頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定不同時(shí)期石虎果實(shí)中的揮發(fā)性成分

張譽(yù)湘，鄭雪源#，張睿胤，鄭亞杰,，陳淼芬，周昊倚，陸英，彭志雄，袁建華，文令，鐘曉紅*，唐其,*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.國(guó)家中藥材生產(chǎn)（湖南）技術(shù)中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3.廣西柳城鑫茂種養(yǎng)專業(yè)合作社，廣西 柳城 545201；4.長(zhǎng)沙和茂農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司，湖南 寧鄉(xiāng) 410609）

蕓香科植物石虎Evodia rutaecarpa（Juss） Benth var.officinalis（Dode） Huang的干燥近成熟果實(shí)是藥材吳茱萸（Euodiae Fructus）的3種來(lái)源之一。吳茱萸為中國(guó)大宗傳統(tǒng)常用中藥，具有散寒止痛、降逆止嘔、助陽(yáng)止瀉之功效[1]。據(jù)報(bào)道[2]，各產(chǎn)地吳茱萸的采收時(shí)間各有不同。目前對(duì)吳茱萸揮發(fā)性成分的檢測(cè)主要通過(guò)水蒸氣蒸餾提取[3]，且對(duì)其本源揮發(fā)性成分的研究較少。本研究中，采集了6個(gè)時(shí)期（7 月中旬、7月下旬、8 月中旬、9 月上旬、9 月下旬、10 月中旬） 的石虎果實(shí)，采用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（HS-SPME-GC-MS） 對(duì)不同時(shí)期石虎果實(shí)中的揮發(fā)性成分進(jìn)行檢測(cè)與解析，分析其變化趨勢(shì)，旨在進(jìn)一步了解和利用其揮發(fā)性成分，明確湖南石虎的最佳采收期。

1 材料與方法

1.1 材料

2018 年7 月 17 日、7 月 31 日、8 月14 日、9 月 1 日、9 月 29 日、10 月 24 日于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家中藥材生產(chǎn)（湖南）技術(shù)中心試驗(yàn)基地采集了扦插于同一母本的3 株石虎果實(shí)，經(jīng)50 ℃干燥2 d，備用。

1.2 主要儀器與裝置

MODULYOD-230 冷凍干燥機(jī)，賽默飛世爾科技有限公司出品；GCMS-QP2010 型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（包括 GC/MS solution 色譜工作站和NIST.14、NIST.17 質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)），日本島津公司出品；固相微萃取裝置、固相微萃取進(jìn)樣手柄、萃取纖維頭（85 μm PA），上海安譜實(shí)驗(yàn)科技有限公司出產(chǎn)。

1.3 樣品預(yù)處理

將同一時(shí)期采集的樣品混合冷凍干燥至恒重，使用球磨儀打粉并過(guò)篩（孔徑25.4 mm）。取約 0.1 g樣品，放置在頂空樣品瓶中，備用。

1.4 萃取纖維針頭老化

設(shè)定氣化室溫度為240 ℃，將萃取纖維針頭插入氣相色譜儀的氣化室，老化40 min 后取出。

1.5 萃取與解吸附

固相微萃取裝置的溫度設(shè)為70 ℃，頂空瓶置于樣品槽內(nèi)預(yù)熱 40 min 后，將萃取進(jìn)樣手柄插入頂空樣品瓶中，萃取40 min。進(jìn)樣口溫度設(shè)為 240 ℃，將萃取完成后的萃取進(jìn)樣手柄插入氣相色譜儀進(jìn)樣口中，解析 5 min。

1.6 GC-MS 條件

采用CD-WAX 色譜柱（30.0 m×0.25 mm×0.25 μm），柱內(nèi)溫度 60 ℃，進(jìn)樣口溫度 240 ℃；進(jìn)樣方式為無(wú)分流，載氣氣體流速 0.98 mL/min；離子源為EI 源，離子源溫度為 200 ℃，接口溫度為 220℃，電子能量為 70 eV，質(zhì)荷比掃描范圍為 45～500 m/z。氣相色譜儀升溫條件：初始溫度為60 ℃，保持 2 min；以 3 ℃/min升至 100 ℃，保持5 min；再以 3 ℃/min升至 190 ℃，保持 5 min；最后以 10℃/ min 升至 220 ℃，保持 5 min。MS 采集時(shí)間為70 min。

1.7 揮發(fā)性成分的檢測(cè)與定性

利用 GC/MS solution 中的 NIST.14、NIST.17標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)檢索色譜圖中可能存在的化合物，并結(jié)合文獻(xiàn)資料進(jìn)行定性分析，推測(cè)化合物的結(jié)構(gòu)。采用峰面積歸一化法計(jì)算各成分的相對(duì)含量。

1.8 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)

采用 Microsoft Excel 2019 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理與統(tǒng)計(jì)；運(yùn)用 Origin 2018 繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 揮發(fā)性成分解析

石虎果實(shí)中的揮發(fā)性成分總離子流圖如圖 1所示。6 個(gè)時(shí)期的石虎果實(shí)中共鑒定出 72 種揮發(fā)性成分（表 1），其中，共有成分有 47 種。72 種成分中包含醇類（26.39%）、芳香烴類（1.39%）、烯烴類（29.17%）、酮類（11.11%）、吡唑類（1.39%）、醛類（4.17%）、酯類（12.50%）、醚類（11.11%）和酚類（2.77%）共9 種化合物，其中萜類化合物占比51.39%，包括單萜類化合物（36.11%）和倍半萜類化合物（15.28%）。6 個(gè)時(shí)期石虎果實(shí)的主要揮發(fā)性成分為順式-β-羅勒烯、β-月桂烯和β-水芹烯，平均含量占比均超過(guò)10%。

圖1 石虎果實(shí)揮發(fā)性成分總離子流圖Fig.1 Total ion flow diagram of volatile components of the fruits of Evodia rutaecarpa

表1 不同時(shí)期石虎果實(shí)的揮發(fā)性成分Table 1 The volatile components of the fruits of Evodia rutaecarpa in different periods

表1(續(xù))

2.2 萜類化合物的含量變化

6 個(gè)時(shí)期石虎果實(shí)中的關(guān)鍵揮發(fā)性成分的含量變化如圖 2、圖3 所示。從圖2 可知，72 種化合物中萜類化合物的含量占比均超過(guò)80%，可見(jiàn)萜類化合物是石虎果實(shí)中的主要揮發(fā)性成分。從圖3-a可以看出，單萜類化合物的占比在8 月中旬最高，6 個(gè)時(shí)期的含量差異不大。單萜類成分的主要化合物為順式-β-羅勒烯，β-月桂烯和β-水芹烯；β-月桂烯的含量變化最大，其含量變化達(dá)9.53%；順式-β-羅勒烯的含量在7 月最高，8 月中旬時(shí)含量占比減少，9 月上旬含量占比增大，而后2 個(gè)時(shí)期持續(xù)減少；這3 種化合物含量占比的總和在8 月中旬最高（55.9%）。從圖3-b 可以看出，倍半萜類化合物的含量占比在9 月上旬時(shí)最高。β-欖香烯、右旋大根香葉烯和α-瑟琳烯為主要的倍半萜類成分，β-欖香烯的含量占比在7 月中旬最高，右旋大根香葉烯和瑟琳烯在9 月上旬達(dá)到最高值。

圖2 不同時(shí)期石虎果實(shí)中萜類成分的含量Fig.2 Contents of terpenoids of the fruits of Evodia rutaecarpa in different periods

圖 3 不同時(shí)期石虎果實(shí)中關(guān)鍵揮發(fā)性成分的含量Fig.3 The key volatile components of the fruits of Evodia rutaecarpa in different periods

3 結(jié)論與討論

頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)操作便捷、靈敏度高，大大縮短了試驗(yàn)時(shí)長(zhǎng)，且無(wú)需溶劑提取，能對(duì)樣品中本源揮發(fā)性成分進(jìn)行分析。目前，應(yīng)用HS-SPME-GC-MS 技術(shù)對(duì)石虎中揮發(fā)性成分的研究較少。本研究中，采用HS-SPME-GC-MS 技術(shù)測(cè)定了石虎果實(shí)中的揮發(fā)性成分，發(fā)現(xiàn)其中含有大量順式-β-羅勒烯、β-月桂烯、β-水芹烯，與LIU 等[3]的研究結(jié)果基本一致。但LIU 等[3]研究發(fā)現(xiàn)，8 月湖南石虎果實(shí)的揮發(fā)油中β-月桂烯的含量是順式-β-羅勒烯的2 倍，而本研究發(fā)現(xiàn)，8—10 月，順式-β-羅勒烯在石虎果實(shí)揮發(fā)性成分中的占比均較高，推測(cè)可能是由于水蒸氣蒸餾法和頂空固相微萃取法對(duì)揮發(fā)性成分的提取側(cè)重點(diǎn)不同所致。楊占南等[4]應(yīng)用 HS-SPME-GC-MS 技術(shù)檢測(cè)疏毛吳茱萸中的揮發(fā)性成分，共鑒定出77 種化合物，其中主要為右旋大根香葉烯、順式-β-羅勒烯、β-欖香烯和石竹烯。本研究中，右旋大根香葉烯的平均含量占比只有3.62%，石竹烯含量不足1%，推測(cè)這種差別可能是由于品種和產(chǎn)地不同所致。

本研究中，石虎果實(shí)揮發(fā)性成分中含有大量單萜類化合物和倍半萜類化合物，其中，欖香烯可用于多種癌癥的治療[5]，月桂烯可用于腎臟炎癥的治療[6]，羅勒烯可開(kāi)發(fā)成抗高溫試劑[7]，水芹烯可作為天然的殺蟲(chóng)劑[8]，芳樟醇在食品、日化等領(lǐng)域常被用作天然的食品添加劑與賦香劑[9]，表明石虎果實(shí)具有較高的綜合利用價(jià)值。

吳茱萸的最佳采收期受品種和產(chǎn)地的影響[10]。本研究結(jié)果表明，石虎果實(shí)中的揮發(fā)性成分主要為順式-β-羅勒烯、β-月桂烯和β-水芹烯，這3 種化合物含量的占比總和在8 月中旬最高，可為湖南石虎最佳采收期的判斷提供參考。