修飾β-環(huán)糊精與非瑟酮包合物的制備及其抗氧化活性研究*

盤振杰，楊敏芬，黃秋萍，張貞發(fā)，王 強(qiáng)

(廣西民族師范學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西 崇左 532200)

非瑟酮,又名漆黃素，化學(xué)名為3,3′,4′,5,7-五羥基黃酮，能溶于酒精、丙酮、醋酸、燒堿溶液[1]，有廣泛的藥理作用，具有抗腫瘤、抗氧化、抗感染等多種活性[2-3]。當(dāng)代藥理學(xué)研究證實(shí)，非瑟酮抗腫瘤作用顯著，其主要是通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞遷移與侵襲等多種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用[4]。β-環(huán)糊精(β-CD) 是由7個(gè)D-吡喃葡萄糖單元通過α-1，4糖苷鍵連接而成的環(huán)狀低聚糖化合物，分子形狀略呈錐形，錐腔外存在大量基而呈親水性，錐腔內(nèi)呈疏水性[5]。正是β-CD這類疏水的空腔，允許辨別很多含有疏水基團(tuán)的化合物，并與其形成主客體包合物的特殊結(jié)構(gòu)與性質(zhì)，在許多領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。藥物通過與環(huán)糊精形成包合物，可以提高其穩(wěn)定性和溶解性，以增強(qiáng)其生物利用度。本實(shí)驗(yàn)用β-CD與順丁烯二酸及N,N′-二(3-氨丙基)乙二胺制備環(huán)糊精衍生物，并研究其水溶性、結(jié)合常數(shù)，以及抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

傅立葉紅外變換光譜儀(美國(guó)Perkin Elmer公司)；UV-8000紫外可見分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)；DZF-6020真空干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限公司)；AR224CN電子天平(奧豪斯儀器(上海)有限公司)。β-CD(生化試劑，BR級(jí))、順丁烯二酸酐、氯化亞砜、N,N′-雙(3-氨丙基)乙二胺、非瑟酮、氫氧化鈉、丙酮、無水乙醇、三乙胺、DMF，均為分析純。

1.2 主體的合成

將 12 gβ-CD、30 mL DMF、3 mL 三乙胺置于三頸燒瓶中，反應(yīng)溫度 80 ℃。在此溫度下，緩慢滴加 2 g 順丁烯二酸酐 10 mL 溶液，攪拌反應(yīng) 8 h，反應(yīng)結(jié)束至冷卻。將反應(yīng)液慢滴到劇烈攪拌的丙酮中清洗，抽濾，最后在 50 ℃ 下干燥得到化合物B。產(chǎn)率約為72%。合成路線如圖1。

圖1 合成路線

將 6 gβ-CD順丁烯二酸單酯粉末，溶于 12 mL DMF中，加入 15 mL 氯化亞砜，反應(yīng) 2 h。滴加甲醇，除去多余的氯化亞砜，直至沒有氣泡冒出。加入 20 mL N′,N-二(3-氨丙基)乙二胺，在 80 ℃ 下反應(yīng) 2 h。用丙酮洗滌，抽濾，在 50 ℃ 下干燥 1 d，得到主體C產(chǎn)物。合成路線見圖1。

1.3 包合物的制備

用 6 mL 蒸餾水溶解 48.54 mg(約 0.035 mmol)的主體，緩慢滴加 20.00 mg(約 0.07 mmol)非瑟酮(用 9 mL 無水乙醇溶解)，在 45 ℃ 下密閉反應(yīng) 4 h。停止反應(yīng)后冷卻至室溫，在真空干燥箱中 45 ℃ 干燥反應(yīng)液，得到固體。固體用 2 mL 蒸餾水再次溶解至完全，用 0.45 μm 的纖維素膜過濾，溶液在 45 ℃ 下烘干，得到固體，即為主體-非瑟酮包合物。

1.4 主體與非瑟酮間結(jié)合穩(wěn)定常數(shù)的測(cè)定

測(cè)定和計(jì)算主體與非瑟酮之間的結(jié)合穩(wěn)定常數(shù)采用的是UV法。配制主體乙醇-水(V乙醇∶V水=3∶2)溶液濃度為5.0×10-4mol/L，備用。再配置上述濃度的非瑟酮溶液備用。取10個(gè) 5 mL 容量瓶，都加入 200 μL 非瑟酮溶液，每瓶分別加入主體溶液100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000 μL，得到濃度梯度分別為1.0×10-5、2.0×10-5、3.0×10-5、4.0×10-5、5.0×10-5、6.0×10-5、7.0×10-5、8.0×10-5、9.0×10-5、10.0×10-5mol/L 的主體-非瑟酮乙醇溶液。然后采用UV測(cè)定上述溶液，波長(zhǎng)為200～600 nm 范圍，記錄吸光度值(A)。

1.5 非瑟酮、主體及包合物的IR表征

在干燥的實(shí)驗(yàn)環(huán)境里，將烘干的KBr粉末分別與非瑟酮、主體及主體與非瑟酮的包合物混合均勻，并壓成半透明的薄片，然后采用IR法在500～4000 cm-1內(nèi)對(duì)非瑟酮、主體及包合物進(jìn)行表征。

1.6 包合物抗氧化活性的測(cè)定

采用DPPH自由基清除法測(cè)定包合物的抗氧化活性。稱取 3.9 mg DPPH自由基，用無水乙醇溶解，定容在 50 mL 容量瓶，得到濃度為2×10-4mol/L 的DPPH醇溶液，備用。稱取 83.78 mg 包合物藥品，用V無水乙醇∶V水=3∶2的混合溶劑溶解，定容在 50 mL 容量瓶，得到濃度為1.0×10-3mol/L 的包合物乙醇溶液。取5支 10 mL 容量瓶，配制一系列質(zhì)量濃度梯度分別0.25、0.5、0.75、1.0、1.25 mg/mL 的包合物乙醇溶液。在測(cè)定吸光度之前，先用無水乙醇校正，并于λ=517 nm 處，測(cè)量A樣品。隨后，分別加入 2.5 mL 濃度為2×10-4mol/L 的DPPH自由基醇溶液，并盡量混合均勻，在黑暗條件放置 0.5 h。于λ=517 nm 處，測(cè)量A空白。最后把樣品換為DPPH溶液，于λ=517 nm 處，測(cè)量A對(duì)照。重復(fù)上述從操作。

根據(jù)公式：K=[1-(A樣品-A空白)/A對(duì)照]×100%，可計(jì)算出DPPH的自由基清除率。

2 結(jié)果與討論

2.1 主體-非瑟酮的結(jié)合穩(wěn)定常數(shù)分析

查閱文獻(xiàn)可知，非瑟酮在λ=300～500 nm 范圍里有紫外吸收，而主體在這波長(zhǎng)范圍里幾乎無紫外吸收，因此該實(shí)驗(yàn)通過選擇不改變非瑟酮的濃度而唯獨(dú)改變主體的濃度來測(cè)量吸光度值(A)。如圖2所示，隨著主體濃度的增加，吸收峰強(qiáng)也隨著增大，可能主體與非瑟酮發(fā)生反應(yīng)，形成包合物。接著取λ=365 nm 處的吸光度值(A)建立工作曲線。由圖2可知，曲線的線性關(guān)系良好。

圖2 主體與非瑟酮結(jié)合穩(wěn)定常數(shù)

由于主體與非瑟酮的包合比例是1∶1，所以主體與非瑟酮的反應(yīng)過程滿足下列計(jì)算公式：

式中：C1為主體的初始濃度；C2為客體非瑟酮的初始濃度，α為紫外可見光譜的敏感因子，ΔA為加入客體非瑟酮前后的相對(duì)吸強(qiáng)度。取橫坐標(biāo)為C1，縱坐標(biāo)為C2C1/ΔA，繪制出線性擬合曲線。由圖1可得知主體與客體非瑟酮的包合過程呈現(xiàn)出的線性關(guān)系不錯(cuò)。

最后依據(jù)擬合曲線的斜率與截距能夠計(jì)算出主體與非瑟酮之間的結(jié)合穩(wěn)定常數(shù)是：KS=2.1308×105。

2.2 紅外光譜分析

圖3為非瑟酮(a)，主體(b)，主體與非瑟酮包合物(c)的紅外吸收光譜圖。在3圖中可見,a在 3487 cm-1有羥基伸縮振動(dòng)、在 1649 cm-1有雙鍵伸縮振動(dòng)、在 1617 cm-1有羰基伸縮振動(dòng)等;b在 2937 cm-1、2754 cm-1有氨基中等雙峰的伸縮振動(dòng)。根據(jù)圖3可見，1645 cm-1左右的吸收峰加強(qiáng)，可能是包合物所形成的。同時(shí)，觀察到主體與非瑟酮的包合物(c)的特征吸收峰與非瑟酮和主體的特征吸收峰大致相同，因此可得知包合物中和了非瑟酮和主體的吸收峰。正因?yàn)檫@三者所處的環(huán)境、吸收強(qiáng)度均不同，所以峰的強(qiáng)度有所不同。說明了非瑟酮和主體形成了包合物。

圖3 紅外光譜圖

2.3 包合物抗氧化活性分析

研究清除自由基最常用的方法就是DPPH分析法。自由基DPPH穩(wěn)定存在有機(jī)物溶液里，且于λ=517 nm 下具有較好的吸收強(qiáng)度。包合物的孤對(duì)電子可以與能夠清除自由基的物質(zhì)配對(duì)，這就導(dǎo)致在該波長(zhǎng)下的吸收被削弱乃至消失。它的吸光度值的變化程度能夠作為自由基清除率能力強(qiáng)弱的依據(jù)。如圖4顯示，該包合物的DPPH自由基的清除效果于0.25～1.25 mg/mL 范圍內(nèi)里隨著質(zhì)量濃度的增加而增大。由此看出該包合物具有較好的抗氧化能力。

圖4 包合物的DPPH自由基清除活性

3 總結(jié)

本文通過水溶液法合成β-CD順丁烯二酸單酯，再與氯化亞砜和N,N′-二(3-氨丙基)乙二胺反應(yīng)，從而制得N,N′-二(3-氨丙基)乙二胺修飾β-CD(主體)，然后用飽和水溶液法制備主體與非瑟酮(客體)的包合物。采用UV、IR等表征，并測(cè)定主體與客體的結(jié)合穩(wěn)定常數(shù)為KS=2.1308×105。采用DPPH法測(cè)定包合物的抗氧化活性，結(jié)果表明，包合物對(duì)DPPH自由基具有較好的清除能力。