs on soluble protein content of Isatis indigotica leavesNote: Different letters indicate significant differences, P<0.05.

2.2.3 不同濃度聚苯乙烯對(duì)菘藍(lán)葉片丙二醛含量的影響

如圖6所示，與CK相比PS-NPs脅迫下菘藍(lán)葉片的MDA含量顯著升高，并與脅迫濃度呈正相關(guān)，在0～500 mg·kg-1濃度范圍內(nèi)S組顯著高于B組，1 000 mg·kg-1時(shí)S組、B組MDA含量無顯著差異，并且可以看出B組植株在500～1 000 mg·kg-1的脅迫濃度范圍里MDA含量由0.22 mmol·g-1增加至0.39 mmol·g-1，此階段升高了76.16%，1 000 mg·kg-1下MDA含量約是CK的7.05倍。

圖6 PS-NPs對(duì)菘藍(lán)葉片的丙二醛(MDA)含量的影響注：字母不同表示差異顯著，P<0.05。Fig. 6 Effects of PS-NPs on malondialdehyde (MDA) content of Isatis indigotica leavesNote: Different letters indicate significant differences, P<0.05.

2.2.4 不同濃度聚苯乙烯對(duì)菘藍(lán)葉片抗氧化酶活性的影響

如圖7所示，處理組菘藍(lán)葉片中SOD、CAT、POD活性均高于CK。10 mg·kg-1、100 mg·kg-1下S組、B組的SOD活性無顯著性差異，CAT、POD活性S組顯著高于B組；500 mg·kg-1、1 000 mg·kg-1下B組SOD、POD活性分別約為S組的1.36倍、1.47倍和3.59倍、4.55倍。S組POD活性在試驗(yàn)期間上下波動(dòng)，1 000 mg·kg-1下達(dá)到最大，約為CK的3.57倍；B組CAT活性在500～1 000 mg·kg-1從136.13 U·g-1·min-1躍增至289.08 U·g-1·min-1，增長(zhǎng)了1.12倍。

圖7 PS-NPs對(duì)菘藍(lán)葉片抗氧化酶活性的影響注：字母不同表示差異顯著，P<0.05。Fig. 7 Effects of PS-NPs on antioxidant enzymes activity of Isatis indigotica leavesNote: Different letters indicate significant differences, P<0.05.

2.3 不同濃度聚苯乙烯對(duì)菘藍(lán)根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1 不同濃度聚苯乙烯對(duì)菘藍(lán)根際土壤細(xì)菌群落多樣性指數(shù)的影響

如表4所示，對(duì)PS-NPs處理后的植物根系土壤微生物群落多樣性進(jìn)行分析，Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)反映樣品中微生物多樣性，Chao 1指數(shù)反映樣品群落豐富度，Pielou指數(shù)反映樣品物種均勻度。處理組的Shannon指數(shù)均高于CK，說明PS-NPs的添加可以增加樣品微生物群落的多樣性。脅迫濃度為1 000 mg·kg-1時(shí)，B組樣品微生物群落Shannon指數(shù)、Pielou指數(shù)和Chao 1指數(shù)分別高出S組7.52%、3.42%和73.06%，而脅迫濃度為100 mg·kg-1時(shí)S組分別高出B組17.94%(Shannon指數(shù))、0.11%(Pielou指數(shù))和67.89%(Chao1指數(shù))。

表4 樣品生物多樣性指數(shù)Table 4 Sample biodiversity index

如圖8所示，CK組樣品中有2 949個(gè)OTUs，S組樣品中有5 950個(gè)OTUs，B組樣品中有8 341個(gè)OTUs。3個(gè)樣品共有OTUs數(shù)為1 476個(gè)，分別占各自O(shè)TUs總數(shù)的50.05%(CK)、24.81%(S組)和17.70%(B組)，可見B組OTUs數(shù)目較多且有更多特有的OTUs。由圖9可知，處理組樣品中的物種豐富度高于CK，3個(gè)樣品稀釋曲線隨序列數(shù)的增加均趨于平緩，表明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，測(cè)序結(jié)果真實(shí)可信。

圖8 樣品中OTUs分布Venn圖Fig. 8 Venn diagram on OTUs distribution in sample

圖9 樣品中OTUs的稀釋曲線Fig. 9 Rarefaction curve of OTUs in sample

2.3.2 不同濃度聚苯乙烯對(duì)菘藍(lán)根際土壤細(xì)菌群落組成的影響

如圖10所示，根據(jù)物種注釋結(jié)果，不同微塑料添加下供試土樣門水平上相對(duì)豐度大于1%的有8個(gè)，分別為放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Acidobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、Patescibacteria和Latescibacteria。CK組中放線菌門、變形菌門、綠彎菌門、酸桿菌門相對(duì)豐度分別為42.78%、27.69%、13.64%、6.73%；與CK相比，S100、S1000、B1000處理中放線菌門豐度分別降低了15.30%、21.87%、21.21%；處理組變形菌門豐度均高于CK，分別提高了31.80%(S100)、25.73%(S1000)、12.64%(B100)、21.68%(B1000)。

圖10 根際土壤微生物門水平物種相對(duì)豐度Fig. 10 Relative abundance of horizontal species of rhizosphere soil bacterial flora

3 討論(Discussion)

3.1 不同濃度聚苯乙烯對(duì)菘藍(lán)種子發(fā)芽率和生長(zhǎng)表型的影響

當(dāng)PS-NPs添加量較高時(shí)激發(fā)了種皮對(duì)種子的保護(hù)機(jī)制，在胚胎與周圍環(huán)境之間形成了屏障，故1 000 mg·kg-1下S組與B組對(duì)發(fā)芽率的促進(jìn)作用無顯著差異。

處理組植物的形態(tài)學(xué)指標(biāo)比CK均有增加，也有研究表明PS-NPs并不會(huì)對(duì)小麥的根系生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制[19]，徐榮樂和海熱提[20]在塑料地膜對(duì)小麥種子萌發(fā)影響的研究中發(fā)現(xiàn)，相同濃度下厚度為0.03 mm的地膜對(duì)小麥芽長(zhǎng)的影響大于0.08 mm地膜，這也和本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致。

3.2 不同濃度聚苯乙烯對(duì)菘藍(lán)葉片細(xì)胞膜傷害率的影響

本研究中PS-NPs對(duì)菘藍(lán)葉片細(xì)胞膜的傷害率均顯著高于CK，有研究表明10 mg·L-1的PS-NPs會(huì)顯著增加小麥葉片中的電解質(zhì)外滲率[19]。有研究表明較小粒徑的微塑料更容易對(duì)細(xì)胞膜產(chǎn)生傷害，100 nm和300 nm PS-NPs微球中的大分子鍵在植物莖中發(fā)生了斷裂[21]，小粒徑PS-NPs運(yùn)輸至葉片時(shí)已經(jīng)是小分子鍵，內(nèi)聚力降低，對(duì)葉片細(xì)胞膜的傷害程度加深[22]。當(dāng)脅迫濃度為1 000 mg·kg-1時(shí)，過多的PS-NPs已經(jīng)對(duì)葉片表皮、葉肉和葉脈的正常生理過程均產(chǎn)生了影響，此時(shí)不同粒徑下PS-NPs對(duì)葉片細(xì)胞膜傷害率無顯著差異。

3.3 不同濃度聚苯乙烯對(duì)菘藍(lán)葉片抗氧化能力的影響

可溶性蛋白是細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，本研究中由于過氧化物酶起到的保護(hù)作用過強(qiáng)，導(dǎo)致處理組可溶性蛋白含量雖幾乎均略高于CK，但無顯著性差異。

植物體內(nèi)MDA含量的變化可以反映逆境條件下植物細(xì)胞膜脫脂化程度和超氧自由基對(duì)組織損傷的嚴(yán)重程度[23]。本研究中處理組MDA含量顯著高于CK，有研究表明水華微囊藻與蛋白核小球藻細(xì)胞內(nèi)MDA含量在500 mg·L-1納米聚氯乙烯、納米聚丙烯脅迫下顯著升高[24]。此外較小粒徑的PS-NPs會(huì)穿透根系進(jìn)入植物[25]，并在蒸騰作用下通過導(dǎo)管吸收，隨營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)一起進(jìn)入可利用部位(根、葉)[26]。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)中小粒徑PS-NPs表面比大粒徑更為光滑，因此可以更容易地進(jìn)入植物中引起較嚴(yán)重的脂質(zhì)過氧化。當(dāng)PS-NPs濃度為1 000 mg·kg-1時(shí)，S組、B組的MDA含量無顯著差異，表明此時(shí)微塑料粒徑不再是影響MDA含量的主要因素。相比之下，菘藍(lán)葉片MDA含量對(duì)PS-NPs的敏感性高于可溶性蛋白。

3.4 不同濃度聚苯乙烯對(duì)菘藍(lán)葉片抗氧化酶的影響

外在脅迫使植物產(chǎn)生更多的活性氧自由基(ROS)，SOD、CAT和POD都是植物體內(nèi)清除活性氧自由基的保護(hù)酶，SOD作為清除ROS的第一道防線可催化超氧化物自由基將其歧化為H2O2和O2，隨后CAT和POD將H2O2歧化為H2O和O2[27-28]，這也可以解釋本實(shí)驗(yàn)中SOD活性均相應(yīng)地高于相同處理下的CAT和POD活性。

脅迫濃度為10 mg·kg-1和100 mg·kg-1時(shí)，S組與B組SOD活性無顯著差異，當(dāng)脅迫濃度為500 mg·kg-1和1 000 mg·kg-1時(shí)，大粒徑的PS-NPs增強(qiáng)了SOD編碼基因的表達(dá)[29]，故B組SOD活性高于S組。Jiang等[30]的研究表明蠶豆在聚苯乙烯微塑料的脅迫下其SOD活性增加，并且通過遺傳學(xué)證明100 nm的PS-NPs比5 μm的PS-NPs對(duì)蠶豆有更強(qiáng)的氧化損傷，這和本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

處理組CAT活性均顯著高于CK，有研究表明在塑料微珠對(duì)銅綠微囊藻脅迫的1～9 d內(nèi)，藻細(xì)胞CAT活性顯著增高[31]。10 mg·kg-1和100 mg·kg-1濃度下S組CAT、POD活性均大于B組，1 000 mg·kg-1濃度下S組CAT、POD活性小于B組，這與高濃度脅迫下SOD歧化產(chǎn)生的H2O2更多有關(guān)。此外1 000 mg·kg-1下S組與B組POD的活性差值小于CAT的活性差值，因?yàn)镻OD是ROS清除同工酶，會(huì)通過多種不同的調(diào)節(jié)機(jī)制應(yīng)對(duì)環(huán)境壓力，其生物體耐受閾值低于CAT[32]。

Li等[21]研究了100、300、500和700 nm的PS-NPs微粒對(duì)黃瓜幼苗的抗氧化酶系統(tǒng)影響，結(jié)果表明SOD和CAT的相關(guān)基因表達(dá)量與顆粒大小呈顯著負(fù)相關(guān)，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相反，這由于本實(shí)驗(yàn)中聚苯乙烯微粒粒徑較之更大，材料表面形貌、脅迫濃度均不相同等因素導(dǎo)致。

3.5 不同濃度聚苯乙烯對(duì)菘藍(lán)根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

Zhang等[26]在對(duì)新疆棉田微生物群落多樣性和組成的研究中發(fā)現(xiàn)微塑料存在的土壤中放線菌門和變形菌門豐度最高，這與本實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果一致。添加PS-NPs的土壤與CK優(yōu)勢(shì)菌門相同，但豐富度有所變化。與CK相比，添加PS-NPs后土壤中變形菌門、酸桿菌門豐度升高。變形菌門通常生活在較松弛的土壤中，PS-NPs本身具有一定的柔韌性，有利于其與土壤結(jié)合，因此影響了土壤容重。此外碳作為PS-NPs的主要成分，其添加也會(huì)影響土壤中碳的形態(tài)與含量，使變形菌門豐度變高[33]。有研究表明添加聚乙烯微塑料會(huì)影響土壤酸堿性，即微塑料的長(zhǎng)期存在會(huì)使土壤酸化[34]，而酸桿菌門的豐度與pH呈負(fù)相關(guān)，故本研究中PS-NPs添加組土壤酸桿菌門豐度高于CK。

與CK相比PS-NPs添加使土壤的綠彎菌門豐度降低，研究表明，微塑料會(huì)影響土壤含水率和銨態(tài)氮含量，而綠彎菌門豐度受此二者影響，故微塑料的添加不利于綠彎菌門生長(zhǎng)[35]。

與CK相比100 mg·kg-1PS-NPs降低了擬桿菌門的豐度，1 000 mg·kg-1PS-NPs則增加了其相對(duì)豐度，芽單胞菌門有相同的變化特征。因?yàn)檩^高濃度的微塑料提高了土壤中熒光素二乙酸水解酶(FDAse)和酚氧化酶的活性[36]，植物的愈傷反應(yīng)會(huì)使呼吸作用增強(qiáng)并釋放酚類物質(zhì)，酚類物質(zhì)可被酚氧化酶氧化為具有提高微生物的自我保護(hù)能力的醌類物質(zhì)[12, 37]。

有研究表明微塑料可以通過直接吸附影響土壤酶活性，從而改變土壤的物理性質(zhì)和微環(huán)境[36]。在本研究中S組材料粒徑更小更容易團(tuán)聚，團(tuán)聚體的結(jié)合力更大；B組材料排列整齊緊密且表面凹凸不平。此外二者在土壤中不同的降解性能會(huì)進(jìn)一步影響微生物群落結(jié)構(gòu)，但具體的降解性能、降解產(chǎn)物還有待進(jìn)一步探究。結(jié)果顯示100 mg·kg-1濃度下S組群落多樣性大于B組，由圖1可知S組材料的結(jié)構(gòu)比表面積更大，為微生物提供了更多的棲息位點(diǎn)；但當(dāng)脅迫濃度為1 000 mg·kg-1時(shí)B組群落多樣性大于S組，因?yàn)楦邼舛却碳ち四承┪⑺芰系奈⑸锝到膺^程，目前大量研究表明在陸地環(huán)境中放線菌門的某些種可以通過合成水解酶來生物降解微塑料。

綜上，在2種粒徑PS-NPs對(duì)菘藍(lán)的脅迫研究中，脅迫濃度>10 mg·kg-1時(shí)B組會(huì)抑制幼苗株高，不同濃度下S組、B組對(duì)鮮質(zhì)量均有促進(jìn)作用；隨著脅迫濃度的增加不同粒徑的PS-NPs對(duì)葉片細(xì)胞膜的傷害程度趨于一致；不同處理下SOD活性均高于CAT、POD活性，3種酶的活性都與脅迫濃度呈正相關(guān)，1 000 mg·kg-1下粒徑對(duì)其影響更為顯著。添加PS-NPs的土壤與CK優(yōu)勢(shì)菌門相同但豐度不同，處理組變形菌門、酸桿菌門豐度升高，而綠彎菌門豐度降低，微生物群落豐度與材料表型有關(guān)。但聚苯乙烯微塑料在環(huán)境中由于降解形成的單體，以及塑料添加劑給植物與土壤帶來的影響還有待進(jìn)一步研究。