間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體研究熱點分析與前景展望

劉慧，楊淑嬌，李玉霞

作為干細(xì)胞臨床治療最常用的細(xì)胞類型之一，間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）是基質(zhì)來源的成體干細(xì)胞，主要存在于骨髓、牙髓、脂肪、臍帶等結(jié)締組織和器官間質(zhì)中。近年的研究發(fā)現(xiàn)，移植后的干細(xì)胞能夠成功遷移，并定向分化修補(bǔ)缺損組織的比例十分有限，且移植后產(chǎn)生治療效應(yīng)的時間與其所需的漫長的遷移分化時間不符，更支持 MSCs 通過旁分泌的機(jī)制來發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn) MSCs 的作用機(jī)制是由于其旁分泌因子和外泌體/微囊泡的作用[1]，其中可能主要由囊泡中包含的旁分泌因子介導(dǎo)[2]。細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles，EV）目前被認(rèn)為是通過生物活性脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和RNA 轉(zhuǎn)移進(jìn)行細(xì)胞間通訊的重要信使。外泌體直徑為 30 ～150 nm，當(dāng)多泡體與細(xì)胞膜融合時釋放到細(xì)胞外，外泌體富含許多生物活性分子，如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、mRNA、轉(zhuǎn)移 RNA（tRNA）、長鏈非編碼 RNA（lncRNA）、微小 RNA（miRNA）和線粒體 DNA（mtDNA）[3]。外泌體被釋放到細(xì)胞外，可以被微環(huán)境中的靶細(xì)胞吸收，也可以通過生物體液運送到遠(yuǎn)處[4]。

使用外泌體的優(yōu)勢在于可以避免 MSCs 的副作用，避免產(chǎn)生 MSCs 移植相關(guān)的潛在肺栓塞[5]，以及干細(xì)胞的潛在分化作用。一般認(rèn)為干細(xì)胞發(fā)揮作用，主要通過兩種途徑。第一種是細(xì)胞分化為基礎(chǔ)的治療：聯(lián)合應(yīng)用足夠數(shù)量的外源性干細(xì)胞、生物活性支架和細(xì)胞因子以達(dá)到組織的修復(fù)與再生。第二種是無細(xì)胞治療（以干細(xì)胞旁分泌外泌體為主）。細(xì)胞分泌的 EV 或者微囊泡是細(xì)胞相互交流的一種方式，作為干細(xì)胞旁分泌活動的重要方式，在組織再生中發(fā)揮重要作用。MSCs 的免疫調(diào)節(jié)作用是其獨特能力，且初步數(shù)據(jù)表明，MSC 的一些免疫調(diào)節(jié)特性能轉(zhuǎn)移到它們的外泌體中。MSCs 來源的外泌體可調(diào)控固有免疫與適應(yīng)性免疫應(yīng)答，通過抑制 T 淋巴細(xì)胞功能，降低 B 細(xì)胞活化、增殖與分泌，影響巨噬細(xì)胞分化與樹突狀細(xì)胞成熟，抑制自然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒活性來發(fā)揮其免疫調(diào)控作用，從而提高M(jìn)SCs 外泌體衍生藥物遞送載體的壽命和藥物的生物利用度。而且，越來越多的證據(jù)顯示 MSC 相比其他細(xì)胞能產(chǎn)生大量的外泌體。通過測量外泌體相關(guān)蛋白 CD81 的量來評估不同細(xì)胞系中外泌體的水平，發(fā)現(xiàn) MSC 外泌體的產(chǎn)量最高，用MSCs 產(chǎn)生外泌體能降低外泌體的生產(chǎn)成本。因此 MSCs外泌體研究有望成為再生醫(yī)學(xué)治療方案的未來發(fā)展方向。

1 研究方法

對 Web of Science 核心數(shù)據(jù)庫、臨床試驗數(shù)據(jù)庫進(jìn)行關(guān)鍵詞的系統(tǒng)檢索，然后利用文獻(xiàn)分析軟件VOSviewer1.6.16 版本進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。VOSviewer 是荷蘭萊頓大學(xué)科技研究中心開發(fā)的一款建立于可視化技術(shù)的處理文獻(xiàn)知識單元軟件，主要面向文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，對科技文獻(xiàn)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化分析，以發(fā)現(xiàn)科學(xué)技術(shù)內(nèi)容的熱點與內(nèi)在關(guān)系，獲得可視化知識圖譜，在文獻(xiàn)數(shù)據(jù)知識圖譜系統(tǒng)分析的基礎(chǔ)上，總結(jié)關(guān)鍵領(lǐng)域文獻(xiàn)研究進(jìn)展。

2 文獻(xiàn)分析結(jié)果

截至 2020年，在 Web of Science 數(shù)據(jù)庫共檢索出1550 篇相關(guān)文獻(xiàn)，文獻(xiàn)數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體相關(guān)研究文章于 2007年開始出現(xiàn)，此后呈現(xiàn)緩慢增長趨勢，并于 2017年出現(xiàn)相關(guān)文獻(xiàn)的快速增長（圖1）。其中我國以 774 篇相關(guān)文獻(xiàn)居于首位，美國以 350 篇相關(guān)文獻(xiàn)居于第二位，意大利以 103 篇文獻(xiàn)居于第三位。

圖1 2007 - 2020年間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體文獻(xiàn)發(fā)表情況

2.1 間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體相關(guān)研究熱點主題分析

通過 VOSviewer 對間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體相關(guān)文獻(xiàn)的關(guān)鍵詞進(jìn)行分析，設(shè)定頻次大于等于 5 次為高頻關(guān)鍵詞，建立共詞矩陣并繪制關(guān)鍵詞共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)圖譜。從高頻關(guān)鍵詞可以看出，該領(lǐng)域的研究熱點聚集于間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的促增殖與分化、作用機(jī)制、炎癥調(diào)節(jié)、損傷修復(fù)、腫瘤之間的關(guān)系等方面（表1）。

表1 間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體研究高頻關(guān)鍵詞

2.2 關(guān)鍵詞共現(xiàn)知識網(wǎng)絡(luò)

通過 VOSviewer 進(jìn)行關(guān)鍵詞共現(xiàn)聚類分析，采用聚類視圖進(jìn)行關(guān)鍵詞共現(xiàn)展示。在聚類視圖中，每個節(jié)點代表1 個關(guān)鍵詞，節(jié)點越大，說明該關(guān)鍵詞共現(xiàn)的頻次越高，1 個顏色代表1 個聚類，聚類是由共現(xiàn)頻次高的關(guān)鍵詞或術(shù)語構(gòu)成，圖中的連線代表連接的 2 個關(guān)鍵詞至少有 1 次共現(xiàn)在 1 篇文獻(xiàn)里，共現(xiàn)頻次越高連接線越粗。通過對間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體相關(guān)文獻(xiàn)關(guān)鍵詞共現(xiàn)分析，共有 8 個聚類（圖2，表2）。

表2 間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體相關(guān)研究主題關(guān)鍵詞表

圖2 間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體相關(guān)研究關(guān)鍵詞共現(xiàn)聚類圖

2.3 間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體領(lǐng)域研究趨勢

間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體相關(guān)研究從 2017年進(jìn)入快速期。結(jié)合時間，從該領(lǐng)域的文獻(xiàn)關(guān)鍵詞聚類（圖3）可以看出，從 2007 - 2017年，間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體領(lǐng)域開展的主要是外泌體機(jī)制方面的基礎(chǔ)研究；2017 - 2018年，主要進(jìn)行的是外泌體表達(dá)、分化、生長、再生等方面的研究，并初步開始了外泌體在疾病治療中的探索和嘗試；2018年至今，隨著對間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的了解和研究，開始了外泌體用于更多疾病治療中的探索，逐步開始了外泌體在心臟疾病、腎臟疾病、骨科疾病、炎癥等相關(guān)疾病治療中的嘗試。

圖3 間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體領(lǐng)域關(guān)鍵詞共現(xiàn)聚類圖（標(biāo)簽視圖）

2.4 國家合作網(wǎng)絡(luò)

從國家合作網(wǎng)絡(luò)來看，在間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體研究方面，中國和美國合作最為密切（圖4），除此之外，中國的主要合作國家還有德國、新加坡、澳大利亞等，美國的主要合作國家還有意大利、德國、法國、澳大利亞等。

圖4 間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體相關(guān)研究國家合作網(wǎng)絡(luò)

3 熱點研究領(lǐng)域研究現(xiàn)狀

通過主題詞、共被引聚類分析結(jié)果顯示腎臟疾病、再生修復(fù)、心臟疾病、骨科疾病、炎癥為間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體研究熱點領(lǐng)域。以下結(jié)合聚類節(jié)點文獻(xiàn)，通過腎臟疾病、傷口愈合與再生修復(fù)、免疫調(diào)節(jié)等領(lǐng)域進(jìn)展，以勾勒 MSCs 外泌體未來的發(fā)展。

3.1 腎臟疾病

間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體在急性腎損傷和慢性腎病實驗動物中顯示出潛在的治療效應(yīng)?；加心I缺血再灌注損傷的大鼠經(jīng)靜脈注射人臍帶源性 MSCs（huMSCs）外泌體，通過增加促血管生成因子血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）表達(dá)，可以增加腎毛細(xì)血管密度并減少纖維化[6]，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體減輕實驗動物腎臟炎癥，有效降低腎靜脈中 TNF-α、IL-6 和 IL-1β 促炎細(xì)胞因子水平，顯示了外泌體的免疫調(diào)節(jié)潛力[7]。人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體通過誘導(dǎo)腎小管細(xì)胞增殖可以加速 SCID 小鼠甘油誘導(dǎo)的急性腎損傷的形態(tài)和功能恢復(fù)，并增強(qiáng)腎小管上皮細(xì)胞對細(xì)胞凋亡的抵抗力[8]。人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的外泌體含有胰島素樣生長因子-1 受體（IGF-1R）mRNA，促進(jìn)受損腎小管細(xì)胞的外泌體增殖和修復(fù)[9]。MSCs 的三維培養(yǎng)使外泌體獲得更高的產(chǎn)量，可以有效減輕順鉑誘導(dǎo)的小鼠急性腎損傷，表現(xiàn)為腎功能改善、腎小管病理變化減弱、炎癥因子減少以及 T 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤受到抑制[10]。

3.2 傷口愈合和再生

間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)損傷修復(fù)、組織再生和抗衰老的能力非常顯著，MSCs 外泌體也具有類似的潛力。通過介導(dǎo)細(xì)胞之間的相互作用并刺激細(xì)胞增殖再生，MSCs 外泌體可用于治療多種疾病。例如，干細(xì)胞衍生的外泌體參與轉(zhuǎn)移miRNA 并影響信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)入靶細(xì)胞，可作為 miRNA治療與年齡相關(guān)的肌肉骨骼疾病[11]，可以促進(jìn)皮膚傷口愈合[12]和神經(jīng)再生[13]。MSCs 外泌體或 EVs 通過激活相關(guān)受體和通路發(fā)揮作用，MSCs 外泌體通過激活 VEGF 受體和重要的促血管生成途徑（SRC、AKT 和 ERK），從而加速后肢缺血的恢復(fù)[14]。同時 MSCs 外泌體或 EV 中的mRNAs 在組織再生和年齡相關(guān)疾病中發(fā)揮重要作用。然而，鑒于目前對 MSCs 外泌體的認(rèn)識還不成熟，還需要進(jìn)一步的研究來探索分子機(jī)制和信號通路，MSCs 外泌體的特異性和細(xì)胞間通訊需要更深入的討論，并找出可能賦予MSCs 外泌體治療特性的差異[15]。

3.3 免疫調(diào)節(jié)

MSCs 外泌體富含 MSC 來源的生物活性分子（mRNA和 miRNA、酶、細(xì)胞因子、趨化因子、免疫調(diào)節(jié)和生長因子），可調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的表型、功能、存活和歸巢[16]。MSCs外泌體的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制依賴于向炎癥免疫細(xì)胞（M1 巨噬細(xì)胞、DC 和 Th1/Th17 細(xì)胞）傳遞免疫調(diào)節(jié) miRNA 和免疫調(diào)節(jié)蛋白，使其表型轉(zhuǎn)化為抗炎和免疫抑制細(xì)胞[17]。這些過程與先天性和適應(yīng)性免疫細(xì)胞有關(guān)，其中巨噬細(xì)胞、CD4+Th1、Th17 和 Treg 細(xì)胞及其免疫調(diào)節(jié) miRNA 至關(guān)重要。相關(guān)研究顯示 MSCs 衍生的 EV 表達(dá)幾種黏附分子（CD29、CD44 和 CD73），使得它們能夠歸巢到受傷和發(fā)炎的組織。在 AKI 小鼠模型中，MSC-EVs 主要積聚在發(fā)炎的腎臟中[18]。

3.4 治療心腦血管疾病

心血管疾病是全球發(fā)病率和死亡率最高的疾病之一，在臨床前研究中，MSCs 衍生的外泌體用于治療心血管疾?。–VD），例如急性心肌梗死、腦卒中、肺動脈高壓和敗血性心肌病。MSCs 來源的外泌體在心肌再生中具有治療潛力。通過防止心肌細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)缺血區(qū)域的新血管生成以及促進(jìn)心臟干細(xì)胞（CSC）的存活、血管生成能力和自我更新能力來促進(jìn)心肌再生。間充質(zhì)干細(xì)胞 MSCs 療法已被研究作為一種潛在的治療選擇，以幫助替換丟失的心肌細(xì)胞并改善心臟功能[19]。在大鼠心肌缺血損傷模型中，發(fā)現(xiàn)人臍帶 MSC-exosomes 可減少心肌細(xì)胞纖維化，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)增殖[20]。脂肪來源的 MSC（AdMSC）來源的外泌體導(dǎo)致 H9C2 細(xì)胞在體外缺氧/復(fù)氧（H/R）下的細(xì)胞活力顯著增加，并且 AdMSC 衍生的外泌體給藥保護(hù)缺血心肌免受心肌缺血再灌注的影響[21]。MSC 療法在促進(jìn)卒中恢復(fù)方面已顯示出臨床前和臨床上的成功，并且 MSC 外泌體在各種卒中恢復(fù)的臨床前模型中顯示出前景。在創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）的大鼠模型中，MSCs 外泌體的給藥已被證明可以增強(qiáng)神經(jīng)發(fā)生和血管生成，并改善空間學(xué)習(xí)和感覺運動功能恢復(fù)[22]。使用金納米粒子作為標(biāo)記劑跟蹤鼻內(nèi)給藥外泌體的遷移和歸巢模式，發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體MSC-exo 在給藥后 96 小時內(nèi)在腦疾病病理相關(guān)的小鼠模型大腦區(qū)域中特異性靶向并積累，而在健康對照中，它們在24 小時內(nèi)顯示出彌散遷移模式和清除。病理大腦中的神經(jīng)炎癥信號與 MSC-exo 積累高度相關(guān)顯示歸巢機(jī)制是炎癥驅(qū)動[23]。

4 外泌體臨床試驗研究

目前全球共有十余項外泌體臨床治療研究，目前的研究重點為確定最佳劑量、外泌體給藥的適當(dāng)時間窗口以及達(dá)到最大療效且無不良反應(yīng)的給藥途徑。通過臨床試驗評估干細(xì)胞外泌體治療方法在人類疾病治療中的可行性和安全性。美國臨床試驗數(shù)據(jù)庫（clinicaltrials.gov）共檢索出 12 項臨床數(shù)據(jù)（表3），其中，臨床試驗地址在中國的有 7 項，美國 2 項，伊朗 1 項，埃及 1 項，另外 1 項試驗地址不詳。在12 項臨床試驗中，試驗方向主要集中于間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體在阿爾茨海默病、肺部感染、急性呼吸窘迫綜合征、新冠病毒感染、干眼癥等疾病方面的治療作用。在 12 項臨床試驗中，申辦方/合作方為瑞金醫(yī)院/西比曼生物科技集團(tuán)占了 5 項，其臨床試驗地址均為瑞金醫(yī)院，試驗分別為間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體在阿爾茨海默病、肺部感染、急性呼吸窘迫綜合征、新冠病毒感染等的效果研究。由于新冠疫情的暴發(fā)，中國和美國分別開展了間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體治療新冠病毒的臨床試驗研究，其中，中國方面是由瑞金醫(yī)院、上海市公共衛(wèi)生臨床中心、武漢市金銀潭醫(yī)院、西比曼生物科技集團(tuán)聯(lián)合在瑞金醫(yī)院開展的臨床試驗，美國由 AVEM HealthCare 在密森社區(qū)醫(yī)院（Mission Community Hospital）開展。

5 小結(jié)

間充質(zhì)干細(xì)胞通過其分泌的外泌體靶向組織受損細(xì)胞，恢復(fù)組織穩(wěn)態(tài)并使細(xì)胞能夠修復(fù)和再生，并具有免疫調(diào)節(jié)與炎癥抑制能力。由于間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體具有諸多優(yōu)勢，取得了很多有希望的成果并已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗階段，未來必將在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域取得重大進(jìn)展。但總的來說，生物治療方案的探索還處于起步階段。目前，間充質(zhì)干細(xì)胞領(lǐng)域還存在一些瓶頸問題，如外泌體分離純化的方法尚未形成適應(yīng)于大規(guī)模藥物制劑應(yīng)用的規(guī)范方法，影響研究結(jié)果的可重復(fù)性。外泌體進(jìn)入受體細(xì)胞后的轉(zhuǎn)歸、生物分布、藥代動力學(xué)和靶向遞送器官分布的特異性以及疾病的治療機(jī)制尚未完全闡明。與單克隆抗體產(chǎn)品相比，其規(guī)模量產(chǎn)、成分異質(zhì)性、保存需要冷鏈等因素均是產(chǎn)業(yè)化發(fā)展、用于臨床標(biāo)準(zhǔn)化需要解決的問題。相信隨著個性化和精準(zhǔn)治療的推進(jìn)，間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的臨床應(yīng)用也將隨著干細(xì)胞領(lǐng)域的快速發(fā)展，取得更多突破。