BnaYUCCA10 基因在不同油酸含量油菜中的表達(dá)

郭詩芬，鐘婷婷，盧文斌，劉忠松，鄔賢夢,2，官春云，肖鋼,2*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.水稻油菜抗病育種湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410128)

高油酸菜籽油具有營養(yǎng)價(jià)值高、穩(wěn)定性強(qiáng)、保質(zhì)期長等優(yōu)點(diǎn)[1–2]。目前對油菜油酸相關(guān)基因的研究大多集中于對脂肪酸去飽和酶(FADs)基因家族的研究[3–5]，而對脂肪酸代謝調(diào)控途徑中其他基因的研究較少。黃素單加氧酶(YUCCA)家族是植物生長素依賴色氨酸合成途徑的關(guān)鍵限速酶[6]，這些酶可催化丙酮酸丙酮酯直接轉(zhuǎn)化為吲哚–3–乙酸(IAA) ， 而 吲 哚–3– 丙 酮 酸 單 氧 合 酶 基 因(BnaYUCCA10)是生長素IAA 生物合成途徑中的限速酶基因。在發(fā)育中的油菜籽粒中，IAA 含量受該基因影響較大。目前，已在擬南芥[7–8]、水稻[9]、玉米[10]和番茄[11]中成功克隆了BnaYUCCA10同源基因，該基因在不同類型植物的生長和發(fā)育中具有相似的作用。筆者曾對2 組不同油酸含量的甘藍(lán)型近等基因系油菜進(jìn)行miRNA 測序，結(jié)果(待發(fā)表)表明，與生長素合成相關(guān)的靶基因BnaYUCCA10在該近等基因系中的表達(dá)差異顯著。本研究中，以不同油酸含量的甘藍(lán)型油菜為對象，分析BnaYUCCA10基因在不同油酸含量材料中的表達(dá)情況，并對BnaYUCCA10基因是否參與油酸的代謝進(jìn)行分析，旨在發(fā)現(xiàn)新的與油酸代謝相關(guān)的基因，為研究甘藍(lán)型油菜油酸代謝的分子機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

以30 份甘藍(lán)型油菜為材料，使用安捷倫7890B氣相色譜儀測定其油酸含量，結(jié)果見表1。材料1～20 號為甘藍(lán)型高油酸材料，21～30 號為甘藍(lán)型非高油酸材料，均由水稻油菜抗病育種湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

表1 30 份甘藍(lán)型油菜材料的油酸含量Table 1 Fatty acid contents in 30 rape seeds %

1.2 方法

1.2.1 取樣

試驗(yàn)于2018 年9 月至2019 年5 月在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)耘園基地進(jìn)行。2018 年9 月30 日播種，2019年5 月1 日收獲，按大田管理方式進(jìn)行管理。每個(gè)小區(qū)面積10 m2，種植密度12 萬株/hm2。3 次重復(fù)。在油菜的營養(yǎng)生長期、花期和角果期進(jìn)行取樣。營養(yǎng)生長期分別于油菜幼苗期、5～6 葉期和蕾薹期取第1 片新葉；花期取花蕾中子房、開花1 d 的子房和開花5 d 的子房；角果期取開花15 d、開花25 d和開花35 d 的種子。以上材料各取5 株，混合保存于–80 ℃冰箱內(nèi)，備用。

1.2.2 RNA 提取

采用TransZol Up Plus RNA Kit(Trans Gene Biotech)提取總RNA；采用瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop 2000 檢測RNA 質(zhì)量與濃度。

1.2.3BnaYUCCA10基因的表達(dá)量分析

運(yùn)用Primer Premier 6.0 設(shè)計(jì)RT–PCR 引物(表2)，以BnaUBC9作為內(nèi)參基因[12]，參照PFAFFL[13]的方法，使用Bio–Rad CFX96 熒光定量PCR 儀測定BnaYUCCA10基因的表達(dá)量。3 次重復(fù)，結(jié)果取平均值。

表2 熒光定量引物序列Table 2 Primer for RT-PCR

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；運(yùn)用Excel 2010 繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 BnaYUCCA10 基因在營養(yǎng)生長期的表達(dá)

營養(yǎng)生長期BnaYUCCA10基因在30 份甘藍(lán)型油菜中的表達(dá)情況見圖1。從圖1 可以看出，除7、13、14、15、16 號材料外，其他材料幼苗期、5～6葉期、蕾薹期BnaYUCCA10的表達(dá)量呈逐漸增加的趨勢；營養(yǎng)生長期高油酸材料和非高油酸材料的表達(dá)量無顯著差異。

圖1 營養(yǎng)生長期BnaYUCCA10 基因的相對表達(dá)量Fig.1 Expression level of the BnaYUCCA10 gene during vegetative growth

2.2 BnaYUCCA10 基因在花期的表達(dá)

花期BnaYUCCA10基因在30 份甘藍(lán)型油菜中的表達(dá)情況見圖2。從圖2 可以看出，除2、6、9、10、17 號材料外，其他材料1 d 的花中BnaYUCCA10基因的表達(dá)量均高于花蕾和5 d 的花中的表達(dá)量；花蕾和5 d 的花中高油酸材料的BnaYUCCA10基因表達(dá)量高于非高油酸材料的表達(dá)量，1 d 的花中高油酸材料的表達(dá)量低于非高油酸材料的表達(dá)量。

圖2 開花期BnaYUCCA10 基因的相對表達(dá)量Fig.2 Expression level of the BnaYUCCA10 gene during the flowering period

2.3 BnaYUCCA10 基因在角果期的表達(dá)

BnaYUCCA10基因在30 份甘藍(lán)型油菜角果期的表達(dá)情況見圖3。從圖3 可以看出，除14、15 號材料外，其他材料15 d 的種子、25 d 的種子、35 d的種子BnaYUCCA10的表達(dá)量均呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢；15 d 的種子中的BnaYUCCA10基因表達(dá)量是25 d 的種子中的1.1～2.4 倍，是35 d 的種子中的1.3～3.9 倍；角果期高油酸材料的BnaYUCCA10表達(dá)量高于非高油酸材料的表達(dá)量。

圖3 角果期BnaYUCCA10 基因的相對表達(dá)量Fig.3 Expression level of the BnaYUCCA10 gene during the silique period

2.4 BnaYUCCA10基因表達(dá)水平與油酸含量之間的相關(guān)性分析

對30 個(gè)油菜品系的BnaYUCCA10基因在整個(gè)生育時(shí)期的表達(dá)量與油酸含量進(jìn)行線性及非線性相關(guān)性分析。結(jié)果(表3)表明：營養(yǎng)生長期的葉片及花期的花蕾、1 d 的花中的表達(dá)量與油酸含量均無顯著相關(guān)性；而角果期的種子及5 d 的花中基因表達(dá)量與油酸含量間均呈極顯著正相關(guān)。

表3 BnaYUCCA10 基因表達(dá)量與種子油酸含量的相關(guān)性Table 3 Correlation a nalysis between BnaYUCCA10 gene expression and seed oleic acid content

3 結(jié)論與討論

前人研究結(jié)果表明，油菜發(fā)育早期一些基因的表達(dá)量可用于預(yù)測油菜的生長[14]。王曉丹等[15]分析了BnaHSP90和BnaATG3基因在油菜發(fā)育早期的表達(dá)與油菜抗病性的相關(guān)性。常濤等[16]發(fā)現(xiàn)BnDGAT1和BnPDAT1基因的表達(dá)與油菜種子成熟后的含油量呈顯著正相關(guān)。本研究中，生長素合成的關(guān)鍵基因BnaYUCCA10在高油酸材料中的表達(dá)量高于非高油酸材料的，且在5 d 的花和角果期中的表達(dá)量與種子油酸含量呈極顯著正相關(guān)，這與筆者前期進(jìn)行的miRNA 測序結(jié)果一致，表明BnaYUCCA10基因的表達(dá)水平可用于預(yù)測油菜籽的油酸含量。

BnaFAD2是影響油酸積累的關(guān)鍵基因。劉睿洋等[17]克隆了油菜籽中BnaFAD2基因并分析了其功能和結(jié)構(gòu)。熊興華等[18]采用基因槍法將BnFAD2基因?qū)敫仕{(lán)型油菜中，為高油酸油菜育種提供了基礎(chǔ)材料。劉芳等[19]同時(shí)干擾了油菜中的BnFAD2、BnFAD和BnFATB基因，使油酸含量從66.76%增至82.98%。PENG 等[4]同時(shí)沉默BnaFAD2和脂肪酸延伸酶1 基因(FAE1)，獲得了油酸含量大于85%的轉(zhuǎn)基因品系。然而，僅抑制BnaFAD2基因很難獲得油酸含量大于85%的油菜籽。本研究結(jié)果表明，BnaYUCCA10基因的表達(dá)量在角果期與油酸含量呈極顯著正相關(guān)，與主效基因BnaFAD2的作用相反，可以初步確定該基因與FAD2基因均為影響油酸含量的基因。BnaYUCCA10基因作為潛在促進(jìn)油酸合成的基因，將有助于高油酸油菜分子機(jī)理的研究。

YUCCA基因家族編碼的黃素單加氧酶是生長素合成過程中色氨酸依賴途徑中的1 個(gè)限速酶，在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用[20]。楊芳慧等[21]發(fā)現(xiàn)茶樹CsYUCCA10的表達(dá)量隨著花的生長發(fā)育呈增加趨勢。李娜[22]研究發(fā)現(xiàn)，TaYUC基因在小麥中的表達(dá)具有時(shí)空特異性，在生殖器官(花和種子)中強(qiáng)烈表達(dá)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，營養(yǎng)生長期大部分材料中BnaYUCCA10基因表達(dá)量隨生育進(jìn)程逐漸增加；花期1 d 的花中BnaYUCCA10的表達(dá)量高于花蕾和5 d 的花的表達(dá)量；角果期BnaYUCCA10基因的表達(dá)水平逐漸降低，表明BnaYUCCA10基因可能在油菜的生長發(fā)育過程中起到關(guān)鍵的調(diào)控作用，可為今后油菜生長發(fā)育調(diào)控及YUCCA基因的研究提供參考。