花稈孝順竹組培快繁體系的建立

周國強 高會彬 余 英 楊海蕓

(1 宜賓林竹產(chǎn)業(yè)研究院 四川宜賓 644000；2 浙江農(nóng)林大學 亞熱帶森林培育國家重點實驗室 浙江臨安 311300)

花稈孝順竹(Bambusa multiplexf.alphonsokarri)又名小琴絲竹，是禾本科，箣竹屬(BambusaRetz.corr.Schreber) 植物，地下莖合軸叢生，是孝順竹的變型，屬珍稀觀賞竹。新竹萌發(fā)時稈為淺紅色，成熟后呈黃色，并伴有不同寬度、長度的綠色條紋，極具觀賞價值。喜溫暖濕潤氣候，也是最具抗旱和耐寒能力的叢生竹，在－6 ℃左右能夠安全越冬[1]，主要分布于長江以南各省，常種植于庭院、綠道、公園、湖岸等以供觀賞，也有做行道竹；長江以北宜作庭院盆栽、室內案頭盆景小品等。另外，花稈孝順竹因名稱中有“孝”字而更具文化內涵，是做盆景的上好材料，市場前景廣闊。

目前針對花稈孝順竹的研究報道較少，對孝順竹的研究主要集中在開花生物學[2－4]、愈傷組織誘導[5－8]、分子生物學[9－11]、不定芽誘導增殖[12－14]等研究方面。劉正娥等[15]研究了大量元素對孝順竹組培快繁的影響；袁金玲等[5]成功通過孝順竹的小穗和種胚誘導出愈傷組織并實現(xiàn)植株再生。近年來，有關孝順竹開花的報道已經(jīng)不多見，尤其尚未見花稈孝順竹開花的報道，無法獲得種子等外植體。因此，本研究采用最容易獲得的花稈孝順竹枝條上帶芽莖段作為外植體，研究不同植物生長調節(jié)物質種類與濃度組合，對外植體萌芽、不定芽增殖、生根等的影響，篩選出最優(yōu)培養(yǎng)基配方，建立花稈孝順竹組織培養(yǎng)技術體系，為規(guī)?；N苗生產(chǎn)和發(fā)育機理研究等提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為花稈孝順竹(來自浙江農(nóng)林大學翠竹園和宜賓市林竹產(chǎn)業(yè)研究院) 當年生枝條的節(jié)間帶芽部分，節(jié)上部保留0.5 cm，節(jié)下部保留1.0 cm。將剪取的外植體用洗潔精沖洗1 次后，用細毛刷輕輕刷洗節(jié)間污跡，放入燒杯中，用清水沖洗2 h；在超凈工作臺上，用75%的酒精消毒30 min，然后用次氯酸鈉10 倍液消毒8 min，外植體略微發(fā)黃后取出，用無菌水沖洗5 遍。隨后用無菌吸水紙吸干表面水分，接種入附加有蔗糖30 g/L、瓊脂3.5 g/L 和pH 值為5.8 的MS 培養(yǎng)基中，先暗培養(yǎng)24 h，再到光照強度1 500 Lx、溫度24 ℃、光照時間16 h/d 的環(huán)境下培養(yǎng)7～15 d。

1.2 試驗方法

1.2.1 單激素對外植體不定芽誘導增殖的影響

以MS (M519 粉末4.43 g/L、Sigma) 為基本培養(yǎng)基，同時加入糖30 g/L、瓊脂3.5 g/L，培養(yǎng)基酸堿度(pH 值) 為5.8。在培養(yǎng)基中分別加入5 種不同質量濃度的6-芐基腺嘌呤(6-BA) 和噻二唑苯基脲(TDZ) 進行試驗。試驗共設11 組處理，編號1～11，其中1 號處理不加激素作為對照，不同處理的具體激素濃度和配比如表1。

表1 6-BA 和TDZ 不同濃度處理Tab.1 Treatment with different concentrations of 6-BA and TDZ

表1 (續(xù))

1.2.2 雙激素組合對外植體不定芽誘導增殖的影響

在培養(yǎng)基中，同時加入不同質量濃度的6-BA(1.00、2.00、3.00 mg/L)和TDZ(0.01、0.05mg/L)2種激素，2 種激素配比見表2，基本培養(yǎng)基及其他成分同上。試驗共設6 組處理，編號12～17。

表2 6-BA 和TDZ 不同濃度組合處理Tab.2 Treatment with combinations of different concentrations of 6-BA and TDZ

1.2.3 NAA 與6-BA 組合對組培苗生根的影響

采用萘乙酸(NAA) (0.01、0.10 mg/L) 分別與6-BA (0.10、0.30、1.00、3.00 mg/L) 2 種激素組合進行組培苗生根試驗，基本培養(yǎng)基及其他成分同上。2 種激素配比見表3，試驗共設6 組處理，編號18～23。

表3 NAA 與6-BA 不同濃度組合處理Tab.3 Treatment with combinations of different concentrations of NAA and 6-BA

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

接種28 d 后統(tǒng)計材料產(chǎn)生的叢生芽個數(shù)、芽長、褐化程度、生根數(shù)、根長以及生長狀況。采用Excel 和SPSS 17.0 對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。其中平均芽數(shù)＝叢生芽總數(shù)/接種數(shù)；平均芽長＝叢生芽總長度/接種數(shù)；平均褐化程度＝總褐化程度/接種數(shù)；生根率＝生根材料數(shù)/接種數(shù)×100%；平均根數(shù)＝生根的總數(shù)/接種數(shù)；平均根長＝根的總長度/接種數(shù)。

2 結果與分析

2.1 6-BA 不同濃度對外植體不定芽誘導增殖的影響

由表4 可知，在試驗的5 個6-BA 處理濃度中，高濃度的6-BA 更有利于不定芽的誘導增殖。當6-BA 質量濃度為3.00 mg/L 時，誘導增殖的不定芽數(shù)最多為4.33 個，顯著高于低濃度的處理，平均芽長為2.78 cm，顯著高于對照，但是其他6-BA 處理濃度與對照差異不顯著；褐化程度在添加6-BA 后都有小幅加重，但是不同濃度間差異不顯著，6-BA 處理濃度在3.00 mg/L 時芽生長狀況表現(xiàn)最好。

表4 6-BA 對花稈孝順竹不定芽誘導增殖的影響Tab.4 Effects of 6-BA on adventitious bud induction and proliferation of B. multiplex f. alphonso-karri

2.2 TDZ 不同濃度對外植體不定芽誘導增殖的影響

由表5 可知，隨著TDZ 質量濃度由0.001 升至0.500 mg/L，誘導增殖的平均芽數(shù)呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢，10 號處理的達到最多，為4.11 個；平均芽長也呈現(xiàn)先增高后降低的變化趨勢，8 號處理的為最長，達到2.96 cm；褐化程度隨質量濃度增加逐漸上升，7、8 號處理的最低，為2.0。根據(jù)方差分析，在平均芽數(shù)、芽長、褐化程度指標上，各處理濃度與對照間均存在顯著差異；8 號處理在平均芽長、褐化程度2 個指標上有最好的表現(xiàn)，平均芽數(shù)也有較好表現(xiàn)。結合生長狀況綜合評價，8 號處理即在TDZ 質量濃度為0.010 mg/L 時，芽生長綜合表現(xiàn)較好。

表5 TDZ 對花稈孝順竹不定芽誘導增殖的影響Tab.5 Effects of TDZ on adventitious bud induction and proliferation of B. multiplex f. alphonso-karri

2.3 6-BA 和TDZ 組合對外植體不定芽誘導增殖的影響

由表6 可知，2 種激素組合可以顯著影響外植體不定芽的增殖，各處理間在平均芽數(shù)指標上存在顯著差異(P＜0.05)，17 號處理平均芽數(shù)最多達到4.8 個，平均芽長和褐化指標無顯著差異(P＜0.05)。當TDZ 質量濃度為0.05 mg/L 的各處理平均芽數(shù)均高于質量濃度為0.01 mg/L 時，說明在6-BA 與TDZ 組合條件下，當TDZ 質量濃度為0.05 mg/L 時不定芽增殖效果較好。根據(jù)芽生長狀況觀察，隨著6-BA 質量濃度的升高，綜合表現(xiàn)均更好，與單因素試驗表現(xiàn)吻合，其中17 號處理(6-BA 3.00 mg/L ＋TDZ 0.05 mg/L)的芽生長表現(xiàn)最好。

表6 6-BA 和TDZ 組合對花稈孝順竹不定芽誘導增殖的影響Tab.6 Effects of 6-BA and TDZcombinations on adventitious bud induction and proliferation of B. multiplex f. alphonso-karri

2.4 NAA 與6-BA 組合對組培苗生根的影響

由表7 可知，在生根培養(yǎng)中，生長素與低濃度細胞分裂素組合更有利于組培苗生根生長。其中，21 號處理組培苗生根率達到100%，19、21 號處理的平均根數(shù)指標和其他處理間存在顯著差異，平均根長指標也有最優(yōu)表現(xiàn)，表明當6-BA 為0.30 mg/L時與NAA 組合對組培苗生根有顯著促進作用，但是質量濃度繼續(xù)增加會明顯抑制生根，雖然同為添加1.00 mg/L 的6-BA，與0.10 mg/L 的NAA 組合其生根率卻較與0.01 mg/L 的NAA 組合處理低40%，原因可能與NAA 和6-BA 的比例有關。在本試驗中，21 號處理(NAA 0.10 mg/L ＋6-BA 0.30 mg/L)的組培苗生根表現(xiàn)最優(yōu)。

表7 NAA 與6-BA 組合對花稈孝順竹生根的影響Tab.7 Effects of NAA and 6-BAcombinations on rooting of B. multiplex f. alphonso-karri

2.5 煉苗移栽與盆栽配植

試管苗經(jīng)生根培養(yǎng)后，當根長達到2.0 cm 時將試管苗置于馴化室煉苗，7 d 后移栽，基質以泥炭土、珍珠巖為主，控制好基質水分和空氣濕度；15 d后有新根生成，成活率達95%以上，成活竹苗長勢較好且一致，非常適合做案頭盆景。當試管苗分別移栽15、30 和 60 d 時，竹苗生長越來越好(圖1 E)，制作花稈孝順竹組培苗盆景，景觀配植效果很好(圖1 F、G)。

圖1 花稈孝順竹組培快繁體系Fig.1 The system of tissue culture and rapid propagation of B. multiplex f. alphonso-karri

3 討論與結論

3.1 花稈孝順竹組培苗是傳承竹文化的較佳載體

每一種竹子都可視為觀賞竹，且可為做盆栽的好材料[16]。花稈孝順竹是優(yōu)良的觀賞叢生竹，是叢生竹中最耐寒的非高山竹種，適應性廣，富有文化價值[1]。新竹從母竹稈基長出，子不離母，母不離子，子竹緊靠母竹生長，故名花稈孝順竹，其姿態(tài)飄逸、稈色艷麗、竹葉常綠，為歷朝歷代文人墨客所推崇，是高潔謙虛、至孝至誠的象征[14]，在居家美化、庭園綠化、竹文化傳承方面具有重要意義。

花稈孝順竹組培苗具有傳統(tǒng)繁育竹苗所不具備的小型化特點，被喻為竹子試管嬰兒[17]，非常適合室內盆栽配植。本研究利用組培技術建立快繁技術體系，用繁育的組培苗制作盆景，不僅是上等觀賞盆景，還是傳播竹文化的載體，可以傳承中國傳統(tǒng)文化中的孝道文化，以竹育人；因其創(chuàng)意新穎，個體小，便于攜帶、運輸和養(yǎng)護管理，是科普教育的理想材料，市場前景良好。

3.2 生長素與細胞分裂素可調控竹節(jié)不定芽的誘導與分化

植物生長調節(jié)劑尤其生長素和細胞分裂素在調控離體器官發(fā)生中起關鍵作用[18]。本研究對6-BA、TDZ 單因素和雙因素組合進行不定芽誘導增殖試驗，揭示了其各自的增殖規(guī)律。結果表明，單獨使用TDZ 控制褐化優(yōu)于單獨使用6-BA；2 種調節(jié)劑組合使用其增殖效果優(yōu)于單一調節(jié)劑，當3.00 mg/L 的6-BA 與0.05 mg/L 的TDZ 配比時，其不定芽的誘導數(shù)最多，為4.8 個。在生根試驗中，0.30 mg/L 的6-BA 與NAA 組合可以促進花稈孝順竹組培苗生根，其中當搭配0.10 mg/L 的NAA 時生根表現(xiàn)最優(yōu)，生根率達100%，且根數(shù)和根長均有利于移栽后的良好生長。

植物生長調節(jié)劑組合對器官分化具有一定的超加和性，但是不適合的組合配比，也會導致器官分化受到抑制。例如，本研究中添加低濃度的6-BA，隨著濃度增加，褐化程度越來越嚴重，當6-BA質量濃度增加到1.00 mg/L 時綠色芽叢增加，可能是器官分化活力增強，不定芽的大量萌發(fā)遏制了褐化，萌芽與植株褐化間達到了新的平衡。6-BA 濃度過高也會致使不定芽畸形和弱小，同時規(guī)?；a(chǎn)也要考慮成本問題，因此選定3.00 mg/L 的6-BA 作為最優(yōu)方案。

3.3 花稈孝順竹快繁體系為其產(chǎn)業(yè)化和稈色變異機理研究奠定基礎

本研究在方法上采用外植體直接誘導不定芽，大大減少了無菌培養(yǎng)時間，通過抑制外植體本身腋芽的萌發(fā)而促進器官分化，有利于不定芽的萌發(fā)，縮短了生產(chǎn)時間，降低了生產(chǎn)成本，從而大大提高了生產(chǎn)效率，為產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供了技術保證。

另外，研究中還發(fā)現(xiàn)，花稈孝順竹不定芽萌發(fā)后其稈色依然保持黃綠相間的條紋，這與花稈綠竹相應過程中出現(xiàn)條紋消失的現(xiàn)象不同[19]，為進一步研究稈色條紋變異提供了理想材料。同時也表明花稈孝順竹觀賞性狀穩(wěn)定，是理想的盆景材料，有較高的研究與應用價值。