發(fā)酵麩皮水提物體內(nèi)外抗氧化及心臟保護(hù)活性研究

尹 娜，陳秋燕，郝希然，王瑞芳，王 園，齊景偉

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古自治區(qū)草食家畜飼料工程技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

許多疾病的發(fā)生和發(fā)展都與體內(nèi)產(chǎn)生的氧化應(yīng)激有關(guān)[1?3]，氧化/抗氧化機(jī)制的失衡會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激和血管損傷，并最終引發(fā)心血管疾病及其并發(fā)癥[4?6]。心肌梗死是一種冠狀動(dòng)脈疾病，會(huì)造成心肌缺氧缺血，導(dǎo)致ROS的產(chǎn)生，而ROS會(huì)進(jìn)一步刺激炎癥反應(yīng)，炎癥因子則又促進(jìn)ROS的形成，造成心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)級(jí)聯(lián)放大[7]。ROS通過(guò)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大信號(hào)的凋亡和壞死，對(duì)心肌鈣代謝產(chǎn)生負(fù)作用，引起心率失常并促進(jìn)心肌重塑，并通過(guò)腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)和交感神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)體液激活，加上負(fù)荷前后的增加，帶給心肌額外的氧化應(yīng)激[8]。因此，尋找一個(gè)既能緩解氧化應(yīng)激也能保護(hù)心臟的有效且安全的物質(zhì)是必要的。

全麥?zhǔn)称返臄z入能有效清除自由基、降低癌癥的發(fā)病率和預(yù)防心血管疾病的發(fā)生[9?11]。但是，傳統(tǒng)面粉加工產(chǎn)生的小麥麩皮和小麥胚芽被用作低價(jià)動(dòng)物飼料原料，使其附加值和綜合利用率下降。研究表明，麥麩中含有許多功能性成分，如咖啡酸、香草酸及阿魏酸等在內(nèi)的酚酸類化合物、維生素E、多糖類物質(zhì)和黃酮類化合物等[12]，使其具有抗氧化和保護(hù)心臟的作用[13?14]。羅昆等[15]的研究證明麩皮在發(fā)酵過(guò)程中水溶性阿拉伯木聚糖的含量增加了17.88 mg/g；游離酚與阿魏酸的含量分別上升了73%和234%。本課題組的研究同樣發(fā)現(xiàn)經(jīng)枯草芽孢桿菌和釀酒酵母混合發(fā)酵后提高了游離型和結(jié)合型阿魏酸的含量，分別達(dá)到20.22、1160.6 mg/kg[16]。王園等[17]發(fā)現(xiàn)灌胃40 mg/kg mb發(fā)酵麩皮多糖能顯著提高斷奶大鼠空腸組織中總抗氧化能力、過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物活力及谷胱甘肽含量，顯著降低8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷含量。

斑馬魚(yú)是一種熱帶淡水魚(yú)，由于其體積小、產(chǎn)卵量大、透明度高、成本低以及與哺乳動(dòng)物生理上的相似性而被用作脊椎動(dòng)物的模型生物[18?19]。近年來(lái)，斑馬魚(yú)被作為一種替代其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體內(nèi)模型來(lái)研究氧化應(yīng)激和心臟問(wèn)題[20?21]等人類疾病的發(fā)展。因此，本實(shí)驗(yàn)以發(fā)酵麩皮水提物為研究對(duì)象，評(píng)價(jià)其體外抗氧化能力、緩解斑馬魚(yú)氧化應(yīng)激和心臟損傷保護(hù)作用，以期為麩皮高附加值利用提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)所用麩皮 購(gòu)于市場(chǎng)；釀酒酵母CGMCC 2.119及枯草芽孢桿菌CGMCC 1.0892 保存于動(dòng)物科學(xué)學(xué)院水產(chǎn)實(shí)驗(yàn)室；實(shí)驗(yàn)用斑馬魚(yú)成魚(yú) 購(gòu)于國(guó)家斑馬魚(yú)資源中心（中國(guó)，武漢）；特非那定、2,2-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽（2,2'-azobis-2-methylpropanimidamide, dihydrochloride, AAPH）、2',7'-二氯熒光黃雙乙酸（2',7'-dichlorodi-hydrofluorescein diacetate, DCFH-DA）、吖啶橙（acridine orange, AO）、1,3-雙（二苯膦）丙烷（1,3-bis（diphenyphosphino）propane, DPPP） 美國(guó)Sigma公司；DPPH、間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽（3-aminobenzoic acid ethyl ester methanesulfonate, MS-222）、叔丁基-4-羥基茴香醚（butyl hydroxyanisole, BHA）、水楊酸、磷酸鹽緩沖液、六氰合鐵酸鉀、FeSO4、過(guò)氧化氫、三氯乙酸、FeCl3、NaOH、NaNO2、Al（NO3）3國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國(guó)華電器有限公司；EPOCH2T酶標(biāo)儀 美國(guó)伯滕儀器有限公司；TCS-SR倒置顯微鏡、正置熒光顯微鏡 日本尼康。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵麩皮水提物的制備 實(shí)驗(yàn)所用的麩皮由枯草芽孢桿菌和釀酒酵母菌按6.73:3.26混合，37 ℃發(fā)酵72 h，于45 ℃烘箱中烘干后粉碎過(guò)60目篩，稱取以料水比1:10（g/mL）加入蒸餾水中，80 ℃熱水浸提30 min，冷卻至室溫5000 r/min離心10 min，取上清液，烘干備用。

1.2.2 FWBE的體外抗氧化能力

1.2.2.1 DPPH自由基清除率 參照文獻(xiàn)對(duì)FWBE的DPPH自由基清除活性進(jìn)行測(cè)定[22]。以叔丁基-4-羥基茴香醚（BHA）為陽(yáng)性對(duì)照，將FWBE和BHA分別溶于蒸餾水中，并稀釋至不同濃度（0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL），然后將2 mL的DPPH（0.5 mmol/L，溶解在95%乙醇中）溶液與2.0 mL不同濃度的樣品溶液混合,充分混勻,同時(shí)空白組用2 mL的蒸餾水代替水提麩皮多糖溶液。本底用95%乙醇代替DPPH溶液。在室溫下黑暗環(huán)境中反應(yīng)30 min，在517 nm處測(cè)定吸光度。DPPH自由基清除活性按以下公式進(jìn)行計(jì)算：

式中：A0為樣品吸光度；A1為95%乙醇代替DPPH溶液吸光度；A2為蒸餾水代替樣品的吸光度。

1.2.2.2 羥基自由基清除率 參照已有文獻(xiàn)對(duì)FWBE的羥基自由基清除活性進(jìn)行測(cè)定[23]。以BHA為陽(yáng)性對(duì)照，將FWBE和BHA分別溶于蒸餾水中,并稀釋至不同濃度（0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL），然后將0.5 mL FeSO4溶液（9.0 mmol/L）溶液、0.5 mL H2O2溶液（8.8 mmol/L）與0.5 mL不同濃度的樣品溶液混合，充分搖勻，同時(shí)空白組用2 mL的蒸餾水代替水提麩皮多糖溶液，室溫反應(yīng)10 min，加入0.5 mL水楊酸乙醇溶液（9.0 mmol/L），室溫反應(yīng)30 min，在510 nm處測(cè)定吸光度，本底用蒸餾水代替FeSO4溶液。

式中：A0為樣品吸光度；A1為蒸餾水代替FeSO4溶液吸光度；A2為蒸餾水代替樣品的吸光度。

1.2.2.3 還原力的測(cè)定 參照已有文獻(xiàn)對(duì)FWBE的還原力進(jìn)行測(cè)定[24]。以BHA為陽(yáng)性對(duì)照，將FWBE和BHA分別溶于蒸餾水中,并稀釋至不同濃度（0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL），然后將0.75 mL的磷酸緩沖溶液（0.2 mmol/L，pH6.6）、0.75 mL的1%六氰合鐵酸鉀溶液與0.75 mL不同濃度樣品溶液混合，充分搖勻，50 ℃水浴反應(yīng)20 min，待冷卻后加入0.75 mL 10%的三氯乙酸，3000 r/min離心10 min，取1.5 mL上清液依次加入1.5 mL蒸餾水和400 μL的0.1%FeCl3溶液，室溫靜置反應(yīng)10 min。以蒸餾水做為參比，在700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.2.3 FWBE的體內(nèi)抗氧化能力

1.2.3.1 斑馬魚(yú)喂養(yǎng)及胚胎收集 斑馬魚(yú)親魚(yú)飼養(yǎng)于玻璃水族缸中，飼養(yǎng)溫度（28.5±1）℃，光周期為照明14 h/黑暗10 h。每天喂食四次飼料，并輔以豐年蟲(chóng)。實(shí)驗(yàn)前一天，將雌魚(yú)與雄魚(yú)按照1:2的比例進(jìn)行雜交繁殖。胚胎由隔日清晨開(kāi)燈誘導(dǎo)自然產(chǎn)卵獲得并于產(chǎn)卵后30 min左右收集受精卵。下午2點(diǎn)左右收集300~400枚胚胎于干凈培養(yǎng)皿中并移除排泄物、雜質(zhì)及未受精胚胎。

1.2.3.2 斑馬魚(yú)胚胎存活率的測(cè)定 選取受精后8 h（hours post fertilization，hpf）的正常發(fā)育胚胎隨機(jī)放置在24孔板中，每孔10枚，加入2 mL濃度梯度為0、50、100、150、200、300、400、500 μg/mL的水提麩皮多糖溶液，恒溫培養(yǎng)，于給藥后24、48、72、96 h后觀察記錄胚胎的孵化率和死亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。斑馬魚(yú)胚胎在出現(xiàn)白色的卵凝結(jié)時(shí)定為胚胎死亡，在hpf時(shí)斑馬魚(yú)出膜則定為胚胎孵化。死亡率計(jì)算公式為：死亡率（%）=死亡胚胎數(shù)/胚胎總數(shù)×100%；孵化率計(jì)算公式為：孵化率（%）=孵化胚胎總數(shù)/（胚胎總數(shù)-死亡胚胎數(shù)）×100%。

1.2.3.3 胚胎處理 約受精后的7~9 hpf后，將胚胎轉(zhuǎn)移到含有2 mL充氧水的24孔板中，隨機(jī)分為對(duì)照組（不添加任何處理）、AAPH誘導(dǎo)組、100、200、300 μg/mL的FWBE溶液組，每組4個(gè)重復(fù)。1 h后除對(duì)照組外均加入15 mmol AAPH溶液共同孵育16 h后在新的24孔板中清洗胚胎。等胚胎發(fā)育至72 hpf時(shí)進(jìn)一步測(cè)定ROS的產(chǎn)生率、細(xì)胞死亡率和脂質(zhì)過(guò)氧化程度。

1.2.3.4 氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS生成率、細(xì)胞死亡率和脂質(zhì)過(guò)氧化程度測(cè)定 用非標(biāo)記性的氧化敏感的熒光探針DCF-DA、AO和DPPP分別檢測(cè)斑馬魚(yú)胚胎中細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生率、細(xì)胞死亡率和脂質(zhì)過(guò)氧化程度[25]。在72 hpf時(shí)，將斑馬魚(yú)幼蟲(chóng)轉(zhuǎn)移到24孔板中，分別用DCF-DA溶液（20 μg/mL）、AO溶液（7 μg/mL）和DPPP溶液（25 μg/mL）處理所有試驗(yàn)組，隨后將24孔板在（28.5±1）℃黑暗環(huán)境中分別孵育1、0.5和1 h，孵育結(jié)束后，用充氧水沖洗斑馬魚(yú)幼蟲(chóng)，并在熒光拍照前用MS-222麻醉。斑馬魚(yú)幼蟲(chóng)在熒光顯微鏡下拍攝，用Image J對(duì)斑馬魚(yú)幼蟲(chóng)的熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析。

1.2.4 FWBE對(duì)斑馬魚(yú)的心臟保護(hù)作用

1.2.4.1 斑馬魚(yú)心率的測(cè)定 斑馬魚(yú)的胚胎心臟在24 hpf左右開(kāi)始跳動(dòng)，72 hpf時(shí)心臟的形態(tài)發(fā)育基本完成，且心跳逐漸變得強(qiáng)烈而穩(wěn)定[26]，所以選擇24 hpf斑馬魚(yú)胚胎研究FWBE對(duì)斑馬魚(yú)心率的影響。將胚胎移至24孔板中，實(shí)驗(yàn)分為5組：正常對(duì)照組、2.5 μg/mL特非那定組以及實(shí)驗(yàn)組（2.5 μg/mL特非那定+FWBE溶液），試驗(yàn)組FWBE濃度分別是50、100、150、200 μg/mL，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10枚胚胎。所有孔中加入2 mL新的培養(yǎng)液，置于（28.5±1）℃中培養(yǎng)，待處理48 h后，將各組魚(yú)吸到載玻片上，于倒置顯微鏡下觀測(cè)心率，記錄15 s內(nèi)斑馬魚(yú)的心跳數(shù)。

1.2.4.2 斑馬魚(yú)靜脈竇-動(dòng)脈球（SV-BA）間距的測(cè)量

同樣在48 h后在24孔板中加入少量的MS-222對(duì)斑馬魚(yú)進(jìn)行麻醉，隨后將斑馬魚(yú)置于載玻片上，使之側(cè)臥，雙眼重合，用倒置顯微鏡對(duì)斑馬魚(yú)心臟部位進(jìn)行拍照，通過(guò)Imagepro-plus軟件測(cè)定SV-BA之間的間距。同時(shí)計(jì)算斑馬魚(yú)心臟損傷修復(fù)率[心臟損傷修復(fù)率（%）＝（實(shí)驗(yàn)組斑馬魚(yú)心臟SV-BA間距?特非那定組斑馬魚(yú)心臟SV-BA間距）/（空白對(duì)照組斑馬魚(yú)SV-BA間距?特非那定組斑馬魚(yú)SV-BA間距）×100]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均一式三份。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（SE）表示。用SAS的單因素方差分析程序?qū)?shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。對(duì)于有顯著差異的處理，采用Tukey檢驗(yàn)比較其平均值。顯著性水平設(shè)定為P<0.05，并通過(guò)Originpro 2017 C軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外抗氧化活性結(jié)果分析

2.1.1 DPPH自由基清除能力 DPPH分子包含一個(gè)穩(wěn)定的自由基，已被廣泛用于評(píng)估抗氧化劑的自由基清除能力，并且由清除DPPH的能力可以反映出其他物質(zhì)抗氧化活性大小[27?28]。FWBE對(duì)DPPH自

由基的清除率如圖1所示，隨著FWBE溶液濃度的增加DPPH自由基的清除能力先逐漸上升后又趨于平緩，雖然與BHA標(biāo)準(zhǔn)品相比，F(xiàn)WBE的DPPH自由基清除率較低，但當(dāng)FWBE的濃度為4 mg/mL時(shí)對(duì)DPPH的清除率可達(dá)79.40%，說(shuō)明FWBE具有良好的抗氧化效果。可能是由于DPPH與FWBE的酚羥基中氫原子容易發(fā)生反應(yīng)[29]。

圖1 FWBE對(duì)DPPH自由基的清除率Fig.1 Scavenging effect of FWBE on DPPH free radicals

2.1.2 羥基自由基清除能力 羥基自由基是一種化學(xué)性質(zhì)最活躍的自由基，危害性極大，在生物體內(nèi)攻擊細(xì)胞膜，造成細(xì)胞膜損傷；破壞DNA的堿基和糖基序列，導(dǎo)致雙螺旋結(jié)構(gòu)解體，甚至造成細(xì)胞死亡和突變[30?32]。因此，羥基自由基的清除活性常用于評(píng)價(jià)物質(zhì)清除自由基的能力。FWBE對(duì)羥基自由基的清除能力如圖2所示，羥基自由基的清除能力與FWBE的濃度呈劑量依賴性增加，且FWBE的羥基自由基清除能力顯著高于BHA（P<0.05）。FWBE對(duì)羥基自由基的IC50為3.315 mg/mL，且當(dāng)FWBE濃度為4 mg/mL，其羥基自由的清除能力可達(dá)到53.99%，而B(niǎo)HA則為32.98%，這說(shuō)明FWBE具有較好的羥基自由基清除能力。

圖2 FWBE對(duì)羥基自由基的清除率Fig.2 Scavenging effect of FWBE on hydroxyl radicals

2.1.3 還原力 還原力代表了物質(zhì)提供電子的能力，還原性強(qiáng)，說(shuō)明物質(zhì)抗氧化能力強(qiáng)，所以其是評(píng)價(jià)抗氧化能力的重要指標(biāo)之一[27,33]。FWBE還原力大小如圖3所示，還原力的大小與FWBE溶液濃度呈正相關(guān)；在實(shí)驗(yàn)研究的濃度范圍內(nèi)，同一濃度下FWBE的還原力顯著低于標(biāo)準(zhǔn)品BHA（P<0.05），但隨著FWBE濃度的增加，還原力增加。FWBE還原力的IC50（清除率/吸光度=50%/0.5時(shí)的樣品濃度）為1.611 mg/mL，同時(shí)當(dāng)濃度為4 mg/mL時(shí)FWBE的還原力可以達(dá)到1.11?？赡苁怯捎诮?jīng)過(guò)發(fā)酵后的麩皮可以將束縛型酚類物質(zhì)釋放，降低了氧化還原電位[34]。

圖3 FWBE的還原力Fig.3 Reducing power of FWBE

2.2 體內(nèi)抗氧化活性結(jié)果分析

2.2.1 FWBE對(duì)斑馬魚(yú)胚胎死亡率和孵化率的影響

為了評(píng)價(jià)FWBE對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育的毒性，分析了不同濃度的FWBE作用96 hpf后斑馬魚(yú)胚胎的死亡率和孵化率。如圖 4所示，在400和500 μg/mL的FWBE條件下，96 hpf時(shí)斑馬魚(yú)胚胎死亡率為50%。并且在最高試驗(yàn)濃度500 μg/mL時(shí)，胚胎始終沒(méi)有孵化。在50、100、150 μg/mL的FWBE條件下，對(duì)96 hpf斑馬魚(yú)胚胎無(wú)致死和抑制孵化的作用。FWBE的96 hpf-LC50（半致死濃度）是400 μg/mL。由于400和500 μg/mL FWBE溶液會(huì)造成斑馬魚(yú)半數(shù)致死且會(huì)抑制孵化，因此沒(méi)有對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步分析。但在發(fā)酵麩皮多糖對(duì)大鼠進(jìn)行處理時(shí)添加量最高可達(dá)400 mg/kg[35]，因此，推測(cè)斑馬魚(yú)較小導(dǎo)致耐受量降低。

圖4 FWBE對(duì)斑馬魚(yú)死亡率和孵化率的影響Fig.4 Effects of FWBE on mortality and hatchability of zebrafish

2.2.2 FWBE對(duì)AAPH誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)ROS產(chǎn)生率的影響 細(xì)胞中過(guò)量的ROS積累會(huì)損害細(xì)胞器和生物分子，如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸[36]。不同濃度的FWBE對(duì)斑馬魚(yú)體內(nèi)產(chǎn)生ROS的影響如圖5所示，經(jīng)過(guò)AAPH誘導(dǎo)后斑馬魚(yú)體內(nèi)ROS的產(chǎn)生量上升至106.30%（P<0.05），但經(jīng)過(guò)FWBE預(yù)保護(hù)后ROS的產(chǎn)生率顯著降低（P<0.05）。在FWBE濃度為100、200、300 μg/mL時(shí)，ROS的產(chǎn)生率分別降低至98.91%、102.29%、102.52%，與對(duì)照組差異不顯著（P>0.05），說(shuō)明起到了緩解由AAPH誘導(dǎo)所引起的ROS產(chǎn)生率上升的作用。

圖5 FWBE對(duì)AAPH誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)ROS產(chǎn)生率的影響Fig.5 Effect of FWBE on ROS production rate of zebrafish induced by AAPH

2.2.3 FWBE對(duì)AAPH誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)細(xì)胞死亡率的影響 FWBE對(duì)AAPH誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)體內(nèi)細(xì)胞死亡率的影響如圖6所示，凋亡細(xì)胞與熒光染料結(jié)合后發(fā)出較強(qiáng)的熒光，熒光圖像反映出經(jīng)AAPH誘導(dǎo)之后，斑馬魚(yú)體內(nèi)細(xì)胞死亡率上升至129.03%（P<0.05），而添加不同濃度的FWBE預(yù)保護(hù)后顯著降低了由AAPH誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞死亡（P<0.05），但是各濃度組間的緩解作用無(wú)顯著差異（P>0.05），其中，濃度為200 μg/mL時(shí)與對(duì)照組無(wú)顯著差異（P>0.05）。

圖6 FWBE對(duì)AAPH誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)細(xì)胞死亡率的影響Fig.6 Effect of FWBE cell on death rate of zebrafish induced by AAPH

2.2.4 FWBE對(duì)AAPH誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)脂質(zhì)過(guò)氧化程度的影響 DPPP可以穿透細(xì)胞膜，通過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)生的氫過(guò)氧化物誘導(dǎo)氧化并產(chǎn)生具有熒光的DPPP氧化物[37]。不同濃度的FWBE對(duì)斑馬魚(yú)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化程度的影響如圖7所示，經(jīng)過(guò)AAPH誘導(dǎo)后斑馬魚(yú)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化程度上升至117.20%（P<0.05），但經(jīng)過(guò)FWBE預(yù)保護(hù)后斑馬魚(yú)體內(nèi)的脂質(zhì)過(guò)氧化程度顯著降低（P<0.05）。除濃度為100 μg/mL與對(duì)照組間無(wú)顯著差異外（P>0.05），其余兩個(gè)濃度與對(duì)照組之間存在顯著差異（P<0.05），但二者之間的緩解作用無(wú)顯著差異（P>0.05）。

圖7 FWBE對(duì)AAPH誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)脂質(zhì)過(guò)氧化程度的影響Fig.7 Effect of FWBE on formation rate of lipid peroxidation induce of zebrafish induced by AAPH

2.3 FWBE對(duì)斑馬魚(yú)的心臟保護(hù)作用

斑馬魚(yú)的心臟是第一個(gè)發(fā)育和發(fā)揮功能的器官，在36 hpf心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)開(kāi)始，到72 hpf心臟功能逐步成熟[38]。心率作為體現(xiàn)心功能的重要指標(biāo)反應(yīng)出了心臟的泵血功能，而靜脈竇-動(dòng)脈球間距（SVBA）間距則可以顯示出心臟受損程度[39?40]。圖8和圖9表明，在特非那定誘導(dǎo)后斑馬魚(yú)的心臟出現(xiàn)明顯損傷，在卵黃囊處出現(xiàn)了一個(gè)腫包（圖8B），且當(dāng)在顯微鏡下觀察時(shí)斑馬魚(yú)的心率減慢。與空白對(duì)照組相比，經(jīng)過(guò)特非那定誘導(dǎo)后斑馬魚(yú)的心率顯著降低（P<0.05），SV-BA間距顯著加大（P<0.05），表明建模成功，特非那定成功誘導(dǎo)了斑馬魚(yú)心臟損傷。與特非那定組相比，添加50、100、150、200 μg/mL會(huì)顯著提高斑馬魚(yú)的心率（P<0.05），并且各濃度組間差異不顯著（P>0.05），但是當(dāng)濃度為200 μg/mL心率有所下降，所以在測(cè)定斑馬魚(yú)SV-BA間距時(shí)只選取濃度為50、100、150 μg/mL的FWBE。與特非那定組相比，添加50、100、150 μg/mL FWBE的斑馬魚(yú)SV-BA間距顯著減?。≒<0.05），且FWBE濃度為150 μg/mL時(shí)對(duì)斑馬魚(yú)的心臟保護(hù)作用最好，其心臟損傷修復(fù)率可達(dá)48.15%，表明FWBE對(duì)由特非那定造成的斑馬魚(yú)心臟損傷具有一定的緩解作用，可以起到保護(hù)心臟的功能。

圖8 FWBE對(duì)特非那定誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)心臟形態(tài)的影響Fig.8 Effect of FWBE on terfenadine-induced cardiac morphology in zebrafish heart

圖9 FWBE對(duì)特非那定誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)心率和心臟SVBA間距的影響Fig.9 Effects of FWBE on terfenadine-induced heart rate and cardiac SV-BA spacing in zebrafish

3 結(jié)論

本研究對(duì)FWBE的體外抗氧化效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)FWBE濃度為0~4 mg/mL對(duì)羥基自由基、DPPH自由基的清除率及還原力的值在逐漸上升，說(shuō)明FWBE具有一定的抗氧化能力。隨后，利用斑馬魚(yú)模型對(duì)FWBE的體內(nèi)抗氧化進(jìn)行評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)AAPH誘導(dǎo)使斑馬魚(yú)體內(nèi)的ROS水平、細(xì)胞死亡率和脂質(zhì)過(guò)氧化程度顯著增加（P<0.05），分別上升至106.30%、129.03%、117.20%。但加入不同濃度的FWBE處理后三個(gè)指標(biāo)顯著降低（P<0.05）。當(dāng)添加50、100、150 μg/mL的FWBE對(duì)特非那定誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)心臟損傷有不同程度的改善，其心率顯著升高及SV-BA間距顯著縮短（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為麥麩作為天然抗氧化劑和心臟保護(hù)劑提供了可靠的理論依據(jù)，證明麥麩具有很大的市場(chǎng)價(jià)值和應(yīng)用前景。