基于HS-SPME-GC-MS的小龍蝦加工水煮液中揮發(fā)性風(fēng)味成分萃取條件優(yōu)化

楊祺福

徐文思1,2,3,4,5

胡思思1,2,3,4,5

馬嘉晨1,2,3,4,5

黃 迪1,2,3,4,5

劉麗萍1,2,3,4,5

賀 江1,2,3,4,5

楊品紅1,2,3,4,5

周順祥6

(1. 湖南文理學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南 常德 415000；2. 水產(chǎn)高效健康生產(chǎn)湖南省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 常德 415000；3. 環(huán)洞庭湖水產(chǎn)健康養(yǎng)殖及加工湖南省重點實驗室，湖南 常德 415000；4. 水生動物重要疫病分子免疫技術(shù)湖南省重點實驗室，湖南 常德 415000；5. 常德市農(nóng)業(yè)生物大分子研究中心，湖南 常德 415000；6. 順祥食品有限公司，湖南 益陽 413200)

小龍蝦是一種淡水經(jīng)濟蝦類，因滋味鮮美廣受消費者喜愛。其水煮液是加工過程中的副產(chǎn)物，具有濃郁的小龍蝦鮮香味及豐富的營養(yǎng)成分[1]，直接排放不僅造成資源浪費，還污染環(huán)境。食品風(fēng)味是衡量食品食用品質(zhì)的一個重要指標(biāo)，風(fēng)味成分種類、含量對食品最終風(fēng)味的形成起著重要作用，而風(fēng)味前體物質(zhì)在加熱后發(fā)生分解及氧化還原等一系列化學(xué)變化，是食品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生的主要途徑之一[2-3]。食品中風(fēng)味物質(zhì)常用的提取方法有頂空固相微萃取法(HS-SPME)、微波輔助萃取法(MAE)和同時蒸餾萃取法(SDE)等[4]。HS-SPME多數(shù)與氣相色譜—質(zhì)譜技術(shù)(GC-MS)聯(lián)用形成一種快速高效的分析提取技術(shù)，具有前處理簡單、分析時間短、重復(fù)性佳等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于食品及農(nóng)產(chǎn)品檢測分析等行業(yè)[5-6]。該技術(shù)檢測效果受到多種因素影響，主要有萃取頭類型、萃取溫度、萃取時間、鹽度和平衡時間等[7]。研究擬以小龍蝦加工水煮液為研究對象，通過單因素結(jié)合正交試驗優(yōu)化HS-SPME-GC-MS技術(shù)檢測小龍蝦加工水煮液中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的最佳萃取條件，并分析其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成，以期為小龍蝦加工水煮液的回收利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

水煮液：參照文獻(xiàn)[1]制備；

氯化鈉(NaCl)：分析純，湖南匯虹試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀：7820A GC-5977E MSD型，美國Agilent Technologies公司；

頂空固相微萃取手動進(jìn)樣手柄：SAAB-57330U型，上海安譜實驗科技股份有限公司；

固相微萃取頭：SAAB-57328U型，50/30 μm DVB/CAR/PDMS，上海安譜實驗科技股份有限公司；

電子天平：AUX120型，日本島津公司；

恒溫水浴鍋：HH-2型，上海秋佐科學(xué)儀器有限公司；

磁力攪拌器：TALBOYS 7X7型，美國Henry Tormenter公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 固相微萃取頭老化 選用50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭，250 ℃的GC進(jìn)樣口處老化20～30 min，直至GC-MS測定無干擾峰出現(xiàn)。

1.2.2 頂空固相微萃取 參照文獻(xiàn)[8]。

1.2.3 GC-MS分析 參照文獻(xiàn)[9]，并根據(jù)GC-MS分析結(jié)果中各成分相對保留時間，通過N1ST14.L質(zhì)譜庫進(jìn)行檢索定性，分析相似指數(shù)(SI)≥80%化合物的檢索結(jié)果[10]。

1.2.4 單因素試驗 以揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的峰個數(shù)和總峰面積作為指標(biāo)，分別考察平衡時間(0，5，10，15，20 min)、NaCl添加量(0%，10%，20%，30%，40%)、萃取時間(20，30，40，50，60 min)和萃取溫度(65，70，75，80，85 ℃)對小龍蝦加工水煮液中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)萃取效果的影響。

1.2.5 正交試驗 在單因素試驗基礎(chǔ)上，以綜合評分為標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)計L9(34)正交試驗表優(yōu)化HS-SPME-GC-MS萃取工藝。

1.2.6 綜合評分 參照文獻(xiàn)[10]，峰個數(shù)與總峰面積的權(quán)重系數(shù)為0.5，按式(1)計算綜合評分。

(1)

式中：

A——綜合評分；

Mi——揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)峰個數(shù)；

Mmax——揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)峰個數(shù)最大值；

Ni——揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總峰面積；

Nmax——揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總峰面積最大值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行正交試驗設(shè)計，所有數(shù)據(jù)均平行測定3次取平均值；采用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，Tukey檢驗，P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 平衡時間 由圖1可知，當(dāng)平衡時間≤20 min時，揮發(fā)性物質(zhì)的峰面積無顯著變化，但在15 min時達(dá)最大值；揮發(fā)性組分峰個數(shù)先略有增加后明顯減少，5 min時峰個數(shù)最多。通過綜合評分計算，當(dāng)平衡時間為5 min時，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)達(dá)到相對平衡狀態(tài)，有利于萃取頭吸附。分子在空氣中比在其他介質(zhì)中擴散快，頂空萃取時很容易達(dá)到平衡狀態(tài)，隨著平衡時間的延長，萃取頭趨于飽和，會影響其萃取吸附效果，甚至解吸附。故選擇5 min 為最佳平衡時間。

2.1.2 NaCl添加量 由圖2可知，隨著NaCl添加量的增加，揮發(fā)性成分的峰面積先顯著增大后顯著減小，當(dāng)NaCl添加量為20%時達(dá)最大值；揮發(fā)性組分的峰個數(shù)先下降后上升再顯著減少，當(dāng)NaCl添加量為20%時達(dá)最高值。適量的鹽離子可增加待測組分的離子強度，提高HS-SPME分析法的靈敏度，但若NaCl添加過量，一些揮發(fā)性組分的擴散速度可能會因此降低，進(jìn)而影響基質(zhì)分子基團之間的相互作用[9]。故最佳NaCl添加量為20%。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖1 平衡時間對小龍蝦水煮液中揮發(fā)性風(fēng)味成分萃取效果的影響

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖2 NaCl添加量對小龍蝦水煮液中揮發(fā)性風(fēng)味成分萃取效果的影響

2.1.3 萃取時間 由圖3可知，當(dāng)萃取時間為20～60 min 時，揮發(fā)性成分的峰面積先明顯增大后減小，在40 min時達(dá)最大值；揮發(fā)性組分的峰個數(shù)先顯著增加后略有減少，在40 min時達(dá)最高值。當(dāng)萃取時間為40 min時，揮發(fā)性物質(zhì)到達(dá)平衡狀態(tài)，萃取頭處于飽和。若萃取時間過長，已經(jīng)被吸附的組分可能出現(xiàn)解吸附現(xiàn)象，反而會降低萃取效果[11]。綜上，40 min為最佳萃取時間。

2.1.4 萃取溫度 由圖4可知，當(dāng)萃取溫度為65～85 ℃時，隨著萃取溫度的升高，揮發(fā)性成分的峰面積先顯著增大后無明顯變化，在75 ℃時達(dá)最大值；揮發(fā)性組分的峰個數(shù)先明顯增多后顯著減少，在75 ℃時達(dá)最高值。當(dāng)萃取溫度為75 ℃時，一個相對高的溫度下，能夠加快揮發(fā)性組分的運動速率，促進(jìn)揮發(fā)性成分被萃取頭富集和吸附，水煮液中絕大部分揮發(fā)性物質(zhì)揮發(fā)出來并被吸附，才能達(dá)到最佳的萃取效果。萃取溫度過高，低沸點組分可能因與高沸點組分的競爭吸附處于劣勢而損失，此外，高溫還能使部分揮發(fā)性化合物發(fā)生變性或裂解[11]。綜上，75 ℃是一個相對穩(wěn)定的萃取溫度。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖3 萃取時間對小龍蝦水煮液中揮發(fā)性風(fēng)味成分萃取效果的影響

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖4 萃取溫度對小龍蝦水煮液中揮發(fā)性風(fēng)味成分萃取效果的影響

2.2 正交試驗

結(jié)合單因素試驗結(jié)果，選取平衡時間、NaCl添加量、萃取時間和萃取溫度為試驗因素，采用正交試驗設(shè)計對小龍蝦加工水煮液中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)萃取條件進(jìn)行優(yōu)化，試驗因素水平表見表1，試驗設(shè)計及結(jié)果見表2，方差顯著性分析見表3。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Orthogonal design factor level

表2 L9(34)正交試驗結(jié)果Table 2 L9(34) orthogonal experimental design results

由表3可知，各因素對揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的綜合評分影響大小為A(平衡時間)>D(萃取溫度)>C(萃取時間)>B(NaCl添加量)。最佳萃取條件為A1B3C3D2，即平衡時間0 min、NaCl添加量30%、萃取時間50 min、萃取溫度75 ℃，此時綜合得分為95.47，與預(yù)測值相對誤差為4.53%。采用方差分析和顯著性檢驗(F檢驗)進(jìn)一步分析[12]，各因素的F值均未超過臨界值F0.05(4.46)，即在5%的置信區(qū)間內(nèi)，各因素的交互作用無顯著影響，F(xiàn)值檢驗靈敏度相對較低，可能是由誤差自由度較小導(dǎo)致的。

表3 正交試驗方差分析Table 3 Significant analysis of variance

2.3 小龍蝦水煮液中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

小龍蝦水煮液中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的總離子流圖如圖5 所示，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分及相對含量見表4。

圖5 HS-SPME萃取小龍蝦水煮液揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)GC-MS總離子流圖Figure 5 GC-MS total ion chromatogram of volatile flavor compounds extracted from crayfishboiled liquid by HS-SPME

2.3.1 醛類和芳香族化合物 由表4可知，小龍蝦水煮液中共檢出12種醛類化合物，其相對含量占總揮發(fā)性風(fēng)味成分的33.78%，芳香族化合物5種，占37.34%。其中苯甲醛和己醛的相對含量最高，分別達(dá)13.47%，12.05%，呈杏仁香、堅果香、水果香以及油脂、青草味[15-16]，是小龍蝦加工水煮液中重要的風(fēng)味貢獻(xiàn)物質(zhì)。其他有風(fēng)味貢獻(xiàn)的醛類及芳香族化合物依次是苯乙醛(8.31%)、庚醛(6.39%)、壬醛(3.31%)、辛醛(1.69%)、癸醛(1.37%)、戊醛(0.71%)、反-2-壬烯醛(0.58%)、2-甲基2-辛烯醛(0.33%)和(E)-2-癸烯醛(0.24%)，基本呈油脂香和果香，是小龍蝦水煮液中主要的風(fēng)味成分。水煮液中檢出的芳香族化合物的相對含量最高，近40%，主要呈清香、果香和木香，對豐富小龍蝦水煮液的風(fēng)味起重要作用。

表4 小龍蝦水煮液中揮發(fā)性風(fēng)味成分?Table 4 Volatile flavor components in crayfish boiled liquid

2.3.2 醇類和雜環(huán)化合物 水煮液中檢出醇類化合物5種，占10.96%，其中5-甲基-2-(1-甲基乙基)-環(huán)己醇的相對含量最高(4.79%)，其次是2-乙基己醇(2.04%)，且呈脂香、玫瑰香味[15-16]。對小龍蝦水煮液風(fēng)味貢獻(xiàn)的其他醇類成分較少，而烯、酮、酚類等雜環(huán)化合物有5種，占11.01%。其中，(E)-6,10-二甲基-5,9-十一烷二烯-2-酮也稱丙酮香葉酯，具有清香、果香、木香[14]。醇類和雜環(huán)化合物對小龍蝦水煮液的風(fēng)味有一定的貢獻(xiàn)作用。

2.3.3 烴類和酯類化合物 烴類物質(zhì)一般無特殊香味，主要是由脂肪酸烷氧自由基均裂產(chǎn)生，一般會有所謂的烷烴氣味[18]。水煮液中共檢出烷烴類化合物5種，占3.34%。其中十二烷的相對含量最高(1.15%)，其次是十三烷(0.83%)。烴類物質(zhì)是肉類風(fēng)味組分中雜環(huán)化合物的重要中間體，但其對小龍蝦水煮液風(fēng)味的貢獻(xiàn)作用較小。而酯類化合物主要由酸和醇之間發(fā)生的酯化反應(yīng)生成[19]。小龍蝦水煮液中僅檢出2種酯類化合物，即鄰苯二甲酸丁基環(huán)己酯和乙酸乙酯，其相對含量為3.57%。雖然酯類種類和含量較少，但一些雜環(huán)化合物也可以歸為酯類，如丙酮香葉酯，其主要提供水果香、花香等氣味[20]。在小龍蝦水煮液整體風(fēng)味成分中，酯類化合物能起到微妙的作用。

HS-SPME有利于提取易揮發(fā)性化合物，如短鏈脂肪酸或醇類[21]，且出峰快。小龍蝦水煮液中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)共檢出34種，包括醇類5種(10.96%)、醛類12種(33.78%)、烷烴類5種(3.34%)、芳香族化合物5種(37.34%)、雜環(huán)化合物5種(11.01%)、酯類2種(3.57%)。而同時蒸餾萃取法(SDE)容易提取揮發(fā)性和半揮發(fā)性風(fēng)味成分，出峰相對較慢。采用SDE-GC-MS技術(shù)從小龍蝦水煮液中共檢出73種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，包括烷烴類28種(47.77%)、酯類12種(43.40%)、醛類9種(8.94%)、芳香族6種(7.31%)、醇類5種(7.28%)、酸類4種(14.09%)[1]。因此，可以認(rèn)為醛類、芳香族類和酯類為小龍蝦水煮液中主要的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。SDE法萃取時間較長，但能萃取到更多的揮發(fā)性化合物，適合對高沸點、低揮發(fā)性物質(zhì)的分離；HS-SPME法出峰少，但快速簡便、更接近真實揮發(fā)風(fēng)味，適合檢測易揮發(fā)性的化合物[22]。

3 結(jié)論

通過HS-SPME-GC-MS結(jié)合正交試驗優(yōu)化小龍蝦加工副產(chǎn)物水煮液中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的萃取條件。結(jié)果表明，采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭老化后，不需要平衡，最優(yōu)萃取工藝條件為NaCl添加量30%，萃取時間40 min、萃取溫度75 ℃，此條件下小龍蝦加工水煮液中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)共檢出34種，其中醛類和芳香族化合物的相對含量較高，其次為醇類和雜環(huán)化合物，烷烴類和酯類化合物的相對含量較少。HS-SPME法萃取小龍蝦加工水煮液中揮發(fā)性風(fēng)味成分的方法簡便快捷，但在相同檢測方法下分析出的揮發(fā)性風(fēng)味成分相對較少，后續(xù)可以結(jié)合SDE法萃取小龍蝦加工水煮液中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。