羊口瘡病毒F1L 蛋白對山羊痘病毒黏附BHK21 細(xì)胞的影響

楊柳，許國洋#，牟豪，白運(yùn)川，余遠(yuǎn)迪*

（1.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460；2.重慶市獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，重慶 402460；3.重慶酉陽土家族苗族自治縣畜牧產(chǎn)業(yè)發(fā)展中心，重慶 409812）

山羊痘、羊口瘡廣泛發(fā)生于養(yǎng)羊的國家（地區(qū)），對牧羊造成嚴(yán)重危害，給農(nóng)牧民帶來較大經(jīng)濟(jì)損失。近些年來，隨著養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展和生產(chǎn)方式的改變，羊病發(fā)生日趨復(fù)雜。臨床上既有單一感染山羊痘病毒（GTPV）或羊口瘡病毒（ORFV）的病例[1-2]，也存在2種病毒混合感染發(fā)病的情況[3]。由于羊口瘡和羊痘臨癥相似，導(dǎo)致診斷困難，常常出現(xiàn)誤診，鑒別診斷羊口瘡或羊痘一直是當(dāng)前研究熱點(diǎn)[4]。GTPV AV41株弱毒活疫苗在中國已應(yīng)用多年，在防控山羊痘的過程中發(fā)揮了關(guān)鍵性作用，其安全性和有效性已得到充分證明。然而羊口瘡在羊場常見多發(fā)，目前中國無商品化的羊口瘡疫苗。當(dāng)羊群攜帶ORFV時(shí)注射山羊痘活疫苗，其免疫效果是否受影響還有待深入研究。

F1L蛋白是ORFV的一種重要囊膜蛋白，為ORFV的059基因編碼。CZERNY等[5]用ORFV的單克隆抗體通過競爭性ELISA、免疫金電鏡技術(shù)和Western blot等方法對病毒囊膜上的多種蛋白進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)單克隆抗體能與ORFV病毒表面特異性的抗原決定簇結(jié)合，其中相對分子質(zhì)量大約3.9×104的病毒表面蛋白就是單克隆抗體的主要結(jié)合位點(diǎn)。根據(jù)DELHON等[6]、MERCER等[7]發(fā)布的ORFV全基因組DNA序列，分析發(fā)現(xiàn)3.9×104蛋白為ORFV基因組的中心保守區(qū)ORFV 059基因編碼產(chǎn)生的，該基因編碼區(qū)DNA長約1023 bp，包含1個(gè)完整的開放閱讀框（ORF）。SCAGLIARINI等[8]進(jìn)一步鑒定ORFV F1L蛋白是免疫優(yōu)勢蛋白，免疫金染色顯示該蛋白位于ORFV的表面。GALLINA等[9]克隆、表達(dá)了F1L基因，純化蛋白免疫家兔，結(jié)果顯示F1L蛋白有較強(qiáng)的免疫原性，能刺激宿主產(chǎn)生針對ORFV的中和抗體，意味著F1L蛋白具有作為亞單位疫苗的潛力。尤其是SCAGLIARINI等[10]發(fā)現(xiàn)了肝素對F1L蛋白與胎羊睪丸細(xì)胞結(jié)合有競爭性抑制作用，證明ORFV F1L蛋白具有肝素結(jié)合活性，能夠與表達(dá)于大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面的硫酸乙酰肝素受體結(jié)合，故認(rèn)為該蛋白在病毒吸附和侵染細(xì)胞的早期階段發(fā)揮了重要作用。由于F1L蛋白既能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體，還可以阻止病毒ORFV吸附宿主細(xì)胞而發(fā)揮免疫作用，從而利于機(jī)體清除病原體，認(rèn)為F1L蛋白已成為研制ORFV新型亞單位疫苗靶標(biāo)抗原[9]。已有的資料[11]顯示，黏附宿主細(xì)胞是病原感染發(fā)生的關(guān)鍵。許多病原微生物產(chǎn)生黏附蛋白，以促進(jìn)其黏附宿主細(xì)胞。以GTPV AV41株研制的活疫苗免疫接種山羊后，病毒黏附侵染宿主細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)有一定程度的繁殖或復(fù)制，激發(fā)機(jī)體對病原的持久免疫力。目前，還少見F1L蛋白影響GTPV黏附細(xì)胞的相關(guān)報(bào)道。

本研究中，以O(shè)RFV F1L為配體蛋白、GTPV為靶標(biāo)病毒、乳倉鼠腎成纖維細(xì)胞（BHK21）為宿主細(xì)胞，將蛋白F1L、病毒GTPV作不同處理后孵育BHK21細(xì)胞，測定孵育細(xì)胞黏附GTPV的量，分析GTPV黏附細(xì)胞拷貝數(shù)的變化，探究ORFV F1L蛋白是否干擾GTPV黏附BHK21細(xì)胞和ORFV對GTPV感染山羊細(xì)胞的影響，旨在為生產(chǎn)實(shí)際中用GTPV弱毒活疫苗免疫羊群提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試細(xì)胞和病毒

BHK21 細(xì)胞為重慶市獸用生物制品工程技術(shù)研究中心保存；GTPV 疫苗弱毒株（GTPV AV41 株）為重慶澳龍生物制品有限公司惠贈，測定病毒TCID50約為1×10-4/mL。

1.1.2 主要試劑和引物

病毒RNA/DNA 提取試劑盒（Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver5.0）、DNA 膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)MEGA；瓊脂糖粉、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷（X-gal）、異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、限制性內(nèi)切酶Hind III、EcoR I、T4DNA ligase、PCR Master Mix（2×）、pMD18-T vector 購自TaKaRa；DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液購自Gibco；驢抗羊熒光標(biāo)記二抗購自Invitrogen。參考GenBank 公布的基因（ID 為KX951408.1），設(shè)計(jì)合成ORFVF1L基因 引 物（5'-ATGGATCCACCCGAAATCACG-3'，5'-TCACACGATGGCCGTGAC-3'）；參考GenBank公布的基因（ID 為AY040083.1），設(shè)計(jì)合成GTPVP32基因引物（5'-ATGGCAGATATCCCATTA-3'，5'-CTAAACTATATACGTAAATAAC-3'）；參考文獻(xiàn)[12]，設(shè)計(jì)合成熒光定量引物（5'-TGTTATTATGT TTGATCCCGTTC-3'，5'-GTAAAATCATATAAGG TGCGACAA-3'）。

1.1.3 主要儀器

氣浴振蕩器為上海博迅實(shí)業(yè)有限公司的產(chǎn)品；細(xì)菌培養(yǎng)箱為上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司的產(chǎn)品；臺式高速冷凍離心機(jī)為Heraeus 的產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)為Syngene BOX EF 的產(chǎn)品；電泳儀為上海比朗儀器制造有限公司的產(chǎn)品；細(xì)胞培養(yǎng)箱為Thermo的產(chǎn)品；倒置顯微鏡為Olympus 的產(chǎn)品；低速離心機(jī)HICO21 為生工生物工程（上海）股份有限公司的產(chǎn)品；PCR 儀為ABI VeritiTM的產(chǎn)品；Odssay?CLX為Gene Company Limited 的產(chǎn)品；核酸蛋白濃度測定儀為Eppendorf BioPhotometer 的產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 病料處理和病毒DNA 的提取

采集重慶市石柱某羊場發(fā)病羊的痂皮并稱量痂皮的質(zhì)量，加入5 倍量的磷酸緩沖溶液（1×PBS，pH 7.2），用研缽反復(fù)研磨；收集研磨液，反復(fù)凍融3 次，3000 r/min 離心30 min；上清用0.45 μm 濾器過濾，收集濾液，-20 ℃保存，備用。同時(shí)取GTPV AV41 株病毒溶液、羊口瘡病樣濾液各200 μL，采用試劑盒提取病毒DNA，并將其置于-20 ℃冰箱保存，備用。

1.2.2 ORFV 059 基因的擴(kuò)增和克隆及測序

以提取羊口瘡病料的DNA 為模板，PCR 擴(kuò)增ORFV 059 基因。反應(yīng)體系（50 μL）：2×TaqPCR Master Mixes 25.0 μL，DNA 4.0 μL，上游引物（10μmol/L） 1.0 μL，下游引物（10 μmol/L） 1.0 μL，ddH2O 19.0 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94℃變性1.0 min，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1.5 min，共30 個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。PCR 產(chǎn)物用1×TAE Buffer、1.0%瓊脂糖凝膠在120 V 條件下電泳，EB 染色觀察，切膠回收目標(biāo)DNA，連接pMD18-T vector，構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化感受態(tài)Escherichia coliDH5α 后涂布培養(yǎng)。采用藍(lán)白斑法挑取陽性菌落培養(yǎng)，用試劑盒提取陽性菌的質(zhì)粒并測序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析

將測序獲得的 DNA 序列在 NCBI 上進(jìn)行BLAST 檢索分析，運(yùn)用在線軟件（http://web.expasy.org/translate/）翻譯F1L 蛋白，查找蛋白質(zhì)序列中的堿性氨基酸，并分析蛋白保守結(jié)構(gòu)域（http://smart.embl.de/smart/set_mode.cgi）、跨膜結(jié)構(gòu)域和信號肽（https://phobius.sbc.su.se/）序列。

1.2.4 編碼F1L 蛋白DNA 序列的優(yōu)化及表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)大腸埃希菌密碼子偏好性，對編碼F1L 蛋白的DNA 序列作優(yōu)化處理，在序列上、下游末端分別加EcoR I 和Hind III 單一酶切位點(diǎn)，優(yōu)化序列送至生工生物工程（上海）股份有限公司合成。采用EcoR I、Hind III 雙酶切質(zhì)粒pET42a（+），優(yōu)化合成DNA 片段，酶切產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收目標(biāo)片段。將回收片段（帶黏性末端優(yōu)化DNA 和載體pET42a（+））用T4DNA ligase 于16 ℃環(huán)境中連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E. coliBL21（DE3）后涂板培養(yǎng)。挑單克隆于LB 試管中振搖過夜，取培養(yǎng)液進(jìn)行菌液PCR，產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，對陽性克隆菌的質(zhì)粒測序鑒定。

1.2.5 蛋白的表達(dá)及免疫印跡試驗(yàn)

挑取陽性單克隆菌并接入LB培養(yǎng)液中，于37℃下180 r/min振搖培養(yǎng)。當(dāng)菌液OD600nm=0.4時(shí)，加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG，同時(shí)培養(yǎng)空質(zhì)粒pET42a（+）菌作為對照。分別于3、6 h取誘導(dǎo)菌液大約1.0 mL，于4 ℃下5000 r/min離心10 min后去上清；用1×PBS混勻沉淀，5000 r/min離心10 min之后棄上清，重復(fù)洗滌3次；最后向沉淀中加100 μL蛋白上樣緩沖液并吹打混勻，于沸水中煮沸10 min后冷卻，用SDS-PAGE膠（5%濃縮膠+12%分離膠）電泳。一方面，將電泳膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色之后脫色觀察，初步檢測蛋白是否表達(dá)；另一方面，對電泳膠進(jìn)行轉(zhuǎn)移電泳，將膠中蛋白轉(zhuǎn)移到膜上，以O(shè)RFV抗體（羊口瘡陽性血清）為一抗（1∶500）對轉(zhuǎn)移膜進(jìn)行孵育，再用1×PBS洗滌后用驢抗羊熒光標(biāo)記二抗（1∶5000）進(jìn)行孵育，最后用1×PBS洗滌后采用ODssay成像儀對孵育膜攝像，進(jìn)一步檢測表達(dá)蛋白是否為F1L蛋白。

1.2.6 蛋白的純化和復(fù)性及濃度測定

收集IPTG誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒菌體，用20 mL 1×PBS重懸1000 mL LB過夜培養(yǎng)的菌體，再在冰水中超聲裂解菌懸液（功率300 W，工作4 s、間歇5 s，超聲裂解30 min）；裂解液以12 000 r/min離心10 min，收集上清和沉淀，分別作SDS-PAGE電泳檢測。對于包涵體表達(dá)的蛋白，裂解沉淀用pH 8.0的緩沖液（8 mol/L尿素、20 mmol/L Tris-HCl、2 mmol/L EDTA、2 mmol/L巰基乙醇）溶解過夜后，12 000 r/min離心10 min，收集上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳觀察。

參照文獻(xiàn)[13]的方法，采用His柱純化蛋白，再用SDS-PAGE分析蛋白純化效果。參照文獻(xiàn)[14]的梯度透析復(fù)性方法，對過柱純化的蛋白質(zhì)作復(fù)性處理。按照Bradford蛋白濃度測定試劑盒說明書測定復(fù)性蛋白質(zhì)的濃度。

1.2.7 GTPVP32基因克隆及其絕對定量標(biāo)準(zhǔn)曲線制定

以提取GTPV AV41 株基因組DNA 為模板，通過PCR 擴(kuò)增P32基因，產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收目標(biāo)條帶，產(chǎn)物連接pMD18-T 載體、轉(zhuǎn)化E. coli；挑陽性克隆菌作液體培養(yǎng)，再對菌液進(jìn)行測序鑒定；采用試劑盒抽提pMD18-P32質(zhì)粒，以此為模板作梯度稀釋，參照文獻(xiàn)[12]的方法，制定GTPV 絕對定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.8 F1L 蛋白對GTPV 黏附BHK21 細(xì)胞試驗(yàn)

從液氮中取出BHK21 細(xì)胞凍存管，快速置于37 ℃的水中，不停搖動(dòng)直至全部融化；將融化液加到有10%小牛血清DMEM 液的細(xì)胞瓶，于37 ℃5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；待細(xì)胞長滿瓶后棄細(xì)胞培養(yǎng)液，用1×PBS 洗滌，再以胰酶消化適當(dāng)時(shí)間；取完全培養(yǎng)液終止消化，將貼壁細(xì)胞輕輕吹打下來，低速離心收集細(xì)胞；用10%小牛血清DMEM 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將重懸液加至12 孔細(xì)胞板中，然后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直至細(xì)胞長至單層。用1×PBS 洗滌BHK21 單層細(xì)胞，再用0.15 mg 復(fù)性的蛋白F1L、0.15 mL 病毒GTPV 對單層細(xì)胞進(jìn)行蛋白孵育（陰性對照）、先蛋白孵育后病毒孵育、蛋白和病毒混液孵育、病毒孵育（陽性對照）4 種處理。每種處理設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。參照文獻(xiàn)[15]，選擇病毒DNA 于細(xì)胞內(nèi)未復(fù)制前，即病毒孵育1.0、6.0 h 終止孵育；用1×PBS 洗滌3 次，之后每孔加200 μL 1×PBS 反復(fù)凍融；將凍融液體以12 000 r/min 離心10 min，取上清，抽提DNA 為模板，進(jìn)行熒光定量PCR。反應(yīng)體系（20.0 μL）：上游引物（10 μmol/L）0.4 μL, 下游引物（10 μmol/L） 0.4 μL, TB Green Premix ExTaq10.0 μL，模板2.0 μL，dd H2O 7.2 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40 個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣重復(fù)3 次。最后分析病毒拷貝數(shù)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 F1L 基因序列分析結(jié)果

從圖1可知，只有泳道3在約1000 bp處呈現(xiàn)1條與預(yù)期分子大小相符的DNA條帶。對目標(biāo)條帶克隆和測序，結(jié)果獲得1023 bp大小的DNA序列。在線BLAST比對結(jié)果顯示，該序列與ORFV新疆分離株F1L基因相似性達(dá)100%，表明病料3含有ORFV，將該病毒株命名為重慶石柱分離株（ORFV-CQsz）。

圖1 ORFV F1L 基因的PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 Result of electrophoresis of PCR product of ORFV F1L gene

從圖2可知，該DNA序列ORF編碼340個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)F1L，理論預(yù)測該蛋白的等電點(diǎn)為5.61，相對分子質(zhì)量為3.73×104；在F1L蛋白中，共有11個(gè)R、19個(gè)K和5個(gè)H，堿性氨基酸含量為10.29%（35/340），并且其中有1段堿性氨基酸富集區(qū)；結(jié)構(gòu)功能域分析顯示，F(xiàn)1L蛋白包含1個(gè)類似Pox_P35結(jié)構(gòu)域。該結(jié)構(gòu)域的特點(diǎn)是能夠與細(xì)胞表面帶負(fù)電荷硫酸乙酰肝素（HS）受體結(jié)合，便于病毒黏附到細(xì)胞表面[16]?？缒そY(jié)構(gòu)域和信號肽預(yù)測結(jié)果顯示，蛋白F1L無信號肽序列，但構(gòu)成蛋白的氨基酸序列C-端含有2段跨膜結(jié)構(gòu)域。

圖2 ORFV-CQsz F1L基因編碼的氨基酸序列Fig.2 The amino acid sequence encoded by the ORFV-CQsz F1L gene

2.2 優(yōu)化的編碼F1L 蛋白DNA 序列及表達(dá)質(zhì)粒鑒定結(jié)果

優(yōu)化編碼F1L 蛋白的DNA 序列與原編碼的序列相比較，核苷酸變化的統(tǒng)計(jì)結(jié)果列于表1。與原序列相比，優(yōu)化序列中的A、T、C、G 堿基占比趨向均勻，其中，GC 占比從原序列的64.8%調(diào)整到優(yōu)化序列的50.0%。經(jīng)PCR 檢測及測序鑒定，基于優(yōu)化序列構(gòu)建的重組質(zhì)粒陽性克隆菌均與預(yù)期的相符，結(jié)果表明成功獲得優(yōu)化DNA 序列構(gòu)建的重組質(zhì)粒菌。

表1 編碼F1L 蛋白DNA 序列優(yōu)化前后的結(jié)果Table 1 Result of the DNA of F1L protein coding sequence before and after optimization

2.3 F1L 蛋白表達(dá)及免疫印跡結(jié)果

從圖3可知，在相對分子質(zhì)量大約為3.8×104處有1條明顯的蛋白帶，其相對分子質(zhì)量大小與預(yù)期的相符；隨著IPTG誘導(dǎo)時(shí)間延長，重組質(zhì)粒菌表達(dá)的蛋白含量明顯增加，初步證明該蛋白能被高效表達(dá)。從圖4可知，在轉(zhuǎn)移膜上可見相對分子質(zhì)量約為3.8×104的條帶，免疫印跡結(jié)果進(jìn)一步證明表達(dá)的蛋白為F1L蛋白。

圖3 F1L蛋白表達(dá)的SDS-PAGE結(jié)果Fig.3 Result of SDS-PAGE profile of expressed F1L protein

圖4 F1L-CQsz蛋白免疫印跡檢測結(jié)果Fig.4 Result of western blotting of F1L-CQsz protein

2.4 F1L 蛋白的純化結(jié)果及復(fù)性蛋白質(zhì)的濃度

對超聲破碎IPTG 誘導(dǎo)重組菌懸液的SDSPAGE檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，裂解液上清液泳道中無明顯可見的目的蛋白帶，而沉淀泳道中出現(xiàn)相對分子質(zhì)量約為3.8×104且與預(yù)期相符的蛋白帶，表明F1L蛋白主要以包涵體的形式表達(dá)。對于用His柱純化蛋白的檢測，從圖5可知，在相對分子質(zhì)量大約為3.8×104處出現(xiàn)了1條明顯的與預(yù)期相符的蛋白條帶，表明純化到了以包涵體形式表達(dá)的F1L蛋白。采用Bradford法測定的純化復(fù)性的F1L蛋白質(zhì)量濃度為1.06 mg/mL。

圖5 純化蛋白的SDS-PAGE分析結(jié)果Fig.5 Result of SDS-PAGE profile of the purified protein

2.5 GTPV P32 基因克隆及定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

從圖6 可知，在1000 bp 左右出現(xiàn)單一的DNA條帶，該結(jié)果與預(yù)期分子大小相符?；厥漳康臈l帶連接pMD18-T vector、轉(zhuǎn)化E. coliDH5α，結(jié)果成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒（pMD18-P32）菌。以提取的該質(zhì)粒為模板，建立了研究GTPV AV41 株的絕對定量標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖7）。

圖6 GTPV P32基因PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.6 Result of electrophoresis of PCR product of GTPV P32 gene

圖7 GTPV絕對定量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 GTPV absolute quantitative standard curve

2.6 蛋白F1L 對GTPV 黏附BHK21 細(xì)胞的影響

從圖8 可知，病毒GTPV 孵育1.0、6.0 h 的細(xì)胞，其黏附病毒數(shù)量均呈現(xiàn)為蛋白處理組的最低，病毒處理組的最高，先蛋白后病毒、蛋白和病毒混液共孵育的居中的特點(diǎn)。表明蛋白F1L 對GTPV 黏附到BHK21 細(xì)胞有一定的干擾作用，F(xiàn)1L 蛋白質(zhì)降低了病毒黏附到細(xì)胞的數(shù)量。

圖8 熒光定量測定不同處理下細(xì)胞黏附GTPV 的拷貝數(shù)Fig.8 The copies of GTPV adhered to cells under different treatments were tested by fluorescence quantitative method

3 結(jié)論與討論

本研究中，克隆了ORFV-CQsz 株的059 基因，發(fā)現(xiàn)該基因編碼蛋白F1L的氨基酸序列C-端包含2個(gè)跨膜區(qū)域。由于存在跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)域，導(dǎo)致蛋白不容易獲得高效表達(dá)。目前，對于跨膜蛋白的表達(dá)，通常采取截去跨膜區(qū)段，再對剩余部分蛋白質(zhì)進(jìn)行表達(dá)[17]。本研究中，通過對F1L-CQsz 蛋白質(zhì)的DNA 編碼序列進(jìn)行優(yōu)化處理后合成，以此構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒菌，最終實(shí)現(xiàn)了對目標(biāo)蛋白的高效表達(dá)。

病原黏附細(xì)胞并侵入感染，通常是多種因子協(xié)同作用的結(jié)果[18]，但黏附宿主細(xì)胞是感染發(fā)生的第一步。研究[19-21]發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌、病毒、寄生蟲等病原體特異地黏附真核細(xì)胞表面的氨基葡聚糖分子（如肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸軟骨素等多糖）受體，是形成病原感染的主要機(jī)制之一。經(jīng)對ORFV-CQsz 059 基因及其編碼蛋白分析，發(fā)現(xiàn)F1L-CQsz 蛋白有肝素結(jié)合活性；此外，作為一種痘病毒，GTPV外膜蛋白中包含有結(jié)合細(xì)胞表面肝素類似物的Pox_P35 結(jié)構(gòu)域[16]，這就意味著蛋白F1L-CQsz 和GTPV AV41 均可黏附細(xì)胞表面。在本研究中，對兩者進(jìn)行不同處理后孵育BHK21 細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)F1L-CQsz 蛋白干擾了GTPV AV41 株黏附BHK21細(xì)胞，降低了病毒黏附細(xì)胞的拷貝數(shù)。其原因可能是蛋白與病毒競爭性吸附細(xì)胞表面受體，從而導(dǎo)致細(xì)胞黏附病毒的數(shù)量變少。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)1L-CQsz 蛋白介導(dǎo)了ORFV 黏附BHK21 細(xì)胞，表明其功能可能與ORFV其他毒株的F1L蛋白功能一樣，在黏附宿主細(xì)胞上發(fā)揮作用[10]。由于F1L 蛋白是ORFV 的一種重要囊膜蛋白，提示ORFV 可影響GTPV 黏附和感染宿主細(xì)胞。

鑒于國內(nèi)尚無預(yù)防羊口瘡的商品化疫苗，臨床上對羊口瘡的防控形勢十分嚴(yán)峻。生產(chǎn)實(shí)踐中以GTPV AV41 株制備的山羊痘活疫苗廣泛免疫注射羊群，而ORFV 可影響GTPV 黏附和感染宿主細(xì)胞；因此，在使用GTPV 弱毒活疫苗免疫山羊之前，檢測羊群健康狀態(tài)，確保羊群不攜帶ORFV，可更好的發(fā)揮GTPV 活疫苗的免疫效果。