液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定調(diào)味醬中85種酸性合成色素

林子豪，毛新武，周慶瓊，崔世博，陳羽中，戚 平, ，錢振杰，曾 瑋

（1.廣州市食品檢驗所，廣東廣州 511400；2.華南理工大學食品科學與工程學院，廣東廣州 510641；3.沃特世科技（上海）有限公司，上海 201203）

合成色素著色力強、價格便宜、穩(wěn)定性好[1]，常用于食品中色澤的增強。但合成色素主要以苯、甲苯等工業(yè)原料，經(jīng)磺化、偶氮化等一系列有機反應(yīng)制得，進入人體吸收后會在體內(nèi)分解成潛在的致癌物質(zhì)，對人體造成不同程度的傷害[2]。合成色素按結(jié)構(gòu)可以分為偶氮類、芳甲烷類、蒽醌類、雜環(huán)類、菁類、靛類等[3]。自2008年以來，我國陸續(xù)發(fā)布了1~5批《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑名單》，公布了部分非食用色素名單。根據(jù)GB 2760-2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》[4]，我國僅允許使用日落黃等11種酸性合成色素，并規(guī)定了使用限量。國際《食品添加劑通用法典標準》規(guī)定了食品中僅允許使用胭脂紅、赤蘚紅、日落黃、莧菜紅、堅牢綠、亮藍、靛藍、誘惑紅等8種酸性合成色素[5]。但合成色素種類繁多，不法商人在非食用色素的使用上層出不窮，給食品安全帶來隱患[6?7]。

目前，合成色素的監(jiān)督檢測主要關(guān)注蘇丹紅[8]、羅丹明[9]等堿性非食用色素以及胭脂紅、日落黃等酸性可食用色素[10?11]，酸性非食用色素的監(jiān)測存在盲區(qū)。酸性色素檢測方法的現(xiàn)有報道主要有液相色譜法[12?16]和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[17?23]。液相色譜法在面對調(diào)味醬等復雜基質(zhì)樣品時容易受到天然色素的干擾，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法特異性強、靈敏度高，適用于復雜基質(zhì)樣品中酸性合成色素的高通量檢測。本研究以調(diào)味醬為研究對象，優(yōu)化色譜、質(zhì)譜條件和前處理方法，建立85種酸性合成色素的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜篩查方法，為合成色素的監(jiān)管提供技術(shù)支撐保障。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲醇、乙腈、甲酸銨、乙酸銨 色譜純，美國Thermo Fisher Scientific公司；0.22 μm聚四氟乙烯濾膜 上海安譜科學儀器有限公司；喹啉黃（純度99.50%）、偶氮玉紅（純度92%）、酸性紅60、酸性橙10、日落黃（純度90%）、鉻變素2R、鉻變素2B、酸性黃17、滂酰洋紅2B（純度93.0%）、酸性紅13、酸性紅17、熒光素鈉、滂酰紫6R、酸性紅265（純度95.0%）、酸性紅87（純度90.0%）、酸性紅52、酸性紫49、酸性紫34、酸性紅9、酸性紅 88、酸性紅92（純度85.0%）、酸性紅94、酸性紅151、直接黃8、酸性橙 6、酸性綠50、酸性藍92、酸性綠16、酸性橙20、二甲苯青FF、藏花橙 G、酸性綠9、酸性橙17、酸性藍83、酸性藍90、酸性綠27（純度75.0%）、酸性黑1（純度97.0%）、酸性黃36（純度98.0%） 日本TCI公司；酸性紅44、酸性紅66（純度60%）、剛果紅（純度98.0%）、酸性紅71、麗春紅3R、酸性黃9（純度95%）、酸性紫7（純度40%）、酸性紅50（純度60%）、酸性橙8（純度65%）、酸性藍113（純度50%） 美國Sigma公司；酸性紫3、甲基橙（純度98.0%）、酸性綠A（純度97.0%）、酸性紅289、酸性蘭27（純度98%）、酸性藍3 德國CNW公司；檸檬黃（純度90.0%）、新紅（純度92.0%）、靛藍（純度89%）、堅牢綠（純度94.9%）、胭脂紅SX（純度90.5%）、酸性藍1（純度100.0%）、酸性黃11（純度74.6%）、酸性紫9（純度72.0%）、酸性藍62（純度91.6%）、酸性橙II（純度94%） 德國Dr.Ehrenstorfe GmbH公司；酸性紅33、酸性綠41、食品紅105 美國IL公司；酸性棕14（純度98%）、顏料紅49（純度98%） 上海damas-beta公司；酸性藍7、乙基曙紅

美國Chemservice公司；溶劑藍37 美國Santa Cruz公司；酸性黑210 上海麥克林生化科技有限公司；莧菜紅（濃度0.5 mg/mL）、胭脂紅（濃度0.5 mg/mL）、亮藍（濃度0.5 mg/mL） 中國計量科學研究院；誘惑紅（濃度1.0 mg/mL）、赤蘚紅（濃度1.0 mg/mL） 北京海岸鴻蒙標準物質(zhì)技術(shù)有限責任公司；酸性紅26（純度96.0%）、色酚黃S、食品黑1（純度96.0%）、酸性紅1（純度98.0%）、橙黃IV（批號：BCBJ7871V）、酸性紅73（純度97.0%） 美國FLUKA公司；酸性藍41（純度98%） 上海金錦樂實業(yè)有限公司；番茄醬、辣椒醬等50批次樣品 購自廣州市某幾十個大型超市和生產(chǎn)企業(yè)。

Waters Xevo TQ-S超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國Waters公司；M37610-33CN旋渦振蕩混合器 美國Thermo Fisher Scientific公司；BSA2202S電子天平 德國Sartorius公司；Allegra X-30R冷凍離心機 美國貝克曼庫爾特公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制 檸檬黃、酸性紅33、食品黑1、溶劑藍37、酸性黑210、酸性綠9、酸性紅289、酸性綠41、酸性紫34、顏料紅49、酸性紅92、酸性紅94、食品紅105、酸性藍83、酸性藍90等15種化合物：準確稱取0.05 g標準品，用甲醇溶解并定容至10 mL，得到5.0 mg/mL的標準儲備液；移取適量各標準品溶液，用甲醇稀釋，得到濃度為100.0 mg/L的混合標準中間液1。

其余化合物：準確稱取0.05 g標準品，用甲醇溶解并定容至50 mL，得到1.0 mg/mL的標準儲備液；移取適量各標準品溶液，用甲醇稀釋，得到濃度為10.0 mg/L的混合標準中間液2。

1.2.2 樣品前處理 準確稱取2.00 g樣品（精確至0.01 g）放置于50 mL離心管中，加入10 mL甲醇，于旋渦振蕩混合器上渦旋5 min，以10000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液；殘渣用10 mL甲醇重復提取一次，合并上清液。取2 mL上清液置于5 mL離心管中，加入200 mg C18凈化劑，旋渦1 min后，10000 r/min離心5 min，得到提取液1（以1 g為基準，樣品稀釋10倍）。吸取1 mL提取液1，用水稀釋至10 mL，得到提取液2（以1 g為基準，樣品稀釋100倍），過膜后待測[24]。

1.2.3 實驗條件

1.2.3.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3 （100 mm×2.1 mm, 1.8 μm）；柱溫：40 ℃；進樣體積：2 μL；流速：0.4 mL/min；流動相A為5 mmol/L乙酸銨水溶液，流動相B為甲醇；梯度：0~1 min，2%B；1~15 min，2%~95%B；15~18 min，95%B；18~21 min，95%~2%B[25]。

1.2.3.2 質(zhì)譜條件 離子化模式：ESI-；電噴霧離子源溫度為150 ℃；多反應(yīng)監(jiān)測模式；毛細管電壓為2.5 kV；脫溶劑氣溫度為500 ℃；脫溶劑氣流量為1000 L/h；錐孔氣流量為150 L/h；碰撞氣（氬氣）壓力為0.05 MPa[26]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

方法重復性及回收率試驗均做6次重復試驗，采用Excel 2016 進行數(shù)據(jù)整理、分析，儀器數(shù)據(jù)采集軟件為MassLynx 4.1，數(shù)據(jù)分析軟件為TargetLynx 3.12。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

分別配制濃度為1.0 μg/mL的各化合物標準溶液，儀器進樣自動優(yōu)化各化合物母離子、子離子、碰撞能量、錐孔電壓等參數(shù)，各優(yōu)化參數(shù)見表1。由于酸性色素為多鈉鉀鹽化合物，在負離子模式下響應(yīng)較好，離子峰類型均表現(xiàn)為[M-mNa/K+nH]（m-n）-，電荷數(shù)從1~4不等。對于一鈉和二鈉鹽化合物，除雜環(huán)類的二鈉鹽外，離子峰類型表現(xiàn)為失去所有的鈉；對于三鈉或以上鹽化合物，離子峰類型表現(xiàn)為失去所有的鈉后加上一個氫離子。

表1 85種酸性色素的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS/MS parameters of 85 acid pigments

續(xù)表 1

2.2 色譜條件的優(yōu)化

由于酸性色素多為極性較強的離子型化合物，因此在流動相中添加適量的緩沖鹽能有效增強化合物的保留效果并改善峰型[27]?？疾炝?00 ng/mL的標準溶液在甲醇-5 mmol/L乙酸銨和甲醇-5 mmol/L甲酸銨兩種流動相體系下各化合物的響應(yīng)情況，結(jié)果表明，大部分化合物在甲醇-5 mmol/L乙酸銨的流動相體系下色譜峰響應(yīng)較高（見圖1），因此，本研究采用甲醇-5 mmol/L乙酸銨作為流動相。85種酸性色素的總離子流圖如圖2所示。

圖1 兩種流動相的化合物響應(yīng)值比較Fig.1 Comparison of response between two mobile phase

圖2 85種酸性色素的總離子流圖Fig.2 TIC chromatogram of 85 acid pigments

以保留時間最小的檸檬黃為對象，考察了1、2、4、6、8、10 μL等不同進樣量對色譜峰峰型的影響，結(jié)果如圖3所示。當進樣量在4 μL以上時，色譜峰開始出現(xiàn)明顯的分叉，表現(xiàn)出較強的溶劑效應(yīng)。因此，本研究選擇2 μL作為進樣量。

圖3 不同進樣量對檸檬黃色譜峰的影響Fig.3 Influence of different injection volume on tartrazine

2.3 前處理方法的優(yōu)化

由于調(diào)味醬基質(zhì)復雜，樣品提取后，提取液中含有大量的共提取物，在質(zhì)譜測定時共流出，使待測物的信號發(fā)生增強或減弱，因此需要對基質(zhì)效應(yīng)進行消除。當基質(zhì)效應(yīng)控制在?20%~20%的范圍內(nèi)時[28]，可以認為基質(zhì)效應(yīng)較弱，基本不影響樣品定量。消除基質(zhì)效應(yīng)常見的方法有配制基質(zhì)標準、采用內(nèi)標法定量等。但由于食品種類繁多，配制基質(zhì)標準需要耗費大量的時間；色素品種較多內(nèi)標物較少，難以對所有色素進行覆蓋。因此，本研究在保證靈敏度的前提下，采用增大提取液稀釋倍數(shù)的方式降低基質(zhì)效應(yīng)。分別以提取液1和提取液2作溶劑配制標準曲線，采用計算公式（B/A?1）×100計算基質(zhì)效應(yīng)，其中B為基質(zhì)曲線斜率，A為相應(yīng)的溶劑曲線斜率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當稀釋倍數(shù)為100倍時，基質(zhì)效應(yīng)有了明顯的下降（圖4），同時100倍稀釋也減少了溶劑效應(yīng)的干擾。

圖4 稀釋10倍與稀釋100倍基質(zhì)效應(yīng)比較Fig.4 Comparison of matrix effect between diluted 10 times and 100 times

2.4 方法學評估

將85種色素混合標準溶液配制成系列濃度（檸檬黃、酸性紅33、食品黑1、溶劑藍37、酸性黑210、酸性綠9、酸性紅289、酸性綠41、酸性紫34、顏料紅49、酸性紅92、酸性紅94、食品紅105、酸性藍83、酸性藍90線性范圍為100~1000 ng/mL，其余為10~100 ng/mL，以質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標作校正曲線，結(jié)果如表2所示。以信噪比（S/N=3）計算85種色素的檢出限，檢出限在8.08~885.2 μg/kg之 間，定 量 限 在26.94~2950.7 μg/kg之間。按照實驗測定步驟，選取空白基質(zhì)，以高（25/2.5 mg/kg）、中（10/1.0 mg/kg）、低（5/0.5 mg/kg）3個濃度水平進行加標回收試驗。結(jié)果表明，85種酸性色素的回收率為70.2%~116.5%，相對標準偏差為0.1%~15.0%。該方法回收率和重復性良好，滿足日常檢測需求。

表2 85種酸性色素的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限和回收率Table 2 Linear range, correlation coefficients (r), limits of detections (LODs), limits of quantification (LOQs) and recoveries of 85 acid pigments

2.5 實際樣品檢測

按照實驗方法，對市售的番茄醬、辣椒醬等樣品共計50批次進行檢測，在2批次樣品中篩查出酸性紅13、酸性橙II等禁止使用的色素（見表3），但含量較低，推測是使用了工藝較差的可食用色素作為原料。

表3 調(diào)味醬篩查結(jié)果Table 3 Screening result of sauce

續(xù)表 2

3 結(jié)論與討論

本實驗采用液相色譜結(jié)合質(zhì)譜法對調(diào)味醬中85種酸性合成色素進行檢測，優(yōu)化了流動相、進樣量等色譜條件以及質(zhì)譜條件，采用增大稀釋倍數(shù)的方式降低基質(zhì)效應(yīng)，建立了一個快速簡便的通用型分析方法。與現(xiàn)有固相萃取方法相比[10?11]，本方法采用QuEChERS凈化技術(shù)，操作較簡便；與其他高通量分析方法相比[20?23]，本方法通過優(yōu)化前處理方法，減少配制基質(zhì)曲線的步驟，在日常監(jiān)督檢測時可提高檢測效率。本方法通用性強，檢測對象范圍較廣，分析時間短，靈敏度高，為食品中合成色素的監(jiān)管提供強有力的技術(shù)保障。