外源褪黑素對甜櫻桃果實褐變和品質(zhì)的影響

王 鋒，楊青珍, ，趙旗峰，張曉萍

（1.運城學(xué)院生命科學(xué)系，山西運城 044000；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹研究所，山西太谷 030800）

甜櫻桃果實色澤鮮艷、香味濃郁、營養(yǎng)豐富并具有較高的醫(yī)療保健價值，因此深受國內(nèi)外消費者的喜愛[1]。然而，甜櫻桃果實汁多、皮薄，不耐貯運，采收時節(jié)又多在高溫季節(jié)，采后極易褐變、腐爛，常溫下3~5 d便失去商品價值。因此，減輕甜櫻桃果肉褐變，延緩衰老，提高果實品質(zhì)是解決其貯運的關(guān)鍵問題。目前，有關(guān)甜櫻桃果實采后保鮮技術(shù)多數(shù)集中在對浸鈣[2]、香豆酸[3]、2,4-表油菜素內(nèi)酯[4]等的研究上。這些技術(shù)因投資成本較高，技術(shù)管理復(fù)雜，毒性殘留高等問題很難進行大范圍的推廣與應(yīng)用。因此，尋求經(jīng)濟、易操作、無毒副作用的甜櫻桃保鮮技術(shù)具有十分重要的意義。

褪黑素（N-acetyl-5-methoxytryptamine，MT）是廣泛存在于動植物體內(nèi)的一類重要的色氨酸吲哚類化合物[5]。MT具有促進植物生長發(fā)育、調(diào)控果實成熟和采后衰老及改善果實質(zhì)量等一系列生理功能[6]。它是一種良好的抗氧化劑，可以直接清除植物體內(nèi)的自由基，提高抗氧化酶和抗氧化劑的含量，并增加與抗氧化酶有關(guān)基因的表達，以保護植物不受過氧化損傷，最終維持細胞膜結(jié)構(gòu)的完整性[7]。果蔬中的MT很容易被人體利用，從營養(yǎng)角度來看，MT是一種維生素，與維生素A相似，對人體的健康有益[8]。據(jù)報道，外源褪黑素保持了桃果實細胞膜區(qū)域化結(jié)構(gòu)的完整性，使得多酚物質(zhì)與褐變酶無法接觸，同時抑制了多酚氧化酶（PPO）和過氧化物酶（POD）活性，導(dǎo)致多酚物質(zhì)氧化消耗減少并得到積累，最終抑制了果實褐變[9]。外源褪黑素可通過調(diào)節(jié)活性氧代謝、膜脂和能量代謝來延緩荔枝果實的褐變和衰老[10?11]。這些發(fā)現(xiàn)為MT參與果蔬采后衰老褐變提供了有效證據(jù)。但目前尚未見到MT在甜櫻桃采后褐變方面的應(yīng)用，本試驗通過研究外源褪黑素對冷藏過程中甜櫻桃果實褐變指數(shù)和相關(guān)生理生化指標(biāo)的影響，評價其減輕果實褐變的效果，以期為甜櫻桃貯運技術(shù)的改進提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

‘薩米脫’甜櫻桃果實 采自管理水平良好的甜櫻桃示范基地，果實八九成成熟度時采收，采收結(jié)束后1 h內(nèi)，迅速將果實運回實驗室；褪黑素、磷酸氫二鈉、氯化鎂、磷酸二氫鈉、硫代巴比妥酸、三氯乙酸、乙二胺四乙酸二鈉、氫氧化鈉、三氯乙酸、過氧化氫、氮藍四唑、鉬酸銨、核黃素、L-苯丙氨酸、聚乙烯吡咯烷酮、愈創(chuàng)木酚等 上海源葉科技有限公司。

TAI604型電子天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；DDS-307A電導(dǎo)率儀 上海佑科儀器儀表有限公司；Sigma3k15高速冷凍離心機 德國Sigma公司；UV-5500PC型紫外-可見分光光度計上海元新儀器有限公司；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋

上海精宏實驗設(shè)備有限公司；TA-XT Expressv3.1型質(zhì)構(gòu)儀 英國Stable Micro System公司；SDR-500型數(shù)顯糖度計 上海束句科儀有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 選取無機械損傷、無病、大小均一、帶果梗的正常果為實驗材料，隨機分成2組，每組60 kg，每組分成3個重復(fù)，每重復(fù)20 kg果實。將甜櫻桃果實分別浸入0 mmol·L?1（蒸餾水）、100 μmol·L?1MT溶液中浸泡5 min（前期預(yù)實驗基礎(chǔ)上篩選出來），晾干果實表面水分，平鋪于塑料筐（44 cm×33 cm×11 cm）中，筐外套0.03 mm PE保鮮袋，挽口不封袋，貯藏于0±1 ℃、相對濕度90%~95%的環(huán)境條件下。

貯藏過程中，定期取樣，每次取75個果，其中45個用于測定硬度、可滴定酸、可溶性固形物、細胞膜透性，同時果實切成2 mm3方塊，并以液氮速凍保存于?80 ℃的超低溫冰箱中，用于丙二醛（MDA）、抗壞血酸、O2?·、H2O2和酶活性的測定。另外30個果實，用于褐變指數(shù)的統(tǒng)計。在貯藏結(jié)束時，100個果實用于腐爛率的統(tǒng)計。

1.2.2 褐變指數(shù)和腐爛率測定 褐變指數(shù)參照楊青珍等[12]的方法進行。取30個果實，沿赤道部橫切。褐變指數(shù)分級：0級果肉無褐變；1級果肉褐變面積≤1/4；2級果肉褐變面積1/4~1/2；3級果肉褐變面積1/2~3/4；4級果肉褐變面積≥3/4。

1.2.3 硬度和可溶性固形物含量測定 硬度和可溶性固形物含量的測定參照FUENTEALBA等[1]的方法，略有修改。硬度測定：取15個果實，去果實赤道部相對兩面的皮，用英國TA-XT Express-v3.1型質(zhì)構(gòu)儀測果實硬度，探頭直徑為2 mm，以5 mm·s?1的速率進行下壓，下壓深度為2 mm，以最大峰值為硬度指標(biāo)，單位為N。

可溶性固形物含量的測定：取15個果實，用數(shù)顯糖度計測定，單位為%。

1.2.4 可滴定酸和抗壞血酸含量測定 可滴定酸參照YANG等[13]的方法，略有修改。取15個果實，稱取2.0 g混勻果肉，置于研缽中磨碎，滴加20 mL蒸餾水將勻漿液洗倒入50 mL離心管中搖勻，在4000 r·min?1離心10 min。將20 mL上清液倒入錐形瓶中，用0.1 mol·L?1NaOH進行滴定，終點設(shè)置為pH8.1，可滴定酸按蘋果酸計，單位%（質(zhì)量分數(shù)）。

抗壞血酸參照高俊鳳[14]的方法，略有修改。取15個果實，稱取2.0 g混勻果肉，加7.5 mL草酸-EDTA，研磨成漿，并仔細轉(zhuǎn)入10 mL離心管內(nèi)、經(jīng)10000 r·min?1離心10 min后，取1 mL上清液，在760 nm下測定吸光度，以mg·g?1鮮重（FW）表示。

1.2.5 O2?·產(chǎn)生速率和H2O2含量測定 O2?·產(chǎn)生速率和H2O2含量參考高俊鳳[14]方法測定，略有修改。

O2?·產(chǎn)生速率測定：取15個果實，稱取3.0 g果肉，加入6.0 mL50 mmol·L?1pH7.8磷酸鈉緩沖液（含1 mmol·L?1EDTA，1% TritonX-100和5% PVP），在冰浴條件下研磨勻漿，4 ℃ 10000 r·min?1離心15 min。取1.0 mL上清液，加入1.0 mL 50 mmol·L?1pH7.8磷酸緩沖液和1.0 mL l mmol·L?1的鹽酸羥胺溶液，搖勻后于25 ℃保溫20 min。然后加入1.0 mL 7 mmol·L?1α-萘胺溶液和1.0 mL l7 mmol·L?1對氨基苯磺酸溶液，混勻于30 ℃水浴顯色反應(yīng)30 min，在530 nm處測定吸光度值，以μmol·min?1·g?1FW表示O2?·產(chǎn)生速率。

H2O2含量測定：取15個果實，稱取2.0 g果肉，加入5 mL pH6.5磷酸緩沖液，在冰浴下研磨成勻漿，4 ℃ 10000 r·min?1離心15 min。取1 mL 提取液，加入0.1 mL 10%四氯化鈦-鹽酸溶液和0.2 mL濃氨水，反應(yīng)5 min后離心，沉淀用預(yù)冷丙酮洗滌2~3次，加入2.0 mL的2 mol·L?1硫酸溶解，進行比色測定，以μmol·g?1FW表示H2O2含量。

1.2.6 丙二醛含量和細胞膜相對透性測定 細胞膜相對透性參考YANG等[15]的方法測定。取15個果實，在果實赤道部去果皮，用1 cm直徑不銹鋼打孔器打孔，將果肉切成1 mm圓片，隨機取20個圓片置小燒杯中，加20 mL蒸餾水?dāng)嚢杈鶆?，平?0 min，期間不斷攪拌，然后測定電導(dǎo)率C1，沸水浴中煮15 min，冷卻后添加蒸餾水至20 mL，測定電導(dǎo)率C2。細胞膜相對透性（%）＝（C1/C2）×100

丙二醛（MDA）含量測定參考DHINDSA等[16]的方法測定。取15個果實，稱取2.0 g果肉，加入5.0 mL100 g·L?1三氯乙酸溶液，研磨成勻漿，4 ℃10000 r·min?1離心20 min。取2.0 mL上清液，加入3.0 mL硫代巴比妥酸，混合后在沸水浴中煮沸20 min，迅速冷卻，10000 r·min?1離心20 min，分別測定上清液在450、532和600 nm吸光度值。MDA含量（μmol·g?1FW）＝[6.45×（OD532-OD600）?0.56×OD450]×Vt/（Vs×m），Vt代表樣品提取液總體積，Vs代表測定時所取樣品提取液體積，m代表樣品質(zhì)量。

1.2.7 脂氧合酶（LOX）酶活性測定 LOX酶活性參照DING等[17]的方法測定，略有修改。取15個果實，取2 g果肉，加入2 mL提取緩沖液（含有1% Triton X-100和4% PVP），冰浴條件下迅速研磨成勻漿，4 ℃ 10000 r·min?1條件下離心20 min，取上清液用于LOX活性測定。采用3 mL 50 mmo1·L?1pH6.8磷酸鈉緩沖液反應(yīng)體系中包含0.1 mL 0.5%亞油酸溶液，30 ℃水浴反應(yīng)10 min，再加入0.2 mL酶液，混勻，在234 nm波長測定3 min內(nèi)吸光度值變化，每克果肉每分鐘0.01為一個酶活性單位，以U·min?1·g?1FW表示酶活性。

1.2.8 超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活性測定 SOD和CAT活性參照YANG等[15]方法，略有修改。取15個果實，稱取3 g左右的甜櫻桃果肉，加入6 mL pH7.8 100 mmol·L?1磷酸緩沖液（內(nèi)含1.0 mmol·L?1EDTA，50 g·L?1PVP，10 mL·L?1TritonX-100），冰浴條件下迅速研磨成勻漿，再在4 ℃10000 r·min?1離心15 min，取上清液分別測定SOD和CAT活性。

SOD采用3 mL 50 mmol·L?1pH7.8磷酸緩沖液反應(yīng)體系（130 mmol·L?1MET溶液、750 μmol·L?1NBT溶液、100 μmol·L?1EDTA-Na2、2 mmol·L?1核黃素和0.5 mL酶液），反應(yīng)混合液在4000 lx日光燈下反應(yīng)5 min后，在560 nm波長測吸光度，以抑制NBT光化還原50%為一個酶活性單位，U·h?1·g?1FW表示酶活性。

CAT采用3 mL 50 mmo1·L?1pH7.0磷酸緩沖液反應(yīng)體系中包含10 mmol·L?1H2O2和0.5 mL酶液，在240 nm波長測定3 min內(nèi)吸光度值變化，每克果肉每分鐘0.1吸光度值變化為一個酶活性單位，U·min?1·g?1FW表示酶活性。

1.2.9 多酚含量測定 多酚含量參照KAUR等[18]方法，略有修改。取15個果實，稱取1 g左右果實，加入1 mL預(yù)冷的60%乙醇，研磨成勻漿后，4 ℃10000 r·min?1離心30 min。取0.25 mL上清液分別加入試管中，再加入0.25 mL的福林酚試劑，混合靜置3 min后，再加入0.5 mL的12%碳酸鈉溶液，搖勻，定容到5 mL，20 ℃下避光2 h，在765 nm下測定吸光度，以mg·g?1FW表示。

1.2.10 褐變相關(guān)酶活性測定 PPO酶活性測定參考ZHANG等[19]方法，略有修改。取15個果實，稱量3 g果肉，加入5 mL 50 mmol·L?1、pH5.5乙酸-乙酸鈉緩沖液提取緩沖液，冰浴條件下迅速研磨成勻漿，4 ℃ 10000 r·min?1條件下離心15 min，3 mL 50 mmol·L?1pH5.5乙酸-乙酸鈉緩沖液包含1.0 mL 50 mmol·L?1鄰苯二酚溶液和0.5 mL酶液，在398 nm波長測定3 min內(nèi)吸光度值變化，每克果肉每分鐘吸光度值變化0.001為1個酶活性單位，U·min?1·g?1FW表示酶活性。

POD酶活性測定參考YANG等[13]方法，略有修改。取15個果實，稱取3 g左右的甜櫻桃果肉，加入6 mL pH6.8 100 mmol·L?1磷酸緩沖液（內(nèi)含1.0 mmol·L?1EDTA，50 g·L?1PVP，10 mL·L?1TritonX-100），在冰浴條件下迅速研磨成勻漿，之后4 ℃10000 r·min?1離心15 min，取上清液為待測酶液。3 mL 50 mmo1·L?1pH7.0磷酸緩沖液反應(yīng)體系（包含10 mmol·L?1H2O2、10 mmol·L?1愈創(chuàng)木酚和0.3 mL酶液），在470 nm波長測定3 min內(nèi)吸光度值變化，每克果肉每分鐘吸光度值變化0.001為1個酶活性單位，U·min?1·g?1FW表示酶活性。

苯丙氨酸氨裂合酶（PAL）酶活性的測定參考ASSIS等[20]方法測定，略有修改。取15個果實，稱取2.0 g果肉，加入5.0 mL 50 mmol·L?1pH8.8硼酸緩沖液（內(nèi)含5.0 mmol·L?1巰基乙醇，1.0 mmol·L?1EDTA-Na2，5%甘油，5% PVP），在冰浴條件下研磨勻漿，于4 ℃10000 r·min?1，離心15min，取上清液為待測酶液。3 mL pH8.8 0.1 mol·L?1硼酸鹽緩沖液反應(yīng)體系包含0.5 mL 20 mmol·L?1L-苯丙氨酸，在37 ℃下預(yù)熱10 min，加入0.3 mL酶液，混勻并將反應(yīng)管在37 ℃下保溫60 min，之后迅速加入0.1 mL 6 mmol·L?1濃鹽酸終止反應(yīng)，并在290 nm處測定吸光度值。每克果肉每分鐘吸光度值變化0.001為1個酶活性單位，以U·min?1·g?1FW表示酶活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SAS8.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（SE）表示結(jié)果，采用最小顯著極差法檢驗差異顯著性，差異顯著水平為0.05。同時，利用Excel和Origin2017軟件做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源MT處理對甜櫻桃果實褐變指數(shù)和腐爛率的影響

褐變不僅影響果蔬的商品價值，也降低了果蔬的內(nèi)在品質(zhì)。由圖1A可知，甜櫻桃果實在低溫貯藏過程中褐變指數(shù)整體呈上升趨勢，在貯藏前14 d果實都沒有發(fā)現(xiàn)褐變癥狀，對照果實21 d先表現(xiàn)出褐變癥狀，且褐變指數(shù)上升較快。MT處理果實在冷藏的28 d后表現(xiàn)出褐變癥狀，35 d至貯藏結(jié)束其褐變指數(shù)顯著低于對照（P<0.05），貯藏結(jié)束時其褐變指數(shù)比對照降低20.9%。

圖1 外源MT對甜櫻桃果實褐變指數(shù)（A）和腐爛率（B）的影響Fig.1 Effect of melatonin treatment on the browning index (A)and decay rate (B) of sweet cherry during storage

由圖1B可知，貯藏結(jié)束時MT處理果實的腐爛率比對照顯著降低33.3%（P<0.05）。說明MT可抑制果實腐爛，這與褪黑素在獼猴桃中的研究結(jié)果相一致[21]。MT抑制果實腐爛作用可能與其抑菌作用有關(guān)，其作用機理有待于進一步研究。

2.2 外源MT處理對甜櫻桃果實品質(zhì)的影響

果實硬度、可溶性固形物、可滴定酸、抗壞血酸含量是甜櫻桃果實品質(zhì)的重要指標(biāo)，其值大小能夠反映果實品質(zhì)的好壞。由圖2A可知，甜櫻桃果實硬度整體呈下降趨勢，MT處理可抑制硬度下降，21 d至貯藏結(jié)束與對照差異達顯著水平（P<0.05），貯藏結(jié)束時其硬度比對照提高9.9%。

圖2 外源MT對甜櫻桃果實硬度（A）、可溶性固形物（B）、可滴定酸（C）和抗壞血酸（D）含量的影響Fig.2 Effect of melatonin treatment on firmness (A), TSS (B),titratable acidity (C), and ascorbic acid content (D) of sweet cherry during storage

由圖2B可知，可溶性固形物含量呈現(xiàn)先上升后下降趨勢。對照果實可溶性固形物含量下降最快，MT處理抑制其下降，21 d至貯藏結(jié)束與對照差異達顯著水平（P<0.05），貯藏結(jié)束時其含量比對照提高7.1%。

可滴定酸是影響果蔬品質(zhì)的重要因素之一。由圖2C可知，可滴定酸含量在低溫貯藏過程中整體呈下降趨勢。MT處理可抑制可滴定酸含量下降，35 d至貯藏結(jié)束與對照差異達顯著水平（P<0.05），貯藏結(jié)束時其含量比對照提高17.1%。

由圖2D可知，抗壞血酸含量呈降低趨勢，對照果實的抗壞血酸含量下降較快，MT處理可抑制其下降，49 d至貯藏結(jié)束與對照差異達顯著水平（P<0.05），貯藏結(jié)束時其含量比對照提高40.8%。

MT處理抑制硬度、可滴定酸、可溶性固形物和抗壞血酸含量下降，保持了良好的品質(zhì)，可能與MT延緩果實衰老，抑制營養(yǎng)成分分解有關(guān)，這與褪黑素在水蜜桃[9]、鮮切梨[22]等果實的研究結(jié)果一致。

2.3 外源MT處理對甜櫻桃果實O2?·、H2O2、MDA含量和相對膜透性的影響

由圖3A可知，O2?·產(chǎn)生速率總體呈上升趨勢。MT處理抑制其上升趨勢，其O2?·始終低于對照（P<0.05），21 d至貯藏結(jié)束與對照差異均達顯著水平（P<0.05）。

由圖3B可知，H2O2含量總體呈上升期趨勢。MT處理抑制其上升趨勢，其H2O2含量始終低于對照（P<0.05），21 d至貯藏結(jié)束與對照差異均達顯著水平（P<0.05）。

MDA是膜脂過氧化作用的主要產(chǎn)物之一。由圖3C可知，丙二醛含量總體呈上升趨勢。MT處理抑制其上升趨勢，其含量始終顯著低于對照（P<0.05），21 d至貯藏結(jié)束與對照差異均達顯著水平（P<0.05）。

相對膜透性的高低反映了細胞膜的完整程度和穩(wěn)定性。由圖3D可知，相對膜透性整體呈上升趨勢。MT處理果實相對膜透性始終低于對照（P<0.05），21 d至貯藏結(jié)束與對照差異均達顯著水平（P<0.05）。

圖3 外源MT處理對甜櫻桃果實O2?·產(chǎn)生速率（A）、H2O2（B）、MDA含量（C）和相對膜透性（D）的影響Fig.3 Effect of melatonin treatment on O2?· generation rate(A), H2O2 (B), MDA (C) content, and cell membrane relative permeability (D) of sweet cherry during storage

O2?·和H2O2等活性氧是果蔬細胞正常代謝副產(chǎn)物，在衰老和低溫逆境等條件下，活性氧代謝會失衡，過量的活性氧會攻擊細胞膜，導(dǎo)致細胞膜脂化，促使細胞膜脂過氧化產(chǎn)物MDA積累和細胞膜相對透性提高，從而破壞膜結(jié)構(gòu)，打破了細胞區(qū)域化結(jié)構(gòu)，促使底物和酶大量接觸，引起果實褐變[22]。因而O2?·、H2O2、MDA和細胞膜相對透性變化可以作為甜櫻桃果實衰老褐變重要指標(biāo)。結(jié)合O2?·、H2O2、MDA和細胞膜相對透性變化，可以看出MT處理降低活性氧，減少細胞膜脂過氧化產(chǎn)物MDA積累和細胞膜相對透性的提高，保持細胞膜完整性，從而促使底物和酶分布于細胞不同區(qū)域，抑制褐變發(fā)生。這與外源MT抑制荔枝[23]、雙孢菇[24?25]等果蔬褐變結(jié)果一致。

2.4 外源MT處理對甜櫻桃果實LOX活性的影響

由圖4可知，冷藏過程中LOX酶活性呈上升趨勢。MT處理抑制其上升趨勢，14 d至貯藏結(jié)束與對照差異達顯著水平（P<0.05）。

圖4 外源MT處理對甜櫻桃果實LOX活性的影響Fig.4 Effect of argon melatonin treatment on LOX activity of sweet cherry during storage

LOX以多不飽和脂肪酸為底物，催化膜脂過氧化，從而降低脂質(zhì)不飽和度，改變細胞膜流動性，打破細胞膜區(qū)室化，為酚類底物和褐變相關(guān)酶接觸提供了條件，促使褐變發(fā)生。因而LOX酶可作為甜櫻桃果實衰老褐變的一個重要指標(biāo)。結(jié)合LOX酶活性變化，可以看出MT處理降低了LOX酶活性，抑制了膜脂過氧化進程，保護了細胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性，從而促使底物和酶分布于細胞不同區(qū)域，抑制褐變發(fā)生。本研究結(jié)果與JANNATIZADEH[26]使用100 μmol·L?1外源褪黑素處理石榴的實驗結(jié)果基本一致，說明外源褪黑素可以顯著降低采后甜櫻桃的LOX酶活性（P<0.05），從而抑制甜櫻桃果實衰老褐變。

2.5 外源MT對甜櫻桃果實SOD和CAT活性的影響

SOD活性可以清除細胞中多余的超氧陰離子自由基，防止對細胞膜造成傷害。由圖5A可知，SOD活性呈現(xiàn)先上升后下降。MT處理促進SOD活性上升抑制其下降，貯藏過程中其活性始終高于對照，14 d至貯藏結(jié)束與對照差異達顯著水平（P<0.05）。

圖5 外源MT對甜櫻桃果實SOD（A）和CAT（B）活性的影響Fig.5 Effect of melatonin treatment on SOD activity (A) and CAT activity (B) of sweet cherry during storage

由圖5B所示，CAT活性呈先上升后下降的變化趨勢。MT處理促進CAT活性上升抑制其下降，貯藏過程中其活性始終高于對照，14 d至貯藏結(jié)束與對照差異達顯著水平（P<0.05）。

SOD酶可歧化O2?·成H2O2，CAT酶進而將H2O2清除出去，從而減少對細胞膜脂過氧化作用，保護細胞膜結(jié)構(gòu)與功能完整性[27]。因此SOD和CAT酶活性是反映果蔬衰老和死亡的一個重要指標(biāo)。本研究結(jié)果與喬沛等[10]使用50 μmol·L?1外源褪黑素處理荔枝的實驗結(jié)果基本一致，說明外源褪黑素可以顯著提高采后甜櫻桃的SOD和CAT酶活性。

2.6 外源MT處理對甜櫻桃果實多酚含量的影響

由圖6可知，甜櫻桃在冷藏過程中多酚含量呈先上升后下降的趨勢。MT處理可促進其上升抑制其下降，其含量始終高于對照，21 d至貯藏結(jié)束與對照差異達顯著水平（P<0.05）。

圖6 外源MT處理對甜櫻桃果實多酚含量的影響Fig.6 Effect of melatonin treatment on polyphenol content of sweet cherry during storage

多酚是果蔬中重要的抗氧化物質(zhì)，可提高果蔬的抗逆性和抗病性，同時可被氧化成有色素物質(zhì)而導(dǎo)致褐變發(fā)生[28]。褐變底物多酚含量的多少可反映果蔬褐變發(fā)生的程度。褐變底物多酚含量越高，說明褐變發(fā)生的程度越輕。結(jié)合多酚含量變化可以看出，MT處理促進多酚含量上升并抑制其下降，使其含量保持在較高水平，說明MT處理的甜櫻桃果實褐變發(fā)生程度較輕。這與外源MT抑制南果梨[29]褐變結(jié)果一致。

2.7 外源MT處理對甜櫻桃果實褐變相關(guān)酶活性的影響

PPO能將多酚類物質(zhì)氧化成醌而引起果蔬褐變。由圖7A可知，甜櫻桃在冷藏過程中PPO酶活性呈先上升后下降的趨勢。MT處理抑制PPO酶活性上升促進其下降，其活性始終低于對照，21 d至貯藏結(jié)束與對照差異達顯著水平（P<0.05）。

POD能催化過氧化物對酚類物質(zhì)的氧化。由圖7B可知，甜櫻桃果實在冷藏過程中POD酶活性在0~35 d間呈上升趨勢，在35 d之后呈現(xiàn)迅速下降。MT酶活性都低于對照，21 d至貯藏結(jié)束與對照差異達顯著水平（P<0.05）。

圖7 外源MT處理對甜櫻桃果實PPO、POD和PAL活性的影響Fig.7 Effect of melatonin treatment on PPO activity (A), POD activity (B), and PAL activity (C) of sweet cherry during storage

PAL能將該代謝途徑的中間產(chǎn)物及進一步轉(zhuǎn)化的酚類類黃酮物質(zhì)氧化成褐色物質(zhì)。由圖7C可知，在冷藏過程中PAL酶活性的呈上升趨勢，MT處理抑制PAL酶活性上升，21 d至貯藏結(jié)束與對照差異達顯著水平（P<0.05）。

酚類物質(zhì)酶促氧化是果實發(fā)生褐變的關(guān)鍵。PPO、PAL和POD是引起果實酶促褐變的關(guān)鍵酶[30?31]。這些酶能將果實中的酚類物質(zhì)氧化為顏色更深的醌類物質(zhì)，從而導(dǎo)致果實組織發(fā)生褐變。因而PPO、PAL和POD酶可以作為甜櫻桃果實衰老褐變的重要指標(biāo)。結(jié)合PPO、PAL和POD酶活性變化，可以看出MT處理降低了PPO、PAL和POD酶活性，抑制褐變發(fā)生。相似的有關(guān)外源MT抑制PAL、PPO和POD酶活性而抑制褐變已在水蜜桃[9]和香蕉[32]等果蔬中證實。但對于褪黑素處理是如何抑制褐變相關(guān)酶活性及保持較高多酚含量，其調(diào)控褐變的分子機理尚不十分清楚，有待于進一步研究。

3 結(jié)論

褪黑素是一種重要的吲哚胺激素，具有延緩衰老，提高抗逆性等作用，近年來己廣泛應(yīng)用于獼猴桃、荔枝、香蕉、梨、黃瓜、番茄等果蔬保鮮中。本試驗結(jié)果顯示外源褪黑素處理能夠顯著（P<0.05）抑制褐變指數(shù)上升，降低了33.3%腐爛率，并顯著（P<0.05）延緩了硬度、可滴定酸、可溶性固形物和抗壞血酸含量的下降。說明褪黑素在抑制甜櫻桃果實褐變，保持果實營養(yǎng)品質(zhì)方面發(fā)揮著重要作用。MT處理還可提高SOD和CAT酶活性，抑制LOX酶活性上升，并降低O2?·和H2O2積累，顯著減少膜脂過氧化產(chǎn)物MDA和相對膜透性的增加（P<0.05）。同時，MT處理抑制POD、PPO、PAL酶活性，并保持較高多酚含量，最終抑制甜櫻桃果實褐變。MT處理抑制甜櫻桃果實褐變可能與提高抗氧化酶活性，降低膜脂過氧化程度，保持細胞膜結(jié)構(gòu)完整性和抑制褐變相關(guān)酶活性密切相關(guān)。本研究結(jié)果將為褪黑素抑制非躍變型果蔬衰老褐變提供重要理論參考，又因褪黑素價格便宜、操作簡單，無毒副作用，因而具有廣闊的應(yīng)用前景。