葛根多糖抗氧化性及其降血糖作用研究

王秋丹，趙凱迪，林長青

（延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院中醫(yī)系，吉林延吉 133000）

葛根（Pueraria，DC），又名葛藤、葛麻葉、野葛等，屬豆科多年生纏繞藤本植物[1]，其主要分布在我國遼寧、河北、河南、山東、安徽等地，約占世界品種的50%[2]。于2000年葛根正式被國家衛(wèi)生部批準(zhǔn)列入“既是食品又是藥品”名錄[3?4]。此外，在《中國藥典》、《中藥大辭典》、《中華本草》等典籍中也有記載[5]。葛根含有黃酮類、三萜類、皂苷類和多糖類等多種化學(xué)成分，具有生津止渴、醒脾解酒、升陽止瀉、降脂等功效，對心腦血管疾病、糖尿病、神經(jīng)保護(hù)、解酒保肝和骨質(zhì)疏松均有一定療效，此外，其還能夠調(diào)節(jié)腸道菌群[6?8]。許多植物多糖均具有生物活性，包括調(diào)節(jié)免疫力[9]、調(diào)節(jié)血糖血脂[10]、抗腫瘤[11]等內(nèi)在的保健作用。

糖尿?。―M）是21世紀(jì)最重要的健康問題之一。1型糖尿?。═1DM）也稱為胰島素依賴型糖尿病（IDDM），從T1DM開始就依賴于胰島素治療，糖尿病作為近年來引起代謝紊亂的最常見疾病，其發(fā)病率在多數(shù)國家呈上升趨勢[12]。糖尿病具有多種副作用，可導(dǎo)致組織損傷，體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂，并最終降低糖尿病患者的生活質(zhì)量[13?14]。

由于葛根富含多種營養(yǎng)活性成分，現(xiàn)已有多種以葛根或其提取物為原料制備的保健食品，如葛根解酒茶、葛根片、葛根口服液等。葛根對治療糖尿病有良好的效果，葛根、葛根素單獨(dú)應(yīng)用或葛根與降糖藥、胰島素聯(lián)合應(yīng)用均可以顯著降低2型糖尿病大鼠的血糖[15?16]。其主要通過改善胰島素抵抗、保護(hù)胰島β細(xì)胞發(fā)揮降糖作用，葛根醇提物具有較強(qiáng)的蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B（PTP1B）活性抑制作用，可改善胰島素抵抗人肝癌細(xì)胞HepG2的胰島素敏感性并增強(qiáng)其葡萄糖攝取能力[17]。近年來，對葛根多糖的研究多集中于提取方法和純化工藝的優(yōu)化[18]、降血脂活性的研究[19]以及體外降血糖作用[20]，但對葛根多糖在治療1型糖尿病方面的報(bào)道較少，因此，本試驗(yàn)中采用DPPH·、ABTS+·、·OH、PTIO清除率來測定葛根多糖的抗氧化性，采用腹腔注射STZ建立1型糖尿病模型，并對其各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行測定，旨在為開發(fā)葛根成為新抗氧化和降血糖產(chǎn)品提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葛根 吉林省益豐大藥堂；抗壞血酸（VC） 中國醫(yī)藥集團(tuán)有限公司；SD大鼠 50只雄性無特定病原體（SPF）級，體重（250±20）g，許可證號：SCXK（遼）2015-0001，長春億斯試驗(yàn)動(dòng)物中心，嚴(yán)格遵守《延邊大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物的保護(hù)和使用指南》中的要求，符合動(dòng)物試驗(yàn)倫理要求；高脂高糖飼料、普通飼料 上海帆泊生物技術(shù)有限公司；鹽酸二甲雙胍片 北京萬輝雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司；鏈脲佐菌素（STZ） 美國Sigma公司；二苯代苦味肼基自由基（DPPH·） 上?；晒I(yè)有限公司；2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS+·） 北京索萊寶科技有限公司；一氧化氮清除劑（PTIO） 北京綠源伯德生物科技有限公司；總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）和過氧化氫酶（CAT）試劑盒 江蘇南京建城生物工程研究所。

HWS-24型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；ScoutSE-SE202FZH型電子天平 常州奧豪斯儀器有限公司；TG16A-WS型離心機(jī) 上海盧湘儀器有限公司；CCA-1111-CE 型旋蒸冷凝器東京理化器械株式會(huì)社；LyoQuest-55實(shí)驗(yàn)型冷凍干燥機(jī) 西班牙Telstar集團(tuán)公司；DTC-22B型真空泵

日本ULUACKIKO公司；九安AG-605血糖儀及血糖試紙 天津九安醫(yī)療電子股份有限公司；BKEL10C酶標(biāo)儀 山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 葛根多糖的提取 將葛根破碎，用40目型粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，收集葛根粉末。參考馬偉等[21]的方法，采用水提醇沉法對葛根多糖進(jìn)行提取。按料液比1:20 g/mL，提取時(shí)間4 h，100 ℃水提2次，合并2次清液，抽濾，旋蒸，將濃縮液用85%乙醇進(jìn)行醇沉，收集沉淀，蒸餾水復(fù)溶，旋蒸濃縮，采用Sevage法除蛋白，用凍干機(jī)進(jìn)行凍干，收集粉末，按公式（1）計(jì)算多糖得率，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 葛根多糖含量的測定 參考紀(jì)寶玉等[22]的方法，采用苯酚硫酸法進(jìn)行多糖含量的測定。將葡萄糖配制成0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL的濃度梯度，按苯酚硫酸法步驟進(jìn)行操作，測定490 nm處不同濃度葡萄糖的OD值，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱量葛根多糖粉末3 mg，蒸餾水定容至10 mL，取1 mL，加入1 mL 5%苯酚和5 mL的濃硫酸，混合后室溫放置20 min，測定490 nm處的OD值。并計(jì)算葛根多糖含量。

1.2.3 葛根多糖抗氧化性的測定 按朱家慶等[18]的方法稍作修改，將葛根多糖溶于水配制成50、100、200、400、800、1000 μg/mL的溶液，以VC作為對照組，測定葛根多糖DPPH·、ABTS+·、·OH、PTIO的清除能力。

1.2.4 試驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥 選取50只SPF級雄性SD大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，喂養(yǎng)7 d后，10只作為正常組，其余40只以30 mg/kg·BW劑量進(jìn)行腹腔注射STZ，建立T1DM大鼠模型，72 h后進(jìn)行血糖測定，尾尖取血，棄掉第一滴血，將第二滴血滴到血糖試紙上進(jìn)行測定，F(xiàn)BG水平>16.7 mmol/L則造模成功[23]，將此時(shí)定為灌胃0周。將造模成功大鼠隨機(jī)分為4組，每組10只，包括模型組、葛根多糖高劑量組（100 mg/kg）、葛根多糖低劑量組（50 mg/kg）、陽性對照組（100 mg/kg鹽酸二甲雙胍），劑量設(shè)定參照蔡春沉等[24]的方法。每天進(jìn)行灌胃，連續(xù)灌胃8周，除試驗(yàn)組外，正常組和模型組每天以等量的蒸餾水灌胃，每周記錄所有大鼠的體重和FBG。

1.2.5 大鼠OGTT的測定 在灌胃給藥8周后，進(jìn)行OGTT試驗(yàn)，以1 g/kg·BW灌胃葡萄糖，然后以0、30、60、90 min為時(shí)間點(diǎn)分別測定大鼠血糖水平，并記錄其數(shù)值。嚴(yán)格遵守《延邊大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物的保護(hù)和使用指南》中的要求，符合動(dòng)物試驗(yàn)倫理要求。

1.2.6 大鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C的測定 TC、TG：心臟取血，以4000 r/min，離心10 min，離心后取大鼠血清，依次按試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作，所有反應(yīng)液混勻后，37℃孵育10 min，于510 nm測定吸光值，根據(jù)公式進(jìn)行計(jì)算。HDL-C、LDL-C的測定：取大鼠血清，依次按試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作，所有反應(yīng)液混勻后，分別孵育5 min，在546 nm測定2次吸光值，根據(jù)公式進(jìn)行計(jì)算。

1.2.7 大鼠SOD、GSH、CAT、MDA的測定 心臟取血，以4000 r/min，離心10 min，離心后取大鼠血清，按照試劑盒說明書中操作表進(jìn)行操作，并用酶標(biāo)儀測定各指標(biāo)吸光度，最后按照公式進(jìn)行計(jì)算。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)使用SPSS 23.0對整理后的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)算各組均值與標(biāo)準(zhǔn)偏差，進(jìn)行單因素方差分析，所得的數(shù)據(jù)以圖表和均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（X±SD）的形式表示，P<0.05表示有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 葛根多糖含量的測定

多糖得率為9.87%，圖1為多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=11.161x+0.001（R2=0.9965），計(jì)算出多糖含量為87.80%。

圖1 多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of polysaccharides

2.2 葛根多糖對DPPH·、ABTS+·、·OH、PTIO的清除能力

通過DPPH·、ABTS+·、·OH、PTIO清除率實(shí)驗(yàn)可判斷物質(zhì)的抗氧化能力。圖2為葛根多糖在50、100、200、400、800、1000 μg/mL濃度下對DPPH·、ABTS+·、·OH、PTIO的清除能力，葛根多糖對DPPH·、ABTS+·、·OH、PTIO的清除能力與濃度呈正相關(guān)，在1000 μg/mL濃度下對DPPH·、ABTS+·、·OH、PTIO的清除能力分別為90.2%、83.3%、81.3%、89.0%?？寡趸越咏黇C。可見，葛根多糖有一定的抗氧化性。

圖2 葛根多糖對DPPH·、ABTS+·、·OH、PTIO的清除能力Fig.2 The ability of Pueraria lobata polysaccharide to remove DPPH·, ABTS+·, ·OH, PTIO

2.3 葛根多糖對大鼠體重、FBG的影響

由表1可知，在灌胃8周后，與正常組相比，T1DM大鼠的體重均顯著降低（P<0.05），經(jīng)葛根多糖治療后的糖尿病大鼠體重下降得到有效的緩解，并與二甲雙胍顯示出相似的治療效果。表2顯示，灌胃8周后，實(shí)驗(yàn)組大鼠的FBG均顯著高于正常組（P<0.05），但經(jīng)葛根多糖治療的T1DM大鼠FBG與模型組相比顯著下降（P<0.05），與陽性組間差異不顯著（P>0.05）。說明葛根多糖能夠有效緩解T1DM大鼠體重的下降，降低其血糖水平。

表1 T1DM大鼠體重（g）Table 1 Body weight of T1DM rats (g)

表2 T1DM大鼠空腹血糖值（mmol/L）Table 2 Fasting blood glucose of T1DM rats (mmol/L)

2.4 葛根多糖對大鼠OGTT的影響

糖耐量作為糖尿病的一種重要指標(biāo)，能夠在一定時(shí)間內(nèi)反映出機(jī)體對體內(nèi)血糖濃度的調(diào)節(jié)能力，反映其葡萄糖耐受能力。圖3為OGTT試驗(yàn)結(jié)果，結(jié)果顯示，與正常組相比，T1DM大鼠的FBG水平在0、30、60和90 min時(shí)極顯著增加（P<0.01），與模型組相比，經(jīng)葛根多糖治療后的大鼠血糖水平在30、60和90 min時(shí)極顯著降低（P<0.01）。這表明葛根多糖能夠有效控制大鼠的血糖水平，提高其糖耐量。

圖3 葛根多糖對OGTT水平的影響Fig.3 Effects of Pueraria lobata polysaccharide on OGTT level

2.5 葛根多糖對大鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C的影響

血脂異常是胰島素代謝失調(diào)引發(fā)的一種現(xiàn)象，胰島素的缺乏會(huì)加速機(jī)體內(nèi)脂肪的分解，脂肪分解所產(chǎn)生的游離脂肪酸進(jìn)入肝臟生成TG和酮體，會(huì)使TC、HDL-C、LDL-C發(fā)生變化，最終導(dǎo)致體內(nèi)血脂異常[25]。如圖4所示，經(jīng)葛根多糖治療后，能夠極顯著降低T1DM大鼠TC、TG、LDL-C水平（P<0.01），極顯著提高HDL-C水平（P<0.01）。由此可見，葛根多糖能夠調(diào)節(jié)T1DM大鼠的異常脂代謝情況。

圖4 葛根多糖對TC、TG、HDL-C、LDL-C水平的影響Fig.4 Effects of Pueraria lobata polysaccharide on TC、TG、HDL-C and LDL-C level

2.6 葛根多糖對大鼠SOD、GSH、CAT、MDA的影響

研究指出通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激相關(guān)酶的活力能夠改善胰島細(xì)胞的功能，促進(jìn)葡萄糖代謝，減少對肝組織的損傷[26?27]。SOD、GSH、CAT和MDA的水平能夠間接反映出脂代謝和氧化應(yīng)激水平。如圖5所示，與正常組相比，模型組中SOD、GSH、CAT含量均極顯著下降（P<0.01），MDA含量極顯著升高（P<0.01），經(jīng)葛根多糖治療后可有效恢復(fù)T1DM大鼠的SOD、GSH、CAT水平，有效降低MDA水平，且與模型組比較，高劑量葛根多糖組能夠極顯著提高SOD、GSH、CAT水平（P<0.01），極顯著降低MDA水平（P<0.01）。

圖5 葛根多糖對SOD，GSH，CAT和MDA水平的影響Fig.5 Effects of Pueraria lobata polysaccharide on SOD,GSH, CAT and MDA level

3 結(jié)論與討論

植物多糖又稱植物多聚糖，是植物細(xì)胞代謝產(chǎn)生的聚合度超過10的化合物，內(nèi)部存在若干個(gè)α-或β-糖苷鍵，多糖廣泛地存在于植物體內(nèi)，是植物體內(nèi)重要的活性物質(zhì)，所以常被應(yīng)用于食品、保健品中[28]。本試驗(yàn)中葛根多糖的得率為9.87%，測得多糖提取物中葛根多糖的含量為87.80%。

正常情況下，機(jī)體氧化還原系統(tǒng)處于動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)機(jī)體處于應(yīng)激、病理狀態(tài)時(shí)，會(huì)產(chǎn)生·OH、DPPH·等強(qiáng)氧化自由基[29]。植物多糖可通過直接或間接清除自由基、提高抗氧化酶活性或降低氧化酶活性起到抗氧化作用。劉雅娜等[30]利用水提醇沉法對沙棘多糖進(jìn)行了提取，并測定了DPPH自由基清除率和ABTS+·自由基清除率，試驗(yàn)結(jié)果表明，沙棘多糖具有良好的抗氧化作用。另有學(xué)者研究了芽球菊苣根多糖和山藥多糖的抗氧化性，均顯示有很強(qiáng)的自由基清除能力[31?32]。本實(shí)驗(yàn)中，顯示葛根多糖在50~1000 μg/mL范圍內(nèi)對DPPH·、ABTS+·、·OH、PTIO均有一定的清除能力，且與濃度呈正相關(guān)，在1000 μg/mL濃度下對DPPH·、ABTS+·、·OH、PTIO的清除能力分別為90.2%、83.3%、81.3%、89.0%。本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果均顯示植物多糖具有很好的抗氧化性。

目前公認(rèn)的病因?yàn)樵谶z傳及環(huán)境因素共同作用下，由T細(xì)胞免疫介導(dǎo)的胰島β細(xì)胞破壞。胰島β自身免疫破壞過程歷時(shí)數(shù)月到數(shù)年，當(dāng)胰島β細(xì)胞破壞到一定程度時(shí)，糖尿病癥狀出現(xiàn)[33]。植物多糖因其特殊結(jié)構(gòu)，使其具有多途徑、多靶點(diǎn)、多向性、毒副作用小的藥理優(yōu)點(diǎn)，能夠通過多種機(jī)制、多環(huán)節(jié)作用于糖尿病[34]。植物多糖降血糖的機(jī)制主要是增加胰島細(xì)胞數(shù)量、促進(jìn)胰島素分泌或釋放、增加胰島素敏感性、改善糖代謝等[35]。

T1DM會(huì)導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)異常脂代謝情況的發(fā)生，導(dǎo)致體內(nèi)TC、HDL-C、LDL-C發(fā)生變化[36?38]，其中，甘油三酯水平顯著升高為1型糖尿病最為突出的脂代謝紊亂表現(xiàn)[39]。研究指出，葛根多糖有著良好的降血脂活性[19]。在本試驗(yàn)中，與正常組相比，T1DM大鼠血清的TC、TG、LDL-C濃度顯著增加（P<0.01），而HDL-C濃度顯著降低（P<0.01），表明T1DM大鼠出現(xiàn)了異常的脂代謝情況，其原因可能是T1DM大鼠對葡萄糖利用失調(diào)，脂肪分解增加，從而產(chǎn)生了大量的游離脂肪酸，組織吸收脂肪酸的能力降低，F(xiàn)FA大量釋放到血液和肝臟中，導(dǎo)致TC、TG、LDLC的含量增多。與模型組比較，經(jīng)葛根多糖灌胃后的T1DM大鼠的TC、TG、LDL-C顯著降低（P<0.01），HDL-C顯著升高（P<0.01）。葛根多糖促進(jìn)了組織對脂肪酸的吸收，從而緩解了一場脂代謝的情況。

糖尿病患者機(jī)體內(nèi)氧自由基含量增多，過多的氧自由基與脂質(zhì)相互作用產(chǎn)生過氧化反應(yīng)[40]。CAT與SOD在機(jī)體中具有較強(qiáng)的抗氧化能力，在體內(nèi)能夠抑制氧自由基的生成，能夠減少氧自由基對細(xì)胞造成的傷害，并且能夠降低MDA的生成量[41]。在本試驗(yàn)中，與正常組相比，T1DM大鼠血清的MDA濃度顯著增加（P<0.01），而SOD、GSH、CAT濃度顯著降低（P<0.01），表明T1DM大鼠出現(xiàn)了氧化應(yīng)激反應(yīng)。與模型組大鼠相比，葛根多糖治療后能夠顯著抑制這些標(biāo)志物的變化，可能是通過調(diào)節(jié)體內(nèi)相關(guān)酶的水平從而提高了清除自由基的效果。

由此，我們認(rèn)為，葛根多糖具有良好的抗氧化活性，并可以通過調(diào)節(jié)T1DM大鼠脂代謝及氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而降低T1DM大鼠血糖。