中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)在類風濕關節(jié)炎免疫炎癥中的研究進展

常永龍 郭錦晨

【關鍵詞】 類風濕關節(jié)炎;中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng);免疫炎癥;研究進展;綜述

類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種自身免疫性疾病，臨床以進行性、對稱性、多關節(jié)非化膿性炎癥為主要表現(xiàn)[1]。其主要以滑膜組織為靶點，以對稱性、炎癥性、多關節(jié)非化膿性炎癥為特征。本病通常被認為是一種關節(jié)疾病，但認識到系統(tǒng)性炎癥會導致過早的心血管死亡并對其進行預防至關重要。如不及時治療，關節(jié)炎癥可導致糜爛、關節(jié)破壞、永久性畸形乃至死亡[2]。RA的病理基礎為關節(jié)滑膜增生，滲出大量炎性液體，滑膜炎持續(xù)發(fā)展導致肉芽組織覆蓋關節(jié)軟骨，最終軟骨產(chǎn)生潰瘍。骨面肉芽組織纖維化、骨節(jié)破壞、皮下結節(jié)是其特征性病變[3]。

目前，RA的具體病因還不明確，通常認為與遺傳、感染、內(nèi)分泌、免疫系統(tǒng)紊亂等因素有關，我國患病率為0.32%～0.36%[4]。在眾多致病因素中，抗瓜氨酸蛋白抗體（ACPAs）的形成被認為是RA致病的關鍵環(huán)節(jié)。研究表明，RA患者在臨床癥狀出現(xiàn)前3～5年就可以檢測出ACPAs[5]。近期研究證明，中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)（NETs）作為一種新的抗炎機制與ACPAs有著密切的關系[6]。NETs是一把雙刃劍，在包括RA在內(nèi)的自身免疫系統(tǒng)性疾病中都承擔著重要的角色。因此，弄清NETs的形成機制、在RA中的調(diào)控作用以及通過以NETs的形成通路、組成成分為靶點治療RA的可能性探索是亟需做的工作。筆者通過對近年來NETs形成機制、在RA中的調(diào)控作用以及以NETs為靶點治療RA的可能性進行歸納總結，以期為RA的臨床治療提供新的解決方案。

1 NETs的形成

中性粒細胞是機體抵御病原體入侵的第一道防線，其壽命很短，循環(huán)中細胞半衰期僅為6～8 h，并受到程序性細胞死亡和隨后胞吐的限制。當中性粒細胞被激活或受到損傷時，可以推遲其死亡，以支持中性粒細胞效應器的功能，如吞噬作用、細胞因子的釋放和通過脫顆粒殺滅病原體。然而，中性粒細胞也可能改變細胞死亡的類型，從而影響炎性反應和組織重塑[7]，在固有免疫中發(fā)揮重要作用。近年來，人們發(fā)現(xiàn)一新機制：中性粒細胞受到刺激后失去內(nèi)膜，并隨之產(chǎn)生一種染色質(zhì)纖維網(wǎng)狀結構。這個結構被稱為NETs，產(chǎn)生的過程被稱為中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)凋零（NETsosis）[8]。目前，根據(jù)是否依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）可將NETs的形成分為兩種途徑。

1.1 依賴NADPH的NETsosis NETsosis為一個逐層遞進的過程，此過程主要包括活性氧（ROS）的產(chǎn)生、部分抗菌蛋白[如髓過氧化物酶（MPO）、彈性蛋白酶（NE）]的轉(zhuǎn)運、染色質(zhì)解凝、細胞膜破裂，最后釋放產(chǎn)生NETs。諸多促炎物質(zhì)具有促使NADPH氧化酶組裝活化的作用[9]，從而誘導NETs的產(chǎn)生。在病原微生物、抗體、膽固醇、線粒體DNA（mtDNA）等刺激作用下，激活蛋白激酶C（PKC）或絲裂原本活化的蛋白激酶（MAPK），促使NADPH氧化酶活化，從而導致ROS的產(chǎn)生;ROS除了能殺死微生物外，還可與中性粒細胞顆粒產(chǎn)生NE與MPO等蛋白相關，H2O2可促進中性粒細胞顆粒的解體，解體后的NE和MPO等酶被釋放到細胞質(zhì)中，隨后進入細胞核[10]，在NETs的產(chǎn)生過程中發(fā)揮重要作用。在細胞核中，NE可和絲氨酸蛋白酶剪切組蛋白，加速染色質(zhì)的解凝[11]。繼發(fā)核膜破裂，而核膜的破壞正是NETs形成的顯著特征之一。研究表明，激活細胞周期蛋白依賴激酶（CDK）在NETs形成信號轉(zhuǎn)導中起著重要的作用，其可以將中性粒細胞從G0期拉回細胞周期，同時CDK4與CDK6的沉默可阻斷NETs的釋放，并且不影響ROS的生成、吞噬和脫顆粒，這說明在NETsosis過程中，細胞周期機制可能是促使核膜分解的重要因素，核膜破裂后，胞質(zhì)顆粒釋放的蛋白與解凝的染色質(zhì)相混合，形成NETs[12]。NETs最終會被血漿中DNA酶水解，因為NADPH氧化酶組裝活化促使產(chǎn)生ROS是該過程的關鍵，因此，被稱為依賴NADPH的NETsosis。

1.2 不依賴NADPH的NETsosis 此過程不同于依賴NADPH的NETsosis，其需要細胞外鈣離子內(nèi)流，并受到線粒體ROS和小電導鉀通道3（SK3）的調(diào)節(jié)[13]。細胞內(nèi)胞質(zhì)鈣離子濃度的增加導致肽基精氨酸脫氨酶4（PAD4）的活化[14]，活化后的PAD4使組蛋白瓜氨酸化，酸化的殘基被轉(zhuǎn)化為瓜氨酸，正電荷減弱導致與DNA的靜電結合力也減弱，從而引起染色質(zhì)解凝。解凝后的染色質(zhì)進入到細胞質(zhì)內(nèi)，并結合NE、MPO等顆粒酶和其他蛋白，最終釋放至胞外，導致NETs形成[15]。鈣離子的載體離子霉素、pH升高、A23187等均能誘導不依賴NADPH的NETsosis。此外，尚有研究表明，線粒體在此過程中也發(fā)揮著重要的作用，但具體機制還有待進一步研究[16]。兩種NETsosis的不同之處之一在于依賴NADPH的NETsosis中，NE可水切相關蛋白N端，而此種情況在不依賴NADPH的NETsosis中并不會發(fā)生，由此，組蛋白N端是否被切割也可以作為區(qū)別兩者的顯著標志[17]。

2 NETs參與RA的致病機制

2.1 NETsosis促使ACPAs及細胞因子的產(chǎn)生 中性粒細胞參與RA的病理，并通過產(chǎn)生降解酶和ROS的分泌在所有免疫細胞中具有最大的細胞毒性潛能[18]。新的研究表明，RA中的NETs是瓜氨酸新表位的來源，可導致免疫耐受喪失和ACPAs的發(fā)展，這是RA加重的標志[19]。中性粒細胞活化后，組蛋白瓜氨大量酸化。而這正是中性粒細胞在受炎癥刺激后或感染時釋放NETs、殺滅病原體的關鍵一步。具體來說，NETs的產(chǎn)生可促進ACPAs的產(chǎn)生，導致炎癥分子如白細胞介素（IL）-6、IL-8和黏附蛋白的產(chǎn)生。NETs的形成過程中，蛋白質(zhì)會被肽?；彼崦搧啺泵福≒ADs）催化，此時，蛋白的精氨酸殘基脫亞氨基變成瓜氨酸化蛋白。RA患者的滑膜液和外周血中的NETsosis是加強的，并且與關節(jié)炎癥程度及ACPAs程度具有關聯(lián)性[20]。在無微生物環(huán)境刺激時，RA患者滑膜中的中性粒細胞，由于關節(jié)炎性介質(zhì)以及RA血清可與NETs中的瓜氨酸化組蛋白產(chǎn)生應答，從而促使NETs的形成[21]。CORSIERO等[22]的研究進一步表明瓜氨酸化組蛋白的局部釋放，可形成許多親和力高的ACPAs，產(chǎn)生抗NETs作用。基于此，NETs作為一種新的抗炎機制，也許是瓜氨酸化抗原的來源之一，且具有加劇RA滑膜ACPA自身免疫應答的作用。

2.2 炎性細胞因子及RA抗體參與NETsosis并引起惡性循壞 在RA患者的血清中能檢測出許多抗體，相當一部分抗體來源于其自身。在中性粒細胞啟動炎癥細胞因子時刺激增強了NETsosis[23]，導致RA患者產(chǎn)生自身免疫系統(tǒng)疾病的炎癥條件。在這種條件下，極其有利于在脫離微生物刺激情況下誘發(fā)NETsosis。相反，當NETs釋放的免疫刺激因子與瓜氨酸化自身抗原，導致人體本身產(chǎn)生自身免疫反應。此種炎癥環(huán)境對NETsosis的發(fā)生具有促進作用，在易感人群存在形成一個惡性循環(huán)的可能性，從而引起炎性反應的延續(xù)和特異性抗體的形成。DARRAH等[24]發(fā)現(xiàn)，在已鑒定的NETs蛋白質(zhì)中有2/3是RA自身抗體的靶點，這進一步證實NETs的異常產(chǎn)生在RA中發(fā)揮至關重要的作用。同時，這也說明炎性細胞因子和RA抗體可誘導NETsosis，并可能形成惡性循環(huán)，加重RA的程度。

2.3 環(huán)境因素下RA與NETs之間的關系 吸煙被認為是導致及加重RA的一個獨立危險因素[25]，國內(nèi)外已有此方面的研究。魯邦華等[26]對233例RA患者根據(jù)居住環(huán)境、是否吸煙、吸煙年限進行分類，并記錄患者關節(jié)腫脹程度、實驗室指標（抗環(huán)瓜氨酸肽抗體、類風濕因子、紅細胞沉降率、C反應蛋白），結果發(fā)現(xiàn)，初治RA患者中被動吸煙者的抗環(huán)瓜氨酸肽抗體、類風濕因子、克羅思疾病活動指數(shù)CDAI明顯高于不吸煙者，可見吸煙與RA病情嚴重程度及治療效果息息相關。SILMAN等[27]率先提出吸煙與RA相關聯(lián)，這是因為吸煙可以激活呼吸道天然免疫系統(tǒng)和肽基精氨酸脫亞氨基酶（PAD），誘發(fā)肺部PAD的表達，促使其產(chǎn)生瓜氨酸化蛋白，誘導NETsosis[28]。LEE等[29]研究發(fā)現(xiàn)，尼古丁在膠原誘導大鼠關節(jié)炎癥模型中呈現(xiàn)出顯著加劇關節(jié)炎癥的作用;VITKOV等[30]發(fā)現(xiàn)，NETsosis的發(fā)生率在牙周炎患者的齦溝液中顯著升高且牙卟啉單胞菌能夠誘導NETs的形成和ACPAs的產(chǎn)生[31]。這些均能證實在RA的發(fā)生、發(fā)展過程中，環(huán)境因素與NETs的關系密不可分。

3 NETs在RA治療中的研究進展

NETs在RA患者防御病原微生物中起著重要作用。同時，RA患者滑膜液和循環(huán)中的NETs及NE、MPO產(chǎn)生增多，并參與RA關節(jié)的破壞。NETs還與ACPA和炎癥標志物水平相關，NETsosis被認為是促進ACPA生成的主要機制之一[32]。以上均是NETs的一些不良反應。但NETs在自身免疫及組織損傷中也產(chǎn)生了積極效應。已有研究表明，在膠原誘導關節(jié)炎模型中，PADs酶抑制劑CL-脒中顯有成效，這種復合物可以降低IL-17A在中性粒細胞中誘導NETs的形成[33]。劉夢亞等[34]發(fā)現(xiàn)，雷公藤對炎癥刺激引起的NETs具有很強的抑制作用，用雷公藤紅素抑制機制參與NETs形成途徑的信號級聯(lián)，導致瓜氨酸組蛋白質(zhì)含量下降。因此，RA治療的一個靶點和方向可能是減少NETs的產(chǎn)生。筆者對近年來NETs在RA治療中的研究進展歸納為以下2個方面。

3.1 減少NETs的產(chǎn)生 Dectin-1是白念珠菌吞噬作用的受體，其能夠被CR3識別后干擾中性粒細胞中NE的跨核膜轉(zhuǎn)運，從而負向調(diào)節(jié)NETsosis[35]。雖然具體機制尚未明確，但為我們提供了新的思路，能否通過激活dectin-1通路達到抑制NETsosis的效果，從而減輕局部炎癥損傷。FcαRI阻斷抗體可減少分離中性粒細胞暴露于IgA免疫復合物后NETs的形成，這提示阻斷FcαRI可降低RA患者中性粒細胞激活和NETs形成[36]。YU等[37]研究表明，celastrol可降低健康受試者和RA受試者中性粒細胞的形成。Tocilizumab（TCZ）可能通過恢復血管內(nèi)皮功能、降低氧化應激、抑制單核細胞血栓形成和炎癥反應、減少NETosis的產(chǎn)生，從而降低RA患者的炎癥程度以及促動脈粥樣硬化血栓形成，目前已獲批準用于RA的治療。與使用TCZ治療的患者相比，從RA患者分離出的中性粒細胞在IL-6或PMA刺激后擠出更多的DNA纖維[38]。PéREZ-SáNCHEZ等[39]研究發(fā)現(xiàn)，在RA患者中，運用TCZ或英夫利昔單抗進行6個月的治療可改善疾病活動性，減少炎性介質(zhì)，并通過抑制NETs的形成減少DNA釋放到細胞外空間。

3.2 增加NETs的清除 PAD對關節(jié)蛋白的瓜氨酸化作用越來越被認為是RA發(fā)病機制中的關鍵過程[40]。PAD基因編碼可將精氨酸殘基轉(zhuǎn)換為瓜氨酸的PAD蛋白，誘導瓜氨酸蛋白抗原的產(chǎn)生。PAD4作為PAD家族酶的一種，為中性粒細胞廣泛表達[41]，具有轉(zhuǎn)向細胞核內(nèi)激活細胞的作用[42]。

具體來說，PAD4通過組蛋白和轉(zhuǎn)錄因子的瓜氨酸化在表達遺傳調(diào)控中產(chǎn)生重要作用。在炎性刺激條件下可誘導表達包含中性粒細胞在內(nèi)的髓系細胞中。研究表明，PAD4在誘導細胞因子產(chǎn)生、激活促炎Th1和Th17反應、抑制Th2功能和促進樹突狀細胞成熟等免疫功能方面具有多種作用[43]。而對于中性粒細胞，PAD4也可能借助觸發(fā)NETs的釋放影響免疫應答和炎性反應。因此，PAD的活性對NETs的形成至關重要。NETs的形成在RA炎性反應中呈現(xiàn)出加劇的作用，PAD4由關節(jié)中被激活的中性粒細胞在細胞外釋放，從而增加細胞激活和細胞因子的產(chǎn)生，最終使炎癥持續(xù)，通過抑制PAD活性阻礙NETs的形成，從而緩解RA的炎性反應目前已成為一種新的探索。SERI等[44]在葡萄糖-6-磷酸異構酶誘導的關節(jié)炎小鼠模型中，敲除PAD4可以通過改變輔助T細胞發(fā)育、細胞因子產(chǎn)生和細胞凋亡等免疫反應降低關節(jié)炎的嚴重程度。WILLIS等[41]在最近的臨床前研究中使用了一種選擇性的PAD4小分子抑制劑（GSK199）治療RA小鼠模型可以防止臨床和組織學疾病嚴重程度的惡化，PAD4抑制劑進一步代表了一個反凈靶點，可能是一種有效的、新的RA療法，但迄今為止，尚未對RA患者進行臨床試驗。

4 小結與展望

RA發(fā)病后3年內(nèi)關節(jié)破壞達70%，具有較高的致殘率與死亡率，并會引起一系列并發(fā)癥，嚴重危害患者身心健康。隨著新的治療手段的不斷出現(xiàn)，結合非藥物治療方法的系統(tǒng)使用，目前RA的治療效果和日常管理均有了較大的改善。RA的主要療法包括藥物療法、生物療法、外科療法和心理康復療法。理想化治療效果是實現(xiàn)長期緩解或最大化降低疾病活動度[45]?；罨闹行粤＜毎ㄟ^NADPH非依賴性和NADPH依賴性NETsosis過程釋放NETs，其能夠誘發(fā)局部組織炎癥，從而殺滅病原體，達到免疫防御的效果;但亦有研究證明，過量的NETs亦會使炎癥進一步擴散，加重關節(jié)損傷。因此，在不影響NETs保護的前提下，避免NETs過量產(chǎn)生，阻斷NETs產(chǎn)生過程中信號通路傳導等方法，有望為治療RA提供新的思路和方向。目前，以NETs為靶點治療RA大多處于動物模型的研究階段，如PAD4抑制劑CL-脒的廣泛使用。盡管此類藥物已被應用于細胞和動物研究，但仍有諸多缺陷，在生物利用度、機體選擇性、不良反應等方面值得繼續(xù)探索。筆者認為，未來需要在2個方面加強NETs在RA中的應用，一是開發(fā)NETs作為診斷標志物在RA中的預警作用，做到早診斷、早治療;二是進一步明確RA的致病機制，弄清NETsosis在此機制中的聯(lián)動作用，以及在炎性環(huán)境下NETs的聯(lián)動調(diào)節(jié)作用，從而進一步開展臨床試驗研究，以期發(fā)揮NETs為靶點在RA中的診治作用。

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收稿日期：2021-08-23;修回日期：2021-10-11