霉變?nèi)叻壑胁≡姆蛛x鑒定

和玉鳳，張關(guān)能**，劉恩芬，付玲凡，和春龍

(1.云南聯(lián)大科技產(chǎn)業(yè)有限責(zé)任公司，云南 昆明 650500；2.云南中煙再造煙葉有限責(zé)任公司，云南 昆明 650106)

三七(Panaxnotoginseng)，又名人參三七、田七、文州三七、參三七，味甘，微苦，無毒，是中國享譽海內(nèi)外的傳統(tǒng)名貴中藥材，其根和葉都可以做藥，具有“散瘀止血、消腫定痛、益氣活血”等效果[1]。現(xiàn)代藥理藥效研究[2-5]發(fā)現(xiàn)，三七對心腦血管系統(tǒng)、代謝系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)疾病防治都有顯著的療效，有享“參中之王”“金不換”“南國神草”等美譽。

三七的成分構(gòu)成十分復(fù)雜，其中含有多糖、黃酮、三七皂苷、多種微量元素、多肽類化合物[6]等化學(xué)物質(zhì)，這些成分是三七吸水性較強(qiáng)的主要因素。因此，在三七的生產(chǎn)、加工、包裝、運輸、存儲等過程中，即使已經(jīng)加強(qiáng)注意，但三七還是容易出現(xiàn)發(fā)霉、變質(zhì)等現(xiàn)象[7]。云南作為三七的主產(chǎn)區(qū)，全國95%以上的三七都來自云南。據(jù)行業(yè)協(xié)會統(tǒng)計，云南省在2015年，三七種植面積就達(dá)到6.72萬hm2(100.8萬畝)，三七交易收入高達(dá)103億元人民幣，三七的年產(chǎn)量為4.9萬噸[8]。隨著國家的技術(shù)支持，三七種植貯藏規(guī)模也越來越大，出現(xiàn)的霉變情況也隨著增多，造成的損失也越來越大。宋美芳等[9]從自然儲藏后霉變的三七中分離到擬青霉屬、青霉素和鐮刀菌屬真菌，其中淡紫擬青霉和桔青霉為優(yōu)勢菌，同時分離到三七致病菌尖孢鐮刀菌和茄腐鐮刀菌。王炳艷等[10]采用發(fā)霉三七挑選出菌絲進(jìn)行培養(yǎng)和純化，分離到了米曲霉舒展變種、塔賓曲霉、日本曲霉原變種、炭黑曲霉、粒落曲霉、寄生曲霉、聚多曲霉、毒曲霉、合陽曲霉、多育曲霉、溜曲霉、兩形頭曲霉、肇慶曲霉和黃曲霉柱頭變種等14種曲霉。

本研究從霉變的三七粉中分離出了赭綠青霉(P.ochrochloron)、橘青霉(P.citrinum)、黃曲霉(A.flavus)、拜賴青霉(Penicilliumbilaiae)、草酸青霉菌(P.oxalicum)、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)和土曲霉(A.terreus)等7種霉變真菌，并鑒定出了橘青霉和黃曲霉兩種，結(jié)果表明霉變?nèi)咧幸呀?jīng)含有霉菌毒素，建議人們不要食用已霉變?nèi)?，也為三七存儲提供一些參考依?jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

三七粉：采購于文山三七國際交易市場。

PDA培養(yǎng)基：用天平稱取馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂粉 20 g(液體培養(yǎng)基不加)，自然pH。配制的方法為：將土豆去皮后稱重，切成小塊或絲狀，保持沸騰狀態(tài)15～20 min，期間不斷攪拌，防止鍋底的淀粉沉淀煮糊，采用雙層紗布進(jìn)行過濾，然后加入葡萄糖，用水定容至 1 L，進(jìn)行分裝并封口，后于 121 ℃ 高溫滅菌鍋中滅菌 30 min。

1.2 方法

1.2.1 真菌菌株的分離和純化

用天平秤取 10 g 三七粉裝入 250 mL 錐形瓶，再用量筒量取 100 mL 無菌水加入錐形瓶，此時相當(dāng)于稀釋了10倍，放入 28 ℃、160 r/min 的條件下振蕩 30 min，靜置 5 min，在超凈工作臺中取上清液梯度稀釋為100倍、 1000倍，分別取各濃度稀釋液 0.2 mL，加到直徑為 9 cm 的培養(yǎng)皿中，進(jìn)行涂板。使用已滅菌的固體PDA培養(yǎng)基，加熱融化，待冷卻至 50 ℃ 左右加入氯霉素(使氯霉素質(zhì)量濃度為 10 μg/mL)后倒板，放置 30 min 左右冷卻凝固后即可以涂板，每個梯度的涂4皿，同時用無菌水涂4個板作為對照，涂板完成后用封口膠封口，置于 28 ℃ 的培養(yǎng)箱中，黑暗培養(yǎng) 4 d。取出培養(yǎng)基，數(shù)清菌落數(shù)。用接種針挑選出含真菌單菌落的樣本，轉(zhuǎn)移到其他新的培養(yǎng)基上，得到單一真菌，如果得到的不是單菌落再重復(fù)上一步。

1.2.2 形態(tài)學(xué)鑒定

用接種針挑取出單一真菌，接種于PDA培養(yǎng)基上，觀察菌落形態(tài)相同的視為同一菌株，篩選到9個菌株，分別標(biāo)記為37-1、37-2、37-3、37-4、37-5、37-6和37-7、37-8和37-9。

根據(jù)霉變菌落、分生孢子形態(tài)及分生孢子梗的觀察結(jié)果，參考《常見與常用真菌》[9]《真菌鑒定手冊》[10]進(jìn)行霉變菌的形態(tài)鑒定。

1.2.3 真菌的rDNA-ITS分子鑒定

按真菌rDNA-ITS分子鑒定法提取DNA，通過參考曹永軍等[11]的步驟進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后送到昆明擎科生物科技有限公司測序。

1.2.4 生物信息學(xué)分析與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

根據(jù)測序結(jié)果并在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中比對找出同源序列，利用分子進(jìn)化遺傳分析軟件(MEGA5.1)通過鄰接法構(gòu)建各菌株相關(guān)基因標(biāo)記的系統(tǒng)發(fā)育樹，綜合形態(tài)鑒定結(jié)果，進(jìn)一步鑒定個菌株所屬的種屬分類地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離結(jié)果

分離后根據(jù)細(xì)菌、真菌和放線菌菌落形態(tài)的不同進(jìn)行初步篩選，篩選結(jié)果見表1。

表1 初步分離菌落數(shù)

從結(jié)果看，分離時出現(xiàn)了大量的細(xì)菌菌落，經(jīng)形態(tài)觀察，大致分為6種，其中5種表面干燥，應(yīng)該為革蘭氏陽性菌；同時有一皿出現(xiàn)5個放線菌菌落，這些菌落在PDA培養(yǎng)基菌落致密，菌落呈放射狀，表明干燥，菌落為白色，5個菌落形態(tài)大致相同，可能是同一種放線菌。根據(jù)霉菌形態(tài)大致相同的并為1種，分離到9株真菌。

2.2 真菌形態(tài)鑒定

把2.1中分離到的9株真菌，按37-1、37-2、37-3、37-4、37-5、37-6、37-7、37-8和37-9標(biāo)識，并觀察真菌菌落形態(tài)，如圖1所示。對曲霉和青霉的分生孢子和菌絲進(jìn)行觀察，如圖2所示。

圖1 霉菌菌落形態(tài)(37-1到37-9)

圖2 曲霉和青霉分生孢子和菌絲

結(jié)合分子鑒定結(jié)果可知，37-1、37-4和37-7都可能是拜賴青霉；同時，通過菌株孢子的觀察，37-5、37-6、37-9分生孢子梗末端為具有頂囊，頂囊表面四周或上半部著生一層或兩層呈輻射狀排列的小梗，應(yīng)該為曲霉。37-2、37-3和37-8等幾個菌株的分生孢子梗頂端多次分枝成掃帚狀、分枝頂端著生小梗，符合青霉分生孢子形態(tài)[12]。

2.3 真菌分子鑒定

2.3.1 擴(kuò)增產(chǎn)物rDNA測序條

對擴(kuò)增產(chǎn)物用測序儀進(jìn)行分析測定，通過NCBI分子鑒定比對結(jié)果：37-1與Penicilliumbilaiaestrain CV1429相似度為100%；37-2與Penicilliumoxalicumisolate HC6相似度為99.83%；37-3與Penicilliumochrochloronisolate 38 相似度為100%；37-4與Penicilliumbilaiaestrain CBS 330.95相似度為100%；37-5與Aspergillusfumigatusstrain ASK16相似度為100%；37-6與Aspergillusterreusisolate OAT相似度為100%；37-7與PenicilliumbilaiaeNRRL 3391 相似度為99.82%；37-8與PenicilliumcitrinumstrainKACC43900 相似度為100%；37-9與Aspergillusflavusstrain CMXY27600相似度為100%。

2.3.2 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

因為菌株較多，本文選取一個青霉(37-1)，一個曲霉(37-5)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2.4 結(jié)果分析

通過NCBI分子鑒定比對結(jié)果，用系統(tǒng)發(fā)育樹鑒別菌株親緣關(guān)系，再結(jié)合形態(tài)鑒定可得：37-1與Penicilliumbilaiaestrain CV1429相似度為100%，為拜賴青霉；37-2與Penicilliumoxalicumisolate HC6相似度為99.83%，為草酸青霉菌；37-3與Penicilliumochrochloronisolate 38 相似度為100%，為赭綠青霉；37-4與Penicilliumbilaiaestrain CBS 330.95相似度為100%，為拜賴青霉；37-5與Aspergillusfumigatusstrain ASK16相似度為100%，為煙曲霉；37-6與Aspergillusterreusisolate OAT相似度為100%，為土曲霉；37-7與PenicilliumbilaiaeNRRL 3391 相似度為99.82%，為拜賴青霉；37-8與PenicilliumcitrinumstrainKACC43900 相似度為100%，為橘青霉；37-9與Aspergillusflavusstrain CMXY27600相似度為100%，為黃曲霉。

3 討論

在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，分離時細(xì)菌菌落數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于真菌菌落數(shù)量，考慮其中一些菌落中，存在一些具有抑制真菌生長的細(xì)菌。為了驗證這個猜想，又進(jìn)行了一系列實驗。

3.1 拮抗細(xì)菌的篩選

初步篩采用菌落對峙試驗，用接種針挑取黃曲霉接種于PDA平板中央， 3 cm直徑外用接種環(huán)接種6個菌株(Z-1到Z-6)菌液，28 ℃ 培養(yǎng)7 d， 觀察生長狀況及抗菌表型。結(jié)果Z-1到Z-4都有抑菌作用，Z-1效果最好，結(jié)果見圖3。另外，三個較差，所以淘汰掉效果不好和沒有效果的菌株，只留下Z-1。

圖3 Z-1對黃曲霉的抑制作用

3.2 Z-1的鑒定

因為Z-1效果很好，所以對該菌株進(jìn)行了生理生化鑒定和分子鑒定。菌株的生理生化特征結(jié)果見表2。

表2 菌株Z-1的主要生理生化特征

生理生化鑒定參考，分子鑒定參考。NCBI對比結(jié)果顯示Z-1與Bacillusvelezensisstrain CD91相似度達(dá)到100%，結(jié)合生理生化鑒定結(jié)果，可以鑒定Z-1為絲狀芽孢桿菌(Bacillusvelezensi)。霉菌廣泛分布于自然界，不少霉菌都會產(chǎn)生對人畜有害的霉菌毒素。因此霉菌與霉菌毒素對食品的污染越來越受到人們的重視。中藥材受到真菌污染的情況很常見，各種藥材受到真菌污染程度不同，污染真菌種類也不同。國外，Wongwiwat Tassaneeyakul 檢測了泰國28種中藥產(chǎn)品，受到黃曲霉毒素污染中藥產(chǎn)品有18%[17]。M.Halt對62份藥用植物和11份藥茶用品進(jìn)行檢測，赭曲霉毒素和黃曲霉毒素為主要污染毒素[18]。國內(nèi)，陳微對18種中藥材表面真菌及真菌毒素污染研究發(fā)現(xiàn)12種優(yōu)勢真菌中10種以可以產(chǎn)毒，產(chǎn)生的毒素包括黃曲霉毒素[19]。宋美芳等對云南草果表面真菌進(jìn)行分離鑒定表明草果污染菌中的優(yōu)勢菌為淡紫擬青霉和黃曲霉[20]。Z-1菌株對黃曲霉抑制效果極為顯著，具有極高的生防潛力。

4 結(jié)論

實驗從霉變?nèi)叻壑蟹蛛x得到9個菌株，其中有3個曲霉和6個青霉，有3個青霉為同一種，即分離得到2屬7種霉菌，其中的桔青霉，煙曲霉和黃曲霉都會產(chǎn)生霉菌毒素。表明霉變的三七粉受到霉菌毒素污染的威脅。三七粉的價格相對較高，在日常生活中，往往會由于存貯不當(dāng)或者存放時間太長等一些情況導(dǎo)致三七粉發(fā)生霉變現(xiàn)象，有些肉眼看到的霉變情況不太嚴(yán)重，直接丟棄比較浪費。三七粉具有藥用價值，僅考慮可能降低了藥效，但是往往忽略了霉變產(chǎn)生的霉菌毒素的攝入可能對身體帶來更大的危害，有些毒素含量達(dá)到一定的濃度，甚至可能致死。