闕 鳳,高天麒,汪 超,熊光權(quán),石 柳,吳文錦,喬 宇,丁安子,李 新,汪 蘭,
(1.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院,湖北武漢 430068;2.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所,湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心農(nóng)產(chǎn)品加工研究分中心,湖北武漢 430064)
隨著中國漁業(yè)經(jīng)濟的穩(wěn)步發(fā)展,淡水魚產(chǎn)量不斷提高,魚類產(chǎn)品加工業(yè)不斷發(fā)展,對草魚的需求不斷增加。草魚是中國傳統(tǒng)的四大家魚之一,是重要的淡水魚品種,價格優(yōu)、產(chǎn)量高及肉厚刺少等特點使其常作為魚糜加工的主要原料之一[1]。魚糜制品是魚類深加工中的產(chǎn)品,大多為魚糜凝膠,因其高蛋白、低膽固醇、低脂肪、口感鮮嫩、食用方便等特點,具有廣闊的利用價值,越來越受到消費者的重視[2]。為了延長魚糜制品貨架期,最常用的方法是低溫儲存;然而,魚肉蛋白質(zhì)在凍藏過程中容易發(fā)生變性,導(dǎo)致魚肉品質(zhì)惡化,魚肉蛋白質(zhì)的保水性、可溶性和凝膠性等功能降低,將會影響魚糜制品的味道和營養(yǎng)價值[3]。通常采用添加抗凍劑的方式防止魚糜蛋白質(zhì)冷凍變性,當(dāng)前商用抗凍劑主要包括4%蔗糖和4%山梨糖醇的混合物(簡稱“商業(yè)抗凍劑”)。且在工業(yè)化生產(chǎn)的魚糜中添加4%~8%的蔗糖作為冷凍保護劑,但是蔗糖的甜度和熱量較高,不符合現(xiàn)代生活中人們對健康飲食的追求[4],關(guān)于開發(fā)低甜度、低熱量抗凍劑的研究有待進一步深入。
葡聚糖是以葡萄糖為單糖組成的同型多糖,葡萄糖單元之間由糖苷鍵相連接,僅由D-葡萄糖組成,主鏈?zhǔn)铅粒?,6)鍵,也有α(1,4)或α(1,3)鍵的支鏈。它能夠減少低密度脂蛋白含量,提高高密度脂蛋白的含量。海藻糖是由兩個葡萄糖分子以α,α,1,1-糖苷鍵構(gòu)成的非還原性糖,甜度是蔗糖的45%,性質(zhì)穩(wěn)定[5]。海藻糖能較好地防止蛋白質(zhì)在冷凍、高溫或干燥時變性,有效保護蛋白質(zhì)分子的天然結(jié)構(gòu),使食品的風(fēng)味和質(zhì)地保持不變[6]。低聚果糖是由β-D-呋喃果糖苷酶作用于蔗糖,使蔗糖分子中的D-果糖以β-(2→1)糖苷鏈連接1~3個果糖而成的,屬于果糖和葡萄糖構(gòu)成的直鏈雜低聚糖,具有超強雙歧因子和水溶性膳食纖維,有類似于糖或葡萄糖漿的功能,提供良好平衡的甜味特征[7],其甜度為蔗糖的30%~60%。低聚木糖是一種低分子量功能性多糖,由2~7個木糖分子和β-1,4糖苷鍵組成。蘇趙等[8]的研究表明海藻糖能抑制草魚魚糜蛋白在凍藏過程中的變性,延緩魚糜凍藏品質(zhì)的下降。Chou等[9]的研究表明,添加低聚木糖,在低溫條件下鹽溶性蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和溶解性高于添加其他糖類或組合,推測低聚木糖可能會降低蛋白質(zhì)疏水基團的暴露。Wang[10]指出魚糜凝膠中添加魔芋葡甘露聚糖(KGM)會影響魚糜凝膠的持水性、膠強度和變性。多糖是高分子量聚合物,廣泛用于食品的增稠、成膜、凝膠等,多糖和蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用形成復(fù)合物,會改變蛋白質(zhì)凝膠特性[11]。
本實驗擬在魚糜制品加工過程中分別添加4%葡聚糖、蔗糖、海藻糖、低聚果糖、低聚木糖,探討其對草魚魚糜微觀結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、水分分布、白度、凝膠質(zhì)構(gòu)特性等性質(zhì)的影響,旨在為糖類抗凍劑在魚糜制品加工中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
新鮮草魚(質(zhì)量約4 kg) 購自白沙洲水產(chǎn)市場;葡聚糖(7000 Da)、蔗糖、海藻糖(378.33 Da)、低聚果糖(180.158 Da)、低聚木糖(300.28~1050.98 Da)、氯化鈉、十二烷基硫酸鈉、雙縮脲試劑、標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白 購自上海源葉生物科技有限公司;其他試劑均為分析純。
PL602-L電子天平、AL104電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;JJ-1精密增力電動攪拌器 國華電器有限公司;IKA均質(zhì)機 廣州東南科創(chuàng)科技有限公司;DHG-9078A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海精宏實驗設(shè)備有限公司;GL-21M高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司;CR-400/410色彩色差儀 美能達(中國)投資有限公司;Eclipse CI光學(xué)顯微鏡、NMI20-025V-I成像系統(tǒng)日本尼康公司;NMI20-025V-I核磁共振成像分析儀
蘇州紐邁分析儀器股份有限公司;TA.XT 2i/50質(zhì)構(gòu)儀 英國Stable Micro Systems公司;VERTEX70傅里葉變換紅外光譜儀 德國Bruker Optice公司。
1.2.1 草魚魚糜凝膠的制備 將新鮮草魚帶冰水于30 min內(nèi)活運至實驗室,于4 ℃冷庫宰殺,去魚鱗、內(nèi)臟,清洗干凈后取草魚背部肉,去除可見的紅色肉、結(jié)締組織等,切碎用斬拌機低速(5擋)斬拌5 min,將粉碎后的草魚肉用五倍體積的冷水和0.5%NaCl溶液沖洗,然后將碎肉通過四層300目紗布過濾,脫水2次以獲得魚糜,處理過程中溫度保持在10 ℃以下(冷庫中進行)。稱取一定質(zhì)量的魚糜,用斬拌機低速(5檔)斬拌1 min,分別加入魚糜質(zhì)量2%的NaCl和4%的糖類,將混合物的水分含量調(diào)整至78%,高速(9檔)斬拌5 min后裝入裱花袋,擠壓灌入腸衣,兩端封口,控制其長度和直徑分別為15 cm和3 cm。將制好的魚腸于90 ℃恒溫水浴鍋中加熱30 min,然后置于冰水中冷卻15 min,于4 ℃冰箱中冷藏過夜,次日取出測定相關(guān)指標(biāo)。以不添加糖的魚糜凝膠為空白對照[12]。
1.2.2 微觀結(jié)構(gòu) 將魚糜凝膠用軟刀片切成2.5 mm×2.5 mm×2.5 mm的小塊置于1.5 mL的離心管中,加入2倍體積的2.5%的戊二醛,置于4 ℃冰箱放置2~24 h;用0.1 mol/L PBS緩沖溶液(pH7.0)洗滌3次,每次浸泡10~15 min;用不同濃度乙醇(30%、50%、70%、90%、100%)進行梯度洗脫,每次浸泡10~15 min;100%的乙酸異戊酯洗脫一次浸泡5~10 min,重新更換乙酸異戊酯浸泡樣品,存放于4 ℃冰箱。將樣品冷凍干燥后用導(dǎo)電膠固定在樣品臺上,樣品表面真空噴金,用掃描電鏡觀察,加速電壓為20 kV[13]。
1.2.3 傅里葉紅外光譜分析 取適量添加不同糖的草魚魚糜凍干樣品置于檢測器上,程序參數(shù):掃描范圍4000~400 cm?1,分辨率4 cm?1,掃描頻率10 kHz[14]。
1.2.4 低場核磁共振測定樣品水分分布 參考李銀等[15]的方法并加以修改,使用NMI20-025V-I核磁共振分析及成像系統(tǒng)測定樣品水分與組織結(jié)合程度和水分分布情況。將魚糜凝膠切成18 mm×18 mm×20 mm的長方體,在磁共振成像儀上通過多自旋回波(MSE)成像序列獲得凝膠的質(zhì)子密度成像。重復(fù)時間為1500 ms,回波時間為18.2 ms,中心頻率為23.319 MHz。凝膠成像層面為4,每層厚度為2.0 mm。
1.2.5 白度的測定 參考胡亞芹等[16]的方法,用色度儀測定并記錄L*(明亮度)、a*(紅綠偏差)和b*(黃藍(lán)偏差)值,每個樣品測量平行10次。白度按下列公式計算:
1.2.6 質(zhì)地剖面分析TPA(Texture profile analysis)測定 參考王蒙娜等[17]的方法,使用配備有探針P/36R的質(zhì)構(gòu)分析儀進行魚糜凝膠的質(zhì)構(gòu)圖分析(TPA)。將凝膠樣品切成厚度為2 cm圓柱體,在40%的壓縮度下壓縮,測試前和測試后的速度設(shè)定為2 mm/s,測試速度為1 mm/s以獲得TPA參數(shù)(硬度、彈性、粘結(jié)性、咀嚼性和回復(fù)性)。使用5.0 g觸發(fā)力,觸發(fā)類型為auto。
所有實驗均重復(fù)3次,所得數(shù)據(jù)均采用Microsoft Excel 2019,Origin-2017及Graph Pad Prism 5軟件進行統(tǒng)計處理及繪圖。
圖1所顯示的分別為空白對照和添加4%的葡聚糖、蔗糖、海藻糖、低聚果糖、低聚木糖的草魚魚糜凝膠在掃描電鏡下的微觀結(jié)構(gòu)。從圖中可以看出空白對照組魚糜凝膠網(wǎng)絡(luò)組織結(jié)構(gòu)較疏松,孔洞較大(圖1A);添加葡聚糖、蔗糖的魚糜樣品形成了更緊密的凝膠三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),孔洞較小且分布相對均勻(圖1B,圖1C);添加海藻糖的魚糜凝膠較致密,其表面存在較多大小不一的孔洞(圖1D);添加低聚果糖的魚糜凝膠切面凹凸不平(圖1E);添加低聚木糖的魚糜凝膠分布較均勻,但表面比較疏松出現(xiàn)了空隙,孔洞較大(圖1F)。多糖分子結(jié)構(gòu)特殊,與魚糜凝膠肌原纖維蛋白結(jié)合相互作用會形成網(wǎng)絡(luò)交織[11]。添加4%的多糖均有利于草魚肌原纖維蛋白凝膠形成均勻致密的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),且添加葡聚糖和蔗糖的效果最好,可能是糖作為填料填充了蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)之間的間隙,加強其結(jié)構(gòu)[18]。含低聚果糖樣品中無明顯網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成,推測與添加量有關(guān),可能是因為低聚果糖聚合度較?。▓D1E)。精細(xì)而有序的凝膠網(wǎng)絡(luò)更有可能吸收水[19],使得魚糜凝膠網(wǎng)絡(luò)中的破裂太嚴(yán)重而不能形成連續(xù)相[7];不同種類多糖對魚糜凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響不同,這很可能與糖類自身凝膠形成能力有關(guān)。不同種類糖在最適添加量下的魚糜凝膠的致密程度、孔洞大小以及分布存在一定的差異性[20]。
圖1 不同糖類對魚糜凝膠的微觀掃描電鏡圖(2000×)Fig.1 Electron micrograph of microscopic scanning of surimi gel with different carbohydrates (2000×)
紅外光譜中酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅲ帶可用于定量分析蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)含量,其中酰胺Ⅰ帶信號強,但酰胺Ⅰ帶結(jié)構(gòu)中有水振動帶的強干擾和相對非結(jié)構(gòu)化的光譜輪廓等限制[21]。因此,本文采用紅外光譜中酰胺Ⅲ帶(1220~1330 cm?1)分析魚糜凝膠蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu),如圖2B所示。α-螺旋和β-折疊為肌原纖維蛋白主要的二級結(jié)構(gòu),空白組、添加蔗糖、海藻糖、低聚果糖、低聚木糖和葡聚糖的魚糜凝膠α-螺旋結(jié)構(gòu)相對含量分別為39.26%、36.99%、35.7%、37.51%、42.85%和39.6%,β-折疊含量為19%~30%。添加低聚木糖樣品中α-螺旋的含量最高為42.85%,葡聚糖樣品中β-轉(zhuǎn)角含量最高為22.23%,海藻糖樣品二級結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲含量最高為20.87%。與空白相比,添加蔗糖、海藻糖和低聚果糖魚糜凝膠中α-螺旋結(jié)構(gòu)占比下降。Zhuang等[22]報道添加魔芋葡甘低聚糖會使豬肉肌原纖維蛋白中α-螺旋含量減少,β-折疊含量增加。Hong等[23]也表明樹膠促進了魚糜蛋白的α-螺旋轉(zhuǎn)化為其他結(jié)構(gòu)。添加不同低分子糖類的魚糜凝膠二級結(jié)構(gòu)不一樣,這可能是由于糖的分子組成及糖苷鍵不一樣,與魚糜蛋白質(zhì)形成凝膠過程中相互作用有差異。
圖2 不同糖類對魚糜凝膠蛋白的FTIR分析Fig.2 FTIR analysis of different carbohydrates on surimi gel protein
MRI是利用磁場和射頻脈沖使樣品中的氫核振動發(fā)出射頻信號,然后經(jīng)計算機處理后成像的一種技術(shù),通過該技術(shù)可以獲得肌肉中水分的高分辨率MRI成像[24]。質(zhì)子密度圖像可以直觀地觀察樣品中水的空間分布[25],核磁共振成像還可以突出樣品中水的不同相的信號,若信號值強顯紅色,無信號值顯藍(lán)色,同時其質(zhì)子密度越高,MRI圖像中亮度越強,樣品中水分含量越高[26]。常用低信號強度(暗或藍(lán)色區(qū)域)是反映與大分子相關(guān)的結(jié)合水或不動水,而高信號強度(亮或紅色)則表示自由的水[27]。由圖3A可知,在空白樣品、添加蔗糖和海藻糖的魚糜凝膠核磁成像為亮綠色,添加低聚木糖和葡聚糖的魚糜凝膠為藍(lán)色,低聚果糖介于兩者之間;部分圖片中能觀察到少量橙色光點,提示有水分子分布不均勻的現(xiàn)象。圖3B為草魚魚糜凝膠橫向弛豫時間T2分布,可以明顯觀察到T22和T23兩個峰。根據(jù)水分子與組分結(jié)合的緊密情況,一般將橫向弛豫時間在0~10 ms水分子定義為結(jié)合水(T21),這部分水與蛋白質(zhì)結(jié)合緊密;橫向弛豫時間在10~100 ms的水分子定義不可移動水(T22),這部分水位于肌原纖維蛋白凝膠結(jié)構(gòu)之中;橫向弛豫時間大于100 ms的水分子定義為自由水(T23),可以自由運動,這部分水在凝膠結(jié)構(gòu)外[18]。顯然,魚糜凝膠的T21和T23較小,表明具有更強的結(jié)合水和限制水分子自由運動的能力[18]。與對照組相比,5種多糖的添加均減緩了魚糜凝膠的水分遷移。如表1所示,與空白魚糜凝膠相比,添加蔗糖的魚糜凝膠,T22顯著升高,T23顯著降低(P<0.05);添加葡聚糖、海藻糖、低聚果糖、低聚木糖均增加了魚糜凝膠的T21和T22,說明這幾類糖的添加會降低魚糜凝膠的水分子運動性,這可能是自由水轉(zhuǎn)移至不可移動水中,水的流動性降低所導(dǎo)致。除蔗糖外,所有糖均增加了魚糜凝膠中結(jié)合水(P21),但降低了魚糜凝膠自由水(T23)所占比例P23,說明在魚糜中添加糖促進了水與蛋白質(zhì)更緊密的結(jié)合,而且限制水分子從不可移動水轉(zhuǎn)變?yōu)樽杂伤?。不同種類的糖最適添加量有所不同,添加量不足或過量均會引起蛋白質(zhì)分子聚集[28],當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)高速聚集時,魚糜凝膠形成具有不均勻和大孔的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[29],可能影響到凝膠中水分子的運動性。
圖3 糖類對魚糜凝膠核磁共振成像偽彩圖和水分分布的影響Fig.3 Effect of various carbohydrates on surimi gel MRI pseudo-color image and water distribution
表1 不同糖類對魚糜凝膠水分分布的影響Table 1 Effect of different carbohydrates on the water distribution of surimi gel
質(zhì)構(gòu)和白度是衡量魚糜品質(zhì)的重要指標(biāo)[30]。添加不同種類糖的草魚魚糜白度如圖4A及表2所示,添加5種糖均不會對魚糜凝膠樣品的外觀色澤造成影響。圖1B為不同種類糖溶液,其中低聚木糖糖溶液偏黃,葡聚糖糖溶液呈淡黃色。Duangmal等[31]和Gao等[32]發(fā)現(xiàn)魚糜凝膠的顏色特征主要取決于添加劑的類型。低聚木糖溶液呈黃色,降低了魚糜凝膠白度。添加蔗糖、海藻糖、低聚果糖、葡聚糖可在一定程度上增加凝膠的白度(P<0.05)。如表2所示,添加5種糖的魚糜凝膠硬度和咀嚼性顯著降低(P<0.05),彈性和膠黏性無明顯變化,多糖的加入會減小魚糜發(fā)生形變時所產(chǎn)生的應(yīng)力。其中低聚果糖樣品的硬度、彈性和咀嚼性最低,這可能是因為低聚果糖水分活度較高、粘度較大,硬度降低,而對彈性的影響不大(P>0.05)。添加葡聚糖樣品的回復(fù)性最低,為0.373±0.006,推測這可能與糖的分子量有關(guān)。若干研究報告稱,肉類產(chǎn)品的凝膠強度或彈性降低可能會導(dǎo)致咀嚼性或膠黏性下降[18,33],而Cardoso等[34]的研究則持相反的結(jié)果。這些差異取決于所用肉和添加劑的類型。
表2 不同糖類對魚糜凝膠質(zhì)構(gòu)特性和白度的影響Table 2 Effects of different carbohydrates on the texture properties and whiteness of surimi gel
由表3可知,添加糖后的魚糜凝膠咀嚼性與硬度極顯著相關(guān)(P<0.01),β-折疊與其回復(fù)性顯著正相關(guān)(P<0.05),無規(guī)則卷曲與硬度、咀嚼性、白度之間顯著相關(guān)(P<0.05),無序結(jié)構(gòu)與彈性呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。魚糜凝膠的二級結(jié)構(gòu)與質(zhì)構(gòu)特性有關(guān),推測可能是因為部分糖替代蛋白質(zhì),蛋白分子間相互交聯(lián),與Zhang等[35]報道結(jié)果一致,α-螺旋減少,無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)增加,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化,魚糜凝膠的咀嚼性和回復(fù)性下降。由于形狀不規(guī)則,無規(guī)則卷曲和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)的相對含量不利于有序凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成[36]。Zhuang等[22]也表示魚糜凝膠強度與α-螺旋轉(zhuǎn)換為其他類型的二級結(jié)構(gòu)有關(guān)。
表3 添加不同種類糖對魚糜凝膠特性各指標(biāo)的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of various indexes of surimi gel properties by adding different kinds of carbohydrates
本文主要探究了添加葡聚糖、蔗糖、海藻糖、低聚果糖和低聚木糖等不同糖對草魚魚糜凝膠特性的影響。添加4%葡聚糖、蔗糖和海藻糖可以促進致密有序的凝膠網(wǎng)絡(luò)形成。糖的分子組成不同,與蛋白質(zhì)交聯(lián)形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)有所差異,對肌原纖維蛋白的二級結(jié)構(gòu)作用不同,無序結(jié)構(gòu)多,魚糜凝膠彈性較好。糖的添加會使魚糜凝膠中的自由水轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢梢苿铀徒Y(jié)合水。添加葡聚糖、蔗糖、海藻糖和低聚果糖可在一定程度上提高草魚魚糜凝膠的白度,但是降低了魚糜凝膠的質(zhì)構(gòu)凝膠特性,5種糖均導(dǎo)致草魚魚糜凝膠的硬度和咀嚼性顯著下降,說明糖與魚糜凝膠蛋白質(zhì)之間可能結(jié)合發(fā)生相互作用,進而改變了魚糜凝膠的質(zhì)構(gòu)。