低溫貯藏過程中水牛肉蛋白質的變化

丘 靜

秦德麗1，2

劉純友1,2，3

孫庭廣1，2

羅其勇1，2

(1. 廣西科技大學生物與化學工程學院，廣西 柳州 545006；2. 廣西柳州螺螄粉工程技術研究中心，廣西 柳州 545006; 3. 華中農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，湖北 武漢 430070)

水牛(Bubalusbubalis)是一種生長在熱帶、亞熱帶地區(qū)的特色畜種，是中國黃牛、牦牛和水牛三大牛種中唯一能適應熱帶、亞熱帶地區(qū)高溫高濕極端環(huán)境的特殊牛種[1]。亞洲是全球水牛的主產(chǎn)區(qū)，占世界水牛種群數(shù)量的97% 以上[2]。與普通黃牛肉相比，水牛肉色澤更加鮮紅、蛋白質含量高、脂肪和膽固醇含量較低，食用品質比黃牛肉更高[2-3]。

蛋白質是肉類的主要營養(yǎng)成分之一，常溫條件下蛋白質很容易發(fā)生氧化，進而使蛋白質分子內或分子間發(fā)生交聯(lián)，導致肉類的色澤、嫩度、保水性和質地等食用品質嚴重下降[4-5]。研究[6-7]表明，蛋白質在低溫情況下依然會發(fā)生劣變。目前，關于冷藏或凍藏過程中蛋白質氧化研究主要集中于普通黃牛肉[6-8]和牦牛肉[9]，而有關低溫貯藏過程中中國沼澤型水牛肉蛋白質變化國內外未見相關文獻報道。研究擬以水牛肉為研究對象，分別將其于4，-18，-60 ℃貯藏，通過測定蛋白質含量、表面疏水性、總巰基含量、游離巰基含量及羰基值等蛋白質指標，同時進行指標間的相關性分析，闡明低溫貯藏過程中水牛肉蛋白質的變化規(guī)律，以期為生鮮水牛肉的貯藏保鮮及肉類品質變化機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

水牛肉：背最長肌，廣西冠業(yè)投資發(fā)展有限公司柳州東環(huán)分公司；

鹽酸胍、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、溴酚藍、十二烷基磺酸鈉、尿素、乙二胺四乙酸、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、DTNB、氯化鉀、EDTA、2,4-二硝基苯肼、鹽酸、硫酸等：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設備

紫外—可見分光光度計：UV-2600型，島津儀器蘇州有限公司；

高速冷凍離心機：Avanti J-26 XPI型，美國貝克曼庫爾特有限公司；

超低溫冰箱：DW-86L386型， 青島海爾特種電氣有限公司；

冰箱：BCD-518WEC型， 中科美菱低溫科技有限公司；

電子分析天平：AE2204型，湘儀天平儀器設備有限公司；

pH計：PHS-25CW型，上海般特儀器制造有限公司；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH-4S型，江蘇金怡儀器科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品貯藏方法 將新鮮水牛肉(背最長肌)用刀去除肉眼可見的筋腱、脂肪和結締組織，將樣品切成質量400 g，厚度3 cm的肉塊，再將樣品用聚乙烯薄膜包裹，隨機分成3組，分別于4，-18，-60 ℃貯藏。肉樣于冷藏溫度(4 ℃)下分別貯藏0，2，4，6，8，10，12 d，于凍藏溫度(-18，-60 ℃)下分別貯藏1，5，10，15，20，25，30 d，冷凍樣品先用保鮮膜包裹好再用自來水流水方法進行解凍，當肉樣中心溫度達4 ℃時解凍完畢，測定肉樣的蛋白質含量、表面疏水性、總巰基含量、游離巰基含量、羰基值等蛋白質品質指標，每個樣品平行3次取平均值。

1.3.2 總蛋白質含量測定 根據(jù)GB 5009.5—2016。

1.3.3 表面疏水性測定

(1) 肌原纖維蛋白提?。簠⒄誔ark等[10]的方法并修改。先將肉樣切碎稱取5 g，加入20 mL磷酸鹽緩沖液(含0.1 mol/L NaCl，2 mmol/L MgCl2，1 mmol/L EGTA, 6.1 mmol/L NaH2PO4，3.9 mmol/L Na2HPO4·H2O, pH 7.0)，8 000 r/min均質30 s；4 ℃、3 650 r/min離心15 min，棄去上清液；粗提的肌原纖維沉淀物用4倍體積的磷酸鹽緩沖液洗滌2次，再用4倍體積的0.1 mol/L NaCl溶液洗滌3次，并用4層紗布過濾，去除肉樣中的結締組織；用0.1 mol/L的HCl將肌原纖維蛋白溶液的pH值調至6.0，離心，得肌原纖維蛋白備用。

(2) 表面疏水性：參照Chelh等[11]的方法，按式(1)計算溴酚藍結合量。

(1)

式中：

X——溴酚藍結合量，μg；

A0——空白對照組在595 nm處的吸光度值；

A1——試驗組在595 nm處的吸光度值。

1.3.4 總巰基含量測定 參照周果等[12]的方法。

1.3.5 游離巰基含量測定 采用Rysman等[13]的方法并修改。取1.0 mL 肌原纖維蛋白溶液，加入4.5 mL Tris-HCl 溶液(0.2 mol/L，2.0% SDS，10 mmol/L EDTA，pH 6.8)，混勻，加入1.0 mL 0.2 mol/L的Tris-HCl 溶液(0.2 mol/L，0.1% DTNB，pH 8.0)，40 ℃水浴25 min，測定412 nm處吸光度值。用0.6 mol/L 的KCl溶液做空白對照。按式(2)計算游離巰基含量。

(2)

式中：

X——游離巰基含量，mol/mg；

D——稀釋倍數(shù)，為10；

13 600——分子吸光系數(shù)；

C——樣液的質量濃度，mg/mL。

1.3.6 羰基含量測定 參照馬麗華等[14]的方法并修改。稱取3.0 g切碎的肉樣，加入30 mL Tris-HCl溶液，8 000 r/min 均質30 s，4 000 r/min離心15 min，取1.0 mL 上清液，加入1.0 mL 2,4-二硝基苯肼溶液(0.01 mol/L)混勻，黑暗環(huán)境下反應60 min，加入1.0 mL三氯乙酸溶液(20%)，4 000 r/min離心15 min，棄去上清液；沉淀中加入4.0 mL鹽酸胍(6.0 mol/L)，37 ℃水浴15 min，5 000 r/min離心10 min，測定370 nm處吸光度值。按式(3)計算羰基含量。

(3)

式中：

X——羰基含量，nmol/mg；

D——稀釋倍數(shù)；

A370 nm——370 nm處吸光度值；

854——所有醛類吸光系數(shù)的平均值，A/mmol；

C——樣品的質量濃度，g/mL。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析、鄧肯氏多重差異顯著性分析及皮爾遜分析，結果以均值±標準偏差表示。

2 結果與分析

2.1 低溫貯藏過程中水牛肉總蛋白質含量變化

由圖1可知，隨著貯藏時間的延長，不同貯藏溫度下水牛肉中總蛋白質含量不斷下降。4 ℃下冷藏第2天，總蛋白含量為23.55 g/100 g，下降幅度僅為2.57%，隨后總蛋白質含量幾乎呈直線下降；貯藏第6天，總蛋白質含量從最初24.20 g/100 g下降至17.55 g/100 g，下降幅度高達27.48%；貯藏第10天，總蛋白質含量15.49 g/100 g，下降幅度達35.98%。貯藏第10天，-18，-60 ℃下的總蛋白含量分別為18.77，19.93 g/100 g，下降幅度為22.43%，17.63%，顯著低于4 ℃的(P<0.05)。前期水牛肉蛋白質含量下降快，主要是由于貯藏前期肉樣中蛋白質酶活性較高；但隨著貯藏時間的延長，蛋白酶活性不斷降低，故貯藏后期水牛肉中蛋白質含量下降變得平緩。Shafi等[15]研究發(fā)現(xiàn)-18 ℃凍藏0 d，鰱魚肉蛋白質含量為20.09 g/100 g，經(jīng)90 d冷凍貯藏后蛋白質含量降至17.10 g/100 g，下降幅度達14.18%，其下降幅度小于凍藏的水牛肉。隨著貯藏時間的延長，低溫貯藏過程中水牛肉中蛋白質含量不斷降低，可能是由于在肌肉內源酶的作用下，水牛肉蛋白質發(fā)生氧化降解，且貯藏溫度越高，肌肉中內源酶活性越強，蛋白質降解速度越快，故4 ℃冷藏條件下水牛肉總蛋白質含量下降速度遠遠快于凍藏條件的。綜上，溫度對低溫貯藏過程中水牛肉總蛋白質含量的變化有顯著影響，不同肉類(水牛肉、魚肉)低溫貯藏過程中蛋白質含量下降存在較大差異，可能與動物種類、品種、肌肉部位、肌纖維大小類型及內源酶種類及活性有關。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖1 低溫貯藏過程中水牛肉總蛋白質含量變化

2.2 低溫貯藏過程中水牛肉表面疏水性變化

由圖2可知，隨著貯藏時間的延長，水牛肉的表面疏水性總體呈上升趨勢， 其中4 ℃下的表面疏水性從第4天開始幾乎呈直線上升，且顯著高于-18，-60 ℃的(P<0.05)。4 ℃下冷藏0～4 d，表面疏水性增加緩慢，隨后呈直線快速增長；貯藏第10天，表面疏水性達10.74 μg，增加幅度為初始值(0.92 μg)的10.6倍。-18，-60 ℃下貯藏第10天，表面疏水性增加幅度較為緩慢，分別為初始值的1.6，0.3倍，顯著低于4 ℃冷藏的(P<0.05)；隨后逐漸增大，貯藏第30天，二者的增加幅度分別為初始值(0.92 μg)的5.8，4.8倍，且-18 ℃下的表面疏水性始終高于-60 ℃的。貯藏過程中水牛肉表面疏水性不斷增加，主要是由于水牛肉蛋白質分子的構象被羥基自由基氧化而發(fā)生改變，導致埋藏在蛋白質內部的疏水性氨基酸暴露[16-17]。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖2 低溫貯藏過程中水牛肉表面疏水性的變化

2.3 低溫貯藏過程中水牛肉總巰基含量變化

由圖3可知，隨著貯藏時間的延長，不同貯藏溫度下水牛肉總巰基含量總體呈下降趨勢。4 ℃下貯藏0～8 d，總巰基含量總體呈直線快速下降，從最初的51.05 nmol/mg蛋白質下降至42.23 nmol/mg蛋白質，下降幅度達17.28%；隨后下降速度趨于平緩。-18，-60 ℃下凍藏0～5 d，總巰基含量下降較為平緩，下降幅度分別為2.68%，1.49%；隨后兩者下降幅度快速增加；貯藏第30天，兩者分別為42.08，46.35 nmol/mg蛋白質，下降幅度達17.57%和9.20%，且-60 ℃下的下降幅度始終低于-18 ℃的(P<0.05)。Tao等[18]研究發(fā)現(xiàn)灘羊肉中總巰基含量隨貯藏時間的增加不斷下降，且貯藏溫度越高巰基含量越低。貯藏過程中水牛肉中巰基含量不斷降低，可能是由于水牛肉中巰基被活性氧(ROS)氧化所致，且?guī)€基含量的降低不僅與參與蛋白質氧化的酶活性有關，還與冰晶對肌原纖維結構的破壞有關[19]。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖3 低溫貯藏過程中水牛肉總巰基含量的變化

2.4 低溫貯藏過程中水牛肉游離巰基含量變化

由圖4可知，隨著貯藏時間的延長，水牛肉的游離巰基含量總體呈下降趨勢，其中4 ℃下的下降幅度顯著高于-18，-60 ℃的。4 ℃下貯藏第2天，游離巰基含量為39.21 nmol/mg蛋白質，下降幅度僅為10.60%，隨后呈急速下降趨勢；貯藏第10天，游離巰基含量為28.31 nmol/mg蛋白質，下降幅度高達35.45%。貯藏第5天，-18，-60 ℃ 下的游離巰基含量分別為38.32，39.61 nmol/mg蛋白質，下降幅度為12.63%和9.69%；隨后下降速度不斷加快；貯藏第30天，-18，-60 ℃下的游離巰基含量分別為28.35，29.55 nmol/mg蛋白質，下降幅度高達35.36% 和32.63%，-18 ℃下的下降幅度始終高于-60 ℃ 的。貯藏過程中水牛肉游離巰基含量不斷下降，主要是由于活性氧直接攻擊水牛肉蛋白質中半胱氨基酸殘基上的巰基，并將巰基轉變成二硫鍵及磺酸、亞磺酸、硫代亞磺酸等硫醇氧化產(chǎn)物所致[13]。

2.5 低溫貯藏過程中水牛肉羰基含量變化

由圖5可知，隨著貯藏時間的延長，不同貯藏溫度下水牛肉的羰基含量總體呈上升趨勢。4 ℃冷藏0～3 d，羰基含量增長相對較為緩慢，貯藏第4天，羰基含量為2.10 nmol/mg蛋白質，增幅達16.02%；隨后呈直線快速上升；第10，12天，羰基含量分別為3.26，3.96 nmol/mg蛋白質，增幅分別為初始值的0.81，1.19倍。-18，-60 ℃下貯藏0～5 d，羰基含量分別為2.05，1.91 nmol/mg蛋白質，增加幅度相對緩慢；隨后增加幅度逐漸加快；第30天，二者的羰基含量分別為3.76，3.51 nmol/mg蛋白質，增幅分別為初始值的1.08，0.94倍。Rysman 等[13]研究發(fā)現(xiàn)隨著冷藏時間的不斷延長，普通牛肉餅中羰基含量不斷增加，冷藏7 d 后，羰基含量增加幅度為初始值的0.65倍。貯藏過程中水牛肉羰基含量不斷增加，可能是由于冷藏或凍藏破壞了肌肉的超微結構，并釋放自由基，導致蛋白質側鏈氨基酸中的氨基和亞氨基氧化形成羰基化合物所致[20]。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖4 低溫貯藏過程中水牛肉游離巰基含量的變化

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖5 低溫貯藏過程中水牛肉羰基含量的變化

2.6 蛋白質品質指標的相關性

由表1～表3可知，冷藏(4 ℃)和凍藏(-18，-60 ℃)過程中水牛肉總蛋白質含量與表面疏水性、羰基含量呈極顯著負相關(P<0.01)。低溫貯藏過程中水牛肉總蛋白質含量與總巰基含量、游離巰基含量呈極顯著正相關(P<0.01)。表面疏水性與總巰基含量、游離巰基含量呈極顯著負相關(P<0.01)，但與羰基含量呈極顯著正相關(P<0.01)。低溫貯藏過程中總巰基含量與總蛋白含量、游離巰基含量呈極顯著正相關(P<0.01)，但與表面疏水性、羰基含量呈極顯著負相關(P<0.01)；游離巰基含量與總蛋白、總巰基含量呈極顯著正相關(P<0.01)，但與表面疏水性呈極顯著負相關(P<0.01)。低溫貯藏過程中羰基含量與表面疏水性呈極顯著正相關(P<0.01)，但與總蛋白、總巰基和游離巰基含量呈極顯著負相關(P<0.01)。綜上，冷藏或凍藏條件下，水牛肉蛋白質品質指標之間具有良好的相關性。

表1 4 ℃冷藏過程中水牛肉蛋白質指標間的相關性?Table 1 Correlation analysis between various protein indicators during 4 ℃ refrigerated storage

表2 -18 ℃凍藏過程中水牛肉蛋白質指標間的相關性?Table 2 Correlation analysis between various protein indicators during -18 ℃ frozen storage

表3 -60 ℃凍藏過程中水牛肉蛋白質指標間的相關性?Table 3 Correlation analysis between various protein indicators during -60 ℃ frozen storage

3 結論

試驗表明，3種貯藏溫度下，隨著貯藏時間的不斷延長，水牛肉的總蛋白質、總巰基、游離巰基含量總體呈下降趨勢，但表面疏水性和羰基含量不斷上升。溫度對貯藏過程中水牛肉蛋白質的氧化降解有顯著影響，降低貯藏溫度在一定程度上可以抑制蛋白質的氧化降解并有效延長生鮮水牛肉的貨架期。3種貯藏溫度下，-60 ℃凍藏的水牛肉蛋白質的氧化降解程度低，肉品質保持效果好。后續(xù)可從脂質角度研究貯藏過程中水牛肉品質的變化規(guī)律。