氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定乳粉中22種鄰苯二甲酸酯

王金翠，王晰銳

（1.黑龍江省天潤檢驗檢測研究院有限公司，黑龍江哈爾濱 150009；2.黑龍江省藥品審核查驗中心，黑龍江哈爾濱 150001）

鄰苯二甲酸酯類（Phthalate Esters，PAEs）為鄰苯二甲酸的酯化衍生物，是目前使用最普遍的一類增塑劑和軟化劑，自20世紀(jì)初，PAEs就廣泛地在酒類、油脂、乳制品、兒童食品等各類食品及食品包裝材料中檢出，同時在人體脂肪、血清、毛發(fā)中也曾檢出DBP、DEHP等PAEs類物質(zhì)[1?2]。有文獻(xiàn)指出，PAEs不僅會危害人體免疫以及消化系統(tǒng)[3?4]，損害動物及人類生殖系統(tǒng)[5?6]，大劑量攝入還會對動物產(chǎn)生致畸和致突變作用[7?8]，更有動物實驗曾驗證DBP會產(chǎn)生致DNA損傷的危害[8]。

目前，DBP、DEP、DEHP、DMP、DOP及BBP已被美國環(huán)?？偩至腥搿皟?yōu)先污染物名單”；歐盟（2004/73/EC）公告也將DBP、DEP列為第2類生殖毒性化合物[9]，針對鄰苯二甲酸酯類污染，我國2011年出臺的《衛(wèi)辦監(jiān)督函〔2011〕551號》已規(guī)定食品、食品添加劑中的DBP、DEHP及DINP的最大殘留量分別為0.3、1.5、9 mg/kg。在對PAEs類污染物進(jìn)行監(jiān)測的過程中發(fā)現(xiàn)，油脂及其制品、乳及乳制品等脂溶性較強(qiáng)，在生產(chǎn)、加工、儲運過程中接觸塑料管道或塑料包裝的食品，易通過浸泡、摩擦、溶解等物理或化學(xué)作用存在較大的遷移風(fēng)險，在溫度較高、接觸時間較長等情況下更易發(fā)生PAEs遷移[10?13]。

食品中鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)檢測方法主要有氣相色譜法（GC）、液相色譜法（HPLC）、氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）、液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法（LC-MS/MS）等[14?17]。相對于質(zhì)譜方法，GC和HPLC法存在定性能力不足的問題，且在檢測通量方面存在較大局限性[18?19]，LC-MS/MS法常常存在本底干擾，系統(tǒng)空白較難控制，GC-MS是目前較為常用的測定方法[20]。然而，在GC-MS檢測過程中發(fā)現(xiàn)大多數(shù)鄰苯二甲酸酯類化合物都存在一個相同的碎片離子，其余離子碎片響應(yīng)值都較低[21?23]，用于成分較復(fù)雜的乳粉等樣品檢測時存在檢測方法靈敏度不高、專屬性不強(qiáng)等問題[24?26]。而相對于GC-MS，GC-MS/MS具有的多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式，不僅具有更好的專屬性，也能夠在很大程度上降低復(fù)雜樣品基質(zhì)干擾，提高檢測靈敏度[27]。本研究以乳粉為研究對象，利用鹽析的原理以液液萃取的方式提取PAEs，樣品制備過程簡單，結(jié)合GC-MS/MS檢測方法，建立一種靈敏度更高、專屬性更強(qiáng)的乳粉中PAEs檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳粉 市售嬰幼兒乳粉（一段）；乙腈、甲醇、正己烷、乙酸乙酯 色譜級，德國Fisher公司；氯化鈉

優(yōu)級，科密歐；鄰苯二甲酸酯 標(biāo)準(zhǔn)品，德國Dr.Ehrenstorfer-Schafers公司：鄰苯二甲酸二乙酯（DEP）、鄰苯二甲酸二烯丙酯（DAP）、鄰苯二甲酸二異丁酯（DIBP）、鄰苯二甲酸二丙酯（DPrP）、鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）、鄰苯二甲酸二（2-乙氧基）乙酯（DEEP）、鄰苯二甲酸二己酯（DHXP）、鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯（DEHP） 標(biāo)準(zhǔn)品，純度均為99.0%；鄰苯二甲酸二異丙酯（DIPrP）、鄰苯二甲酸二（2-丁氧基）乙酯（DBEP） 標(biāo)準(zhǔn)品，純度均為98.5%；鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）、鄰苯二甲酸二異戊酯（DIPP）、鄰苯二甲酸二環(huán)己酯（DCHP）、鄰苯二甲酸二苯酯（DPhP）、鄰苯二甲酸二壬酯（DNP）、鄰苯二甲酸二異癸酯（DIDP） 標(biāo)準(zhǔn)品，純度均為99.5%；鄰苯二甲酸二（2-甲氧基）乙酯（DMEP） 純度94.0%；鄰苯二甲酸二（4-甲基-2-戊基）酯（BMPP） 純度98.0%；鄰苯二甲酸二戊酯（DPP） 純度99.2%；鄰苯二甲酸丁芐酯（BBP） 純度97.0%；鄰苯二甲酸二己酯（DHP）

純度98.2%；鄰苯二甲酸二正辛酯（DNOP） 純度97.5%；水 屈臣氏蒸餾水。

GCMS-7000D氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（配電子轟擊離子（EI）源） 安捷倫有限公司；3-18K臺式低溫離心機(jī) 德國SIGMA公司 ；MS105DU電子天平 德國梅特勒公司；Talboys渦旋混合器上海安譜實驗科技股份有限公司；KQ5200DE超聲振蕩器 昆山市超聲儀器有限公司；WS21水浴振蕩搖床 德國WIGGENS；NRY-100C空氣振蕩搖床

上海培因?qū)嶒瀮x器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳粉中PAEs的提取 稱取混合均勻的乳粉試樣2.00 g置于25 mL具塞玻璃離心管中，加入5 mL水，5 g氯化鈉，待分散混勻后，再加入10 mL乙腈，渦旋混勻1 min，超聲提?。?00 W）10 min后4000 r/min下離心5 min，收集上清液。再向殘渣中加入10 mL乙腈重復(fù)提取一次后合并上清液于另一玻璃離心管中。將上清液于40 ℃氮吹至近干，加入5 mL乙腈渦旋清洗管壁，再繼續(xù)吹至近干，用2 mL乙腈復(fù)溶，放入?18 ℃冰箱冷藏2 h，10000 r/min低溫（4 ℃）離心5 min，取上清液，即為待測樣品溶液。

1.2.2 空白樣品基質(zhì)溶液及基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制取不含鄰苯二甲酸酯類化合物的乳粉樣品，按照樣品前處理方法，制成空白樣品基質(zhì)溶液。用乙腈溶解鄰苯二甲酸酯類標(biāo)準(zhǔn)品，配制成濃度為1.0 mg/mL的單標(biāo)儲備液，吸取一定體積單標(biāo)儲備液，用乙腈稀釋成濃度為1.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，再用空白基質(zhì)溶液稀釋成系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（5、10、50、100、500 ng/mL）。

1.2.3 GC-MS/MS條件

1.2.3.1 氣相色譜條件 色譜柱：HP-5MS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣：高純氦氣；流速：1.0 mL/min；升溫程序：初始柱溫50 ℃，保持2 min，以30 ℃/min升至160 ℃ ，保持2 min，以3 ℃/min升至220 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升至240 ℃，保持2 min，以2 ℃/min升至280 ℃，保持 5 min，以10 ℃/min升至300 ℃，保持2 min；進(jìn)樣量：1 μL，不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣口溫度為250 ℃；溶劑延遲：4 min。

1.2.3.2 質(zhì)譜條件 離子源：EI；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；傳輸線溫度：280 ℃；淬滅氣：高純氦氣，2.5 mL/min；碰撞氣：高純氮氣，1.5 mL/min；采集模式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），鄰苯二甲酸酯類化合物MRM采集參數(shù)見表1。

表1 22種鄰苯二甲酸酯類化合物MRM參數(shù)Table 1 MRM parameters of 22 PAEs

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用外標(biāo)法進(jìn)行定量，以控制變量法優(yōu)化實驗條件，通過標(biāo)準(zhǔn)加入法，計算目標(biāo)物質(zhì)加標(biāo)回收率進(jìn)行結(jié)果評價。使用儀器配套工作站MassHunter 以及Microsoft Excel 2020進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，每個實驗重復(fù)進(jìn)行3次，取均值進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 實驗本底的控制

鄰苯二甲酸酯類廣泛存在于環(huán)境及各類實驗耗材中，因此實驗室必須進(jìn)行本底值的控制和系統(tǒng)評價。所用的有機(jī)試劑應(yīng)為色譜級或質(zhì)譜級，無機(jī)試劑需要經(jīng)過高溫烘烤（200 ℃，2 h）；在實驗過程中避免使用任何未經(jīng)本底考察的塑料制品；玻璃器皿使用前應(yīng)洗凈，先以丙酮浸泡2 h，再置于干燥箱干燥（100 ℃，12 h），冷卻后使用；使用過程中避免使用尼龍材質(zhì)濾膜；檢測樣品的同時，需做兩次試劑空白試驗，取其平均值作為系統(tǒng)本底值，當(dāng)實驗室的系統(tǒng)空白小于方法檢出限的三分之一時，本底值可忽略不計，否則應(yīng)扣除空白值。

2.2 乳粉中PAEs提取條件的優(yōu)化

以市售乳粉為測試樣品，以加標(biāo)回收方式，在40 μg/kg加標(biāo)水平下，考察正己烷、乙酸乙酯、乙腈、甲醇四種經(jīng)初步篩選的溶劑對PAEs的提取效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖1），乙腈提取效率最高，22種PAEs回收率在84.5%~109.1%之間，乙酸乙酯提取回收率最低，為67.3%~104.2%。這可能是由于乳粉中存在較多的脂溶性物質(zhì)，而正己烷、乙酸乙酯易與油脂互溶，導(dǎo)致過多脂溶性雜質(zhì)被溶出，產(chǎn)生較大基質(zhì)干擾，此外，正己烷、乙酸乙酯均為弱極性溶劑，對中等極性的PAEs提取效果不佳；以乙腈、甲醇為溶劑，由于其脂溶性較弱，基質(zhì)干擾較小，通過檢驗數(shù)據(jù)還可以發(fā)現(xiàn)，相比于甲醇，乙腈對PAEs具有更好的提取效率，四種提取溶劑回收率大小順序為乙腈>甲醇>正己烷>乙酸乙酯。

圖1 提取溶劑對PAEs回收率的影響Fig.1 Effects of extraction solvents on the recoveries of PAEs

本研究還對PAEs提取方式和提取時間進(jìn)行了考察，分別以水浴振蕩、空氣振蕩、超聲提取，圖2結(jié)果表明，超聲提取22種PAEs回收率在84.5%~109.1%之間，水浴振蕩提取回收率在83.8%~104.4%之間，而空氣振蕩提取回收率在80.4%~101.0%之間，超聲提取方式加標(biāo)回收率最高，并且相比超聲提取10 min，超聲提取15 min時提取效率并未有明顯提高，因此，確定以乙腈為提取溶劑，超聲提取10 min為乳粉中PAEs最優(yōu)提取條件。

圖2 提取方式對PAEs回收率的影響Fig.2 Effects of extraction methods on the recoveries of PAEs

2.3 基質(zhì)效應(yīng)的考察

GC-MS/MS殘留分析中普遍存在基質(zhì)效應(yīng)，多表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，通過以空白基質(zhì)樣品溶液配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，與同濃度純?nèi)軇ㄒ译妫┡渲茦?biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)值進(jìn)行比對，以ME值評價基質(zhì)效應(yīng)，ME=（空白基質(zhì)中待測物的響應(yīng)值/乙腈中待測物的響應(yīng)值），ME<0.85評價為基質(zhì)抑制，ME>1.15評價為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，0.85≤ME≤1.15則認(rèn)為其基質(zhì)效應(yīng)較小[28]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，22種待測物ME值均大于1，僅5種待測物表現(xiàn)為較小的基質(zhì)效應(yīng)，其余17種待測物在基質(zhì)中均存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，因此，以純?nèi)軇┣€進(jìn)行校準(zhǔn)會產(chǎn)生較大的偏差，需要以基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行校準(zhǔn)，用以消除基質(zhì)效應(yīng)，保證定量結(jié)果的準(zhǔn)確性，具體結(jié)果如圖3所示。

圖3 乳粉中22種鄰苯二甲酸酯類的基質(zhì)效應(yīng)Fig.3 Matrix effects of 22 phthalate esters in milk powder

2.4 GC-MS/MS分析參數(shù)優(yōu)化

采用鄰苯二甲酸酯含量均為1 μg/mL的單組分標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以全掃描方式分別對22種目標(biāo)化合物進(jìn)行全掃描，結(jié)合NIST譜庫檢索結(jié)果確定各自的保留時間。在單離子掃描模式（SIM）下，根據(jù)所獲得的一級質(zhì)譜圖選取質(zhì)荷比較大、信號響應(yīng)較強(qiáng)的1~2離子碎片作為母離子完成第一次篩選；再以不同的碰撞能（5~40 V）使一級篩選下獲得的母離子斷裂，形成子離子，為每個母離子選取1~2個信號響應(yīng)強(qiáng)的離子作為子離子，完成目標(biāo)物的二級質(zhì)譜條件篩選。以其中強(qiáng)度較大的離子對作為定量離子對，另一個則作為定性離子對，22種化合物的保留時間及質(zhì)譜采集參數(shù)如表1所示。

在研究過程中發(fā)現(xiàn)，雖然大多數(shù)PAEs僅有一個較大的分子量為149的碎片離子，而二級質(zhì)譜（GC-MS/MS）獨有的多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式，可將149作為母離子，在一定碰撞能量下繼續(xù)斷裂生成子離子，經(jīng)過兩次篩選，避免了一級質(zhì)譜SIM采集模式下大多數(shù)鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)均以149作為離子碎片所引起的檢測方法專屬性不好、選擇性較差的問題，進(jìn)而提高了檢測的靈敏度。

2.5 線性范圍、檢出限、定量限、準(zhǔn)確度與精密度

方法的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限、回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果見表2?；谀茱@示基線噪聲的分析方法，以加標(biāo)樣品中目標(biāo)物定量離子對信噪比3倍為檢出限，在取樣質(zhì)量為2 g，樣品終體積為2 mL的條件下計算方法的檢出限，22種鄰苯二甲酸酯化合物方法檢出限在1~5 μg/kg之間；通過對基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的線性關(guān)系考察，發(fā)現(xiàn)在5~500 ng/mL范圍內(nèi)，各物質(zhì)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.99；以市售乳粉為測試樣品，以上述優(yōu)化后的方法，通過加標(biāo)回收的方式考察方法準(zhǔn)確度和精密度，22種鄰苯二甲酸酯類化合物，在20 μg/kg的加標(biāo)水平下，回收率在82.4%~111.4%之間，在40 μg/kg的加標(biāo)水平下，回收率在84.5%~109.1%之間，在100 μg/kg的加標(biāo)水平下，回收率在90.6%~103.7%之間，每個加標(biāo)水平進(jìn)行6次平行測定，全部組分相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%。

表2 線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限、回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 2 Linearity, correlation coefficient (r), limits of detection (LOD), limits of quantitations (LOQ), recovery and relative standard deviation (RSD) (n=6)

3 討論與結(jié)論

本研究將樣品用水溶解后以乙腈為溶劑提取乳粉中的PAEs，以GC-MS/MS的MRM模式進(jìn)行檢測，本方法樣品制備過程簡單，很大程度上減少了實驗室前處理過程及耗材帶來的本底污染，以空白基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)曲線很大程度降低了基質(zhì)效應(yīng)，22種PAEs在20~100 μg/kg加標(biāo)水平下，回收率在82.4%~111.4%之間，符合GB/T 27404-2008[29]對檢驗方法回收率的要求（80%~120%），該法不但能夠有效降低樣品基質(zhì)干擾，提高乳粉中PAEs檢測靈敏度，而且前處理過程快速便捷，可以減少樣品前處理過程中鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)的引入，是一種高效便捷、靈敏度高、穩(wěn)定性好的乳粉中鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)的檢測方法。