延黃牛脂制備高純度1，3-甘油二酯工藝

曲可心

高青山1,2

姚輝耀1

劉龍龍1

張 華1,2

李鉉軍1

(1. 延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002; 2. 延邊大學(xué)東北寒區(qū)肉牛科技創(chuàng)新教育部工程研究中心，吉林 延吉 133002)

延邊黃牛因其適應(yīng)能力強(qiáng)、產(chǎn)肉率高且肉質(zhì)鮮美多汁等備受歡迎，是目前中國(guó)較好的肉牛培育品種之一[1]。其宰前重量為500 kg時(shí)，含牛脂約25～50 kg，占體重的5%～10%。延黃牛脂是由健康牛新鮮、干凈和完整的脂肪組織提煉而成，精煉后的牛脂呈類白色或淺黃色，因其風(fēng)味特殊可用于火鍋底料、烘焙制品、調(diào)味品等各類食品加工中[2-3]。

現(xiàn)代火鍋以川渝火鍋為代表，其底料油大多采用牛油(甘油三酯)，然而牛油因飽和脂肪酸及膽固醇含量較高，過多食用會(huì)損害人體健康[4]。而結(jié)構(gòu)酯是通過改變甘油三酯中脂肪酸的種類及位置得到的人工合成脂質(zhì)，可以實(shí)現(xiàn)特定的理化性質(zhì)與生理作用。研究[5]表明，1,3-甘油二酯(sn-1,3-DAG)因其消化途徑與甘油三酯不同，具有減少脂肪累積、抑制體重增加、預(yù)防高血脂的作用。sn-1,3-DAG作為火鍋底料油替代品將在一定程度上具有預(yù)防及緩解肥胖癥、心血管疾病、脂肪肝等疾病的作用。

1,3-甘油二酯的制備方法根據(jù)催化劑不同可分為酶法和化學(xué)法；根據(jù)工藝步驟可分為一步法和兩步法等[6]。與化學(xué)法不同，酶法催化制備的sn-1,3-DAG具有無(wú)環(huán)境污染、生產(chǎn)得率高、產(chǎn)品色澤良好等優(yōu)點(diǎn)。為獲得高純度的甘油二酯，需對(duì)制備后得到的產(chǎn)物進(jìn)行純化分離，目前純化甘油酯的方法主要有超臨界CO2萃取法、溶劑結(jié)晶分離法、分子蒸餾法和柱層析法等[7-8]。而測(cè)定sn-1,3-DAG含量的最新方法為核磁共振法(1H-NMR)，該方法消耗樣品少，且無(wú)需分離復(fù)雜的混合物，還具有同時(shí)測(cè)定樣品中多種成分含量的優(yōu)點(diǎn)[9]。孟祥河等[10]以香榧籽油為原料，采用乙醇鈉催化富集金松酸(SCA)并用于酯交換反應(yīng)生產(chǎn)1,3-甘油二酯，其中Lipozyme RM IM的位置選擇性較佳，1,3-DAG產(chǎn)率最高。Vazquez等[11]證明了以甘油和混合脂肪酸為原料，脂肪酶RM IM為催化劑，在酶添加量為5%，50 ℃反應(yīng)4 h的條件下，無(wú)溶劑體系中DAG產(chǎn)率達(dá)84.0%。郭婷婷等[12]采用分子蒸餾技術(shù)對(duì)花生油甘油二酯產(chǎn)物進(jìn)行分離，其產(chǎn)品純度為85%，得率為18.54%。

目前，以天然延黃牛脂為原料，經(jīng)脂肪酶的醇解酯交換反應(yīng)生產(chǎn)富含sn-1,3-DAG的火鍋底料油替代品的研究尚未見報(bào)道。試驗(yàn)擬以延黃牛脂為原料，利用固定化脂肪酶Lipozyme RM IM在無(wú)溶劑體系中催化發(fā)生酯交換反應(yīng)，運(yùn)用1H-NMR法測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物，分析脂肪酶添加量、底物摩爾比、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間對(duì)sn-1,3-DAG含量變化及甘油酯得率的影響，并運(yùn)用弗羅里硅土吸附法進(jìn)行提純，旨在為延黃牛脂制備新型火鍋底料油的開發(fā)和應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

延邊黃牛牛脂：實(shí)驗(yàn)室自制；

氫氧化鉀、無(wú)水硫酸鈉、丙三醇、無(wú)水乙醇、正己烷：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；

固定化脂肪酶Lipozyme RM IM：酶活力250 IUN/g，諾維信(中國(guó))生物技術(shù)有限公司；

氘代氯仿-d(D，99.8%)、四甲基硅烷(TMS，體積分?jǐn)?shù)0.03%)、弗羅里硅土(F196373)：上海阿拉丁試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

往復(fù)式恒溫震蕩水浴培養(yǎng)搖床：SPF-110X12型，上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

電子分析天平：FA-1004型，上海良平儀器儀表有限公司；

低速多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)：TDZ5-MS型，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：R201D型，上海一科儀器有限公司；

集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：IT-09B15型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；

核磁共振波譜儀：Bruker AVANCE III 500MHz型，德國(guó)Bruker公司。

1.2 方法

1.2.1 延黃牛脂提取 延邊黃牛脂肪切割成小塊，并將適量水同入鍋中，加熱熬制2 h，撈出懸浮于表層的油于燒杯中，按V油∶V正己烷為1∶1加入正己烷，加入無(wú)水硫酸鈉進(jìn)行抽濾，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除溶劑，獲取純凈牛脂[13]。

1.2.2 延黃牛脂脂肪酸乙酯的制備 稱取50 g延黃牛脂于250 mL三頸燒瓶，65 ℃水浴預(yù)熱，加入氫氧化鉀—乙醇溶液(氫氧化鉀質(zhì)量為牛脂的1%，n無(wú)水乙醇∶n牛脂為6∶1)，磁力攪拌下回流1 h。將燒瓶中的混合液置于分液漏斗中，加入適量正己烷，用熱水進(jìn)行洗滌(重復(fù)多次至徹底洗凈)。使用無(wú)水硫酸鈉除去上層有機(jī)相殘留水分，運(yùn)用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去有機(jī)相中剩余乙醇和正己烷，得牛油脂肪酸乙酯[14-15]。

1.2.3 薄層色譜條件 以油酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品為標(biāo)樣，將樣品與正己烷[V樣品∶V正己烷為20∶10 (μL/mL)]混勻備用。以V石油醚∶V乙醚∶V冰乙酸為90∶10∶1為展開劑，充分混勻后倒入展開缸中，密封備用。向顯色層析缸中加入一層海砂和5～6粒固體碘，密封0.5 h使碘充分飽和，備用。用毛細(xì)管在硅膠板上距離底邊1.5 cm處點(diǎn)樣。當(dāng)樣點(diǎn)上的溶劑充分揮干后，將硅膠板置于展開缸中，使展開劑從板的一端向另一端進(jìn)行浸潤(rùn)展開，待其距板上端1 cm 處停止展開，干燥后，將硅膠板置于碘缸中顯色[16]。

1.2.4 酶促酯交換反應(yīng)合成1,3-DAG 稱取5 g牛油脂肪酸乙酯于50 mL具塞錐形瓶中，加入一定量的甘油混勻，恒溫水浴搖床(80 r/min)中預(yù)熱，加入一定量的固定化脂肪酶Lipozyme RM IM開始酯化反應(yīng)并計(jì)時(shí)。分別考察底物摩爾比(n脂肪酸乙酯∶n甘油分別為1.0∶1.0，1.5∶1.0，2.0∶1.0，2.5∶1.0，3.0∶1.0)、酶添加量(1%，3%，5%，7%，9%)、反應(yīng)時(shí)間(2，4，6，8，10 h)和反應(yīng)溫度(35，40，45，50，55 ℃)對(duì)甘油二酯含量的影響。離心后對(duì)上層清液進(jìn)行1H-NMR檢測(cè)，并按式(1)計(jì)算反應(yīng)產(chǎn)物得率。

圖1 牛油脂肪酸乙酯薄層色譜圖Figure 1 Thin layer chromatography of fatty acidethyl ester in butter

固定化脂肪酶Lipozyme RM IM添加量5%，反應(yīng)時(shí)間6 h，反應(yīng)溫度50 ℃；同一指標(biāo)字母不同表示差異顯著(P<0.5)

(1)

式中：

c——反應(yīng)產(chǎn)物得率，%；

m1——上層清液質(zhì)量，g；

m2——反應(yīng)物質(zhì)量，g。

1.2.5 弗洛里硅土法純化 取適量m弗羅里硅土∶m混合酯為5∶1的弗羅里硅土和混合酯于150 mL磨口三角瓶，吸附25 min。加入50 mL分析純正己烷，100 r/min攪拌10 min，過濾，反復(fù)洗脫9次，收集甘油三酯洗脫液，并同時(shí)點(diǎn)板確認(rèn)有無(wú)甘油二酯出現(xiàn)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去正己烷，得甘油三酯。向磨口燒瓶中加入60 mL正己烷—乙醚溶液(V正己烷∶V乙醚為16∶1)，100 r/min攪拌10 min，洗脫，重復(fù)3次，過濾除去甘油二酯和甘油三酯混合物。向磨口燒瓶中加入50 mL分析純乙醚，100 r/min攪拌10 min，反復(fù)洗脫3次。收集洗脫溶劑，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除乙醚，采用1H-NMR分析最終產(chǎn)物甘油二酯純度。

1.2.6 運(yùn)用氫譜(1H-NMR)測(cè)定官能團(tuán)

(1) 樣品制備：準(zhǔn)確稱量反應(yīng)產(chǎn)物溶于1 mL氘代氯仿中，以TMS為內(nèi)標(biāo)，混合搖晃至完全溶解，過0.45 mm有機(jī)相濾膜，轉(zhuǎn)移至5 mm核磁管中，制成待測(cè)樣品，備用。

(2) 1,3-DAG定量：待測(cè)樣品中酯交換產(chǎn)物含量以內(nèi)標(biāo)TMS計(jì)算而來(lái)，其計(jì)算式為：

(2)

式中：

W1,3-DAG——產(chǎn)物中1,3-DAG摩爾含量，%；

As——試樣特征峰峰面積。

(3) 脂肪酸定量：參照María等[17]的方法測(cè)定油脂中油基(O)、亞油基(L)、亞麻基(Ln)和飽和?；?S)比例，并根據(jù)延黃牛脂分析1H-NMR官能團(tuán)。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均值表示，平行3次。采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P<0.05判定為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 薄層色譜分析

實(shí)驗(yàn)室自制牛油提取率為82%。由圖1可知，延黃牛脂經(jīng)乙酯化后得到的牛油脂肪酸乙酯薄層層析展開情況良好，斑點(diǎn)分離度高。牛油脂肪酸乙酯中存在與油酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品基本一致的斑點(diǎn)，說明牛油脂肪酸乙酯純度較高，可以進(jìn)行后續(xù)甘油二酯制備試驗(yàn)。經(jīng)計(jì)算，延黃牛脂、牛油脂肪酸乙酯、油酸乙酯(標(biāo)品)的Rf值分別為0.309，0.713，0.738。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 底物摩爾比 由圖2可知，不同底物摩爾比下，1,3-DAG和甘油三酯(TAG)摩爾含量無(wú)顯著性差異(P≥0.05)，但反應(yīng)產(chǎn)物得率從54%逐漸升高至67%。從理論上看，任何一種底物摩爾數(shù)的改變都會(huì)影響體系的穩(wěn)定性及產(chǎn)物的擴(kuò)散速率與含量，當(dāng)n脂肪酸乙酯∶n甘油為2∶1時(shí)，1,3-DAG的摩爾含量達(dá)最佳，因?yàn)楦视投ナ怯?分子的脂肪酸乙酯與1分子的甘油組成。脂肪酸乙酯含量過多，則利用底物的程度降低，同時(shí)導(dǎo)致純化過程復(fù)雜，耗時(shí)過長(zhǎng)；甘油含量過多，則體系的極性大，甘油與脂肪酶將更易沉積于底部，因此與脂肪酸乙酯混合不充分，降低反應(yīng)速率[18]。故選擇反應(yīng)底物摩爾比(n脂肪酸乙酯∶n甘油)為2∶1。

2.2.2 酶添加量 由圖3可知，隨著酶添加量的增加，1,3-DAG和甘油三酯的摩爾含量無(wú)顯著性差異，甘油酯得率從77%下降至47%。酶催化酯交換反應(yīng)過程中會(huì)生成過多水，當(dāng)水分含量超過一定量后，脂肪酶的酯化活力大大降低，表現(xiàn)出較高的水解活力。酶維持活性中心構(gòu)象需保持一定的柔性，而適量的水分活度正是維持這種柔性的需要[19]。孟祥何等[9]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)加酶量為5%，底物摩爾比(n乙酯∶n甘油)為2∶1時(shí)，1,3-甘油二酯產(chǎn)率達(dá)55.5%。當(dāng)固定化脂肪酶Lipozyme RM IM添加量為1%時(shí)，甘油二酯產(chǎn)率達(dá)77%，大幅度降低了生產(chǎn)成本。

2.2.3 反應(yīng)溫度 由圖4可知，隨著反應(yīng)溫度的升高，1,3-DAG、甘油三酯的摩爾含量及得率均無(wú)顯著變化。而適宜的溫度控制是酶促反應(yīng)的關(guān)鍵，升高反應(yīng)溫度有利于去除酯交換反應(yīng)副產(chǎn)物中的水，一定程度上加快反應(yīng)速率，同時(shí)物質(zhì)在反應(yīng)體系中的溶解度會(huì)有較大提高，體系黏度低，傳質(zhì)速率快，因此反應(yīng)速度快。溫度過高，則會(huì)導(dǎo)致大部分酶被破壞，發(fā)生不可逆變性，從而喪失酶的催化作用[20]，因此，控制適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)溫度為35 ℃。

2.2.4 反應(yīng)時(shí)間 由圖5可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，1,3-DAG、甘油三酯的摩爾含量及得率均無(wú)顯著變化。固定化脂肪酶Lipozyme RM IM為1,3-位特異性脂肪酶，假設(shè)該酶的位置選擇性完全專一，理想狀態(tài)下反應(yīng)結(jié)束時(shí)應(yīng)該全部連接到甘油酯骨架的sn-1和sn-3位置上，即僅生成sn-1,3-DAG，而試驗(yàn)結(jié)果顯示反應(yīng)2～10 h，混合酯中均存在甘油三酯，說明發(fā)生了副反應(yīng)——?；w移，也有研究[21]表明，通過適當(dāng)控制反應(yīng)時(shí)間可以在一定程度上抑制酰基遷移。綜合考慮，選擇反應(yīng)時(shí)間為6 h，此時(shí)甘油酯得率為77%，顯著高于(P<0.05)反應(yīng)時(shí)間為2 h的(67%)。

n脂肪酸乙酯∶n甘油為2∶1，反應(yīng)時(shí)間6 h，反應(yīng)溫度50 ℃；同一指標(biāo)字母不同表示差異顯著(P<0.5)

固定化脂肪酶Lipozyme RM IM添加量1%，n脂肪酸乙酯∶n甘油為2∶1，反應(yīng)時(shí)間6 h

固定化脂肪酶Lipozyme RM IM添加量1%，n脂肪酸乙酯∶n甘油為2∶1，反應(yīng)溫度35 ℃

2.3 甘油二酯純化

酯化反應(yīng)過程中會(huì)產(chǎn)生1,3-DAG、1,2-DAG、TAG、FFA、MAG等脂肪酸產(chǎn)物，通過查閱文獻(xiàn)[22-24]及結(jié)果分析初步鑒定該反應(yīng)在酯化過程中產(chǎn)生甘油三酯(TAG)和1,3-甘油二酯(1,3-DAG)。經(jīng)弗洛里硅土法分提甘油三酯及甘油二酯，提純前后甘油二酯的核磁共振譜圖如圖6所示，提純前后，甘油三酯摩爾含量從27.50%變?yōu)?.21%，1,3-DAG摩爾含量從72.50%變?yōu)?0.79%。酯化產(chǎn)物中甘油三酯(TAG)特征峰與1,3-甘油二酯(1,3-DAG)特征峰核磁共振氫譜譜峰歸屬見表1。反應(yīng)產(chǎn)物中雜質(zhì)微小可忽略不計(jì)，故總含量可視為甘油三酯和1,3-DAG含量之和。

表1 各特征峰的核磁共振信號(hào)分配Table 1 Nuclear magnetic resonance signal distribution of each characteristic peak

圖6 提純前、后甘油二酯的核磁共振氫譜圖

2.4 核磁共振氫譜(1H-NMR)歸屬峰及計(jì)算方法的確認(rèn)

牛油、牛油脂肪酸乙酯及甘油二酯核磁共振氫譜圖見圖7，各峰的歸屬見表2。對(duì)圖7及表2進(jìn)行分析，分別按式(3)～式(5)計(jì)算油脂中油基(O)、亞油基(L)和飽和?；?S)比例[25]：

表2 牛油核磁共振氫譜中各峰的歸屬Table 2 Assignment of peaks in nuclear magnetic resonance hydrogen spectroscopy of beef tallow

(3)

(4)

(5)

式中：

αD——信號(hào)峰D的面積；

αE——信號(hào)峰E的面積；

αF——信號(hào)峰F的面積。

2.5 脂肪酸組成

根據(jù)圖7的各功能團(tuán)信號(hào)峰位置，按式(3)～式(5)進(jìn)行計(jì)算，原料牛油、牛油脂肪酸乙酯及甘油二酯的脂肪酸組成變化見表3。由表3可知，與原料牛油相比，牛油脂肪酸乙酯中亞油酸、油酸含量分別降低了8.02%，2.34%，飽和程度上升了2.85%。試驗(yàn)制備的延黃牛脂甘油二酯中亞油酸、油酸含量分別升高了13.65%，6.47%，飽和度降低了7.17%。特異性脂肪酶RM IM制備甘油二酯時(shí)，不飽和脂肪酸乙酯干擾了飽和脂肪酸乙酯與甘油的結(jié)合，使甘油二酯中飽和度降低。從牛脂制備的甘油二酯的脂肪酸組成及結(jié)構(gòu)特性可以看出，其能發(fā)揮亞油酸和油酸的功效，具有原油的營(yíng)養(yǎng)特性，并且是一種可替代傳統(tǒng)火鍋底料油的健康油品。

圖7 牛油、牛油脂肪酸乙酯及甘油二酯核磁共振氫譜圖Figure 7 Nuclear magnetic resonance hydrogen spectroscopy of beef tallow, fatty acid ethyl ester and diacylglycerol

表3 原料牛油、牛油脂肪酸乙酯及甘油二酯的脂肪酸組成?Table 3 The fatty acid composition of beef tallow, fatty acid ethyl ester of beef tallow and diglyceride %

3 結(jié)論

利用固定化脂肪酶Lipozyme RM IM成功地合成了富含1,3-甘油二酯的目標(biāo)產(chǎn)物。在固定化脂肪酶Lipozyme RM IM添加量1%，底物摩爾比(n脂肪酸乙酯∶n甘油)2∶1，反應(yīng)時(shí)間6 h，反應(yīng)溫度50 ℃條件下，1，3-甘油二酯生成率為72.5%、甘油三酯得率為77%，且反應(yīng)對(duì)1,3-甘油二酯和甘油三酯的摩爾含量無(wú)影響；經(jīng)弗羅里硅土吸附法提純，目標(biāo)產(chǎn)物中的1,3-甘油二酯摩爾含量可達(dá)90.79%，可以用于生產(chǎn)高純度1,3-甘油二酯；經(jīng)脂肪酸組成分析牛脂制備甘油二酯不僅改變其結(jié)構(gòu)特性，還能降低飽和脂肪酸含量。1,3-甘油二酯為公認(rèn)安全的食品成分，其精煉過程及功能安全性測(cè)定有待進(jìn)一步研究。