基于網(wǎng)絡藥理學技術(shù)的肉蓯蓉治療便秘的分子機制研究

范毓慧 ，趙迪，劉歡樂，衛(wèi)拂曉，秦雪梅*，劉曉節(jié)*

（1.山西大學 中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，山西 太原 030006；2.山西大學 生物醫(yī)藥與大健康研究院，山西 太原 030006）

0 引言

隨著人們飲食結(jié)構(gòu)的改變、平均壽命的延長及精神心理疾病的增加，便秘的發(fā)生率逐年增高［1-2］。循證醫(yī)學研究報道，我國便秘的發(fā)生率高達3%～11%［3］。便秘是臨床上常見的消化系統(tǒng)疾病，主要由大腸的傳導功能障礙引起。臨床癥狀多見排便困難、糞便干結(jié)、排便次數(shù)減少及排便不盡等。便秘不僅會引起人體電解質(zhì)紊亂，打破機體酸堿平衡，還會影響情緒，導致抑郁、煩躁、注意力下降等精神癥狀［4］。便秘產(chǎn)生的原因較為復雜，與腦-腸軸異常、Cajal間質(zhì)細胞異常、激素和神經(jīng)遞質(zhì)異常、排便動力學異常以及心理因素的影響等密切相關(guān)［5］。

西醫(yī)對便秘的治療常采用生物反饋療法、藥物療法、手術(shù)療法等［6］。西藥雖然見效快，但有一定的副作用，而中醫(yī)藥在治療便秘上具有得天獨厚的優(yōu)勢，其療效好、副作用少，而且有利于提高患者的依從性［7］。

肉蓯蓉，列當科植物肉蓯蓉（Cistanche de?serticola Y.C.Ma）或管花肉蓯蓉C.tubulosa（Schenk）Wight的干燥帶鱗葉肉質(zhì)莖，其性溫，味苦、咸，歸腎、大腸經(jīng)，具有補腎陽、益精血、潤腸通便等功效［8］。在治療老年功能性便秘中藥處方中，肉蓯蓉的使用率頻率高達57.92%［9］，且肉蓯蓉單味藥及含肉蓯蓉的中藥復方藥治療便秘的臨床療效顯著，但其治療便秘的作用機制仍有待進一步研究［10-11］。

網(wǎng)絡藥理學應用多向藥理學和系統(tǒng)生物學的思想，通過已有數(shù)據(jù)庫探究藥物靶點與疾病靶基因的相互作用，并構(gòu)建關(guān)系網(wǎng)絡，分析藥物的作用機制，已成為中藥研究的熱門工具［12］。

本研究基于文獻檢索和數(shù)據(jù)庫查詢方式收集肉蓯蓉的化學成分和作用靶點，運用網(wǎng)絡藥理學的方法對其進行歸納和整理，并通過生物信息學分析，構(gòu)建“結(jié)構(gòu)類型-活性成分-靶點-信號通路”網(wǎng)絡，探討肉蓯蓉治療便秘潛在的作用機制。研究結(jié)果將為肉蓯蓉治療便秘的臨床應用提供理論依據(jù)，以期為進一步研究其作用機制提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫與軟件

中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TC?MSP，Traditional Chinese Medicine Systems Phar?macology Database and Analysis Platform）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php/）；PubChem 數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；PharmMapper服務器（http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/submitfile.html/）；UniProt數(shù)據(jù)庫（http：//www.uniprot.org/uniprot/）；Gene?Cards數(shù)據(jù)庫（http：//www.genecards.org/）；OMIM數(shù)據(jù)庫（https：//www.omim.org/）；String數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/，Ver?sion11.0）；PDB數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org/）；R軟件clusterProfiler軟件包、ggplot2軟件包；chemBio3D ultra 14.0軟件；Cytoscape3.7軟件；AutoDock軟件。

1.2 肉蓯蓉化學成分的收集與活性成分的篩選

以“肉蓯蓉”（Cistanches Herba）為關(guān)鍵詞，在TCMSP中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺完成對肉蓯蓉化學成分的檢索。以口服生物利用度（OB，OB≥30%）和生物活性分子的類藥性（DL，DL≥0.18）作為篩選條件，篩選肉蓯蓉的活性成分。通過大量文獻挖掘與整理獲取已報道的肉蓯蓉治療便秘的潛在活性成分，一并納入此次研究。

1.3 肉蓯蓉治療便秘作用靶點的篩選

在PubChem數(shù)據(jù)庫中下載肉蓯蓉活性成分的.sdf格式化學結(jié)構(gòu)圖，并利用ChemBio3D ul?tra14.0軟件轉(zhuǎn)化為.mol2格式，上傳到Pharm?Mapper數(shù)據(jù)庫，使用Select Targets篩選作用靶點。將所有成分得到的作用靶點取交集，作為肉蓯蓉的成分靶點。在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（Uni?Prot）中，應用“UniProtKB”功能檢索上述成分靶點，得到其相應的官方名稱（official symbol）。

以“Constipation”（便秘）、“Colonic Inertia”（結(jié)腸無力）、“Dyschezia”（大便困難）為關(guān)鍵詞，利用OMIM數(shù)據(jù)庫和GeneCards數(shù)據(jù)庫篩選與便秘相關(guān)的基因靶點，并與肉蓯蓉活性成分靶點取交集，得到肉蓯蓉治療便秘的潛在作用靶點。

1.4 肉蓯蓉治療便秘“活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡的構(gòu)建

利用Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建肉蓯蓉的活性成分與治療便秘的作用靶點的可視化網(wǎng)絡圖。網(wǎng)絡圖中節(jié)點（node）表示肉蓯蓉活性成分和作用靶點，邊（edge）表示活性成分與作用靶點間的相互關(guān)聯(lián)。

1.5 蛋白相互作用網(wǎng)絡（PPI）構(gòu)建與分析

將肉蓯蓉治療便秘的潛在作用靶點導入String數(shù)據(jù)庫，基于String數(shù)據(jù)庫獲取靶點蛋白的交互作用信息。結(jié)果保存為TSV格式，并導入Cytoscape軟件，對其進行網(wǎng)絡分析，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡。網(wǎng)絡圖中節(jié)點越大，顏色越紅，代表度值（Degree）越大，該節(jié)點代表的靶點越重要，度值排名前5的靶點為肉蓯蓉治療便秘的重要靶點。

1.6 生物信息學分析

使用Bioconductor中的R軟件包clusterpro?file對肉蓯蓉的潛在作用靶點進行生物信息學分析。選擇GO富集分析中的生物過程（Bio?logical Processes，BP）、細胞組分（Cellular Com?ponent，CC）和分子功能（Molecular Function，MF）以及KEGG通路富集分析。選擇物種為人（Homo spanies），設定閾值P<0.05，Q<0.05。按照涉及的靶點數(shù)目進行排序，使用R軟件繪制條形圖及氣泡圖，展示富集結(jié)果。

1.7 “結(jié)構(gòu)類型-活性成分-靶點-信號通路”網(wǎng)絡的構(gòu)建與分析

將得到的肉蓯蓉治療便秘的潛在活性成分、作用靶點及信號通路，建立結(jié)構(gòu)類型-活性成分、活性成分-靶點、靶點-信號通路的對應關(guān)系，然后導入Cytoscape軟件構(gòu)建可視化網(wǎng)絡。使用Network Analyzer插件進行網(wǎng)絡拓撲分析，篩選重要的活性成分及作用靶點。

1.8 成分-靶點分子對接分析

從PDB數(shù)據(jù)庫中下載SRC與AKT1蛋白的3D結(jié)構(gòu)，并使用PyMOL軟件對蛋白質(zhì)進行去水，氫化等處理。使用Auto Dock Tools軟件，將處理好的蛋白質(zhì)與其相對應的活性成分進行結(jié)合，結(jié)合能小于0說明配體與受體可以自發(fā)的結(jié)合。

2 結(jié)果

2.1 肉蓯蓉活性成分的收集與篩選

通過TCMSP平臺搜索“肉蓯蓉”（Cistanch?es Herba），得到其化學成分共75個，以OB≥30%，DL≥0.18篩選得到6種化學成分。大量文獻挖掘后，篩選出11種治療便秘的潛在活性物質(zhì)，共獲得17種肉蓯蓉治療便秘的潛在活性成分（表1）。

表1 肉蓯蓉潛在活性成分信息Table 1 Potential active components of Cistanche deserticola

2.2 肉蓯蓉治療便秘相關(guān)作用靶點的篩選

在Pharmmapper數(shù)據(jù)庫中，以fit值大于2.5為篩選條件，共得到與肉蓯蓉17個潛在活性成分相關(guān)的靶點3 876個。去除重復后將靶點導入Uniprot數(shù)據(jù)庫，限定物種為人并校正為官方名稱，共整合得到肉蓯蓉潛在活性成分作用靶點415個。將上述靶點與OMIM和GeneCards數(shù)據(jù)庫中篩選得到的便秘相關(guān)靶點取交集，得到肉蓯蓉治療便秘的潛在作用靶點共97個（表2）。

表2 肉蓯蓉活性成分治療便秘潛在靶點Table 2 Potential targets of the active ingredients of Cistanche deserticola in the treatment of constipation

2.3 “活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡構(gòu)建與分析

將篩選得到的肉蓯蓉治療便秘潛在活性成分和作用靶點的信息導入Cytoscape軟件，構(gòu)建“活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡（圖1）。該網(wǎng)絡共包含114個節(jié)點（17個化合物節(jié)點、97個靶點節(jié)點）和938條邊。網(wǎng)絡圖中的黃色矩形節(jié)點和綠色圓形節(jié)點分別代表肉蓯蓉的活性和治療便秘的作用靶點，邊代表活性成分和作用靶點間的聯(lián)系。從圖1可看出，肉蓯蓉的17個活性成分，通過KIT、IL2、SRC等97個靶點發(fā)揮治療便秘的作用。拓撲分析結(jié)果表明，該網(wǎng)絡中每個成分平均可與55.18個靶點相互作用，每個靶點平均可與9.67個成分相互作用。由此可以看出，肉蓯蓉作用同一靶點可對應于不同的活性成分，不同的靶點也可以對應相同的活性成分。

圖1 肉蓯蓉治療便秘“活性成分—作用靶點”網(wǎng)絡Fig.1 “Active components-targets”network of Cistanche deserticola in the treatment of constipation

2.4 PPI網(wǎng)絡構(gòu)建與分析

在String數(shù)據(jù)庫導入上述作用靶點蛋白，得到PPI網(wǎng)絡關(guān)系數(shù)據(jù)，并使用Cytoscape軟件對其進行可視化分析，繪制PPI網(wǎng)絡圖（圖2）。該網(wǎng)絡圖中共有87個節(jié)點，426個邊，其中節(jié)點表示蛋白，邊表示蛋白之間的關(guān)聯(lián)。在蛋白互作網(wǎng)絡中，度（Degree）值排名前五的蛋白包括MAPK1（37）、AKT1（34）、SRC（32）、MAPK8（30）和EGFR（28）。因此，推測這些蛋白可能是肉蓯蓉發(fā)揮藥效的重要作用靶點。

注：節(jié)點的大小和顏色表示度的值，節(jié)點由小變大，顏色由黃變紅對應的度值由小變大，邊的粗細表示綜合分數(shù)的值，邊越粗綜合分數(shù)值越大圖2 肉蓯蓉治療便秘潛在作用靶點之間的相互作用網(wǎng)絡Note：The size and the color of the node represent the values of the degree.The node from small to large，the color turns from yel?low to red，the corresponding degree value from small to large.The thickness of the side indicates the values of the combine score.The thicker the edge，the larger the combine score isFig.2 Network of interactions among potential targets of Cistanche deserticola in the treatment of constipation

2.5 生物信息學分析結(jié)果

GO富集分析共富集到1 741個GO條目，包括1 602個BP條目、29個CC條目和110個MF條目。應用R軟件對BP、CC、MF基因富集數(shù)排名前10的條目繪制條形圖（圖3）。其中，在BP層面上，肉蓯蓉對腺體發(fā)育、生殖結(jié)構(gòu)發(fā)育、生殖系統(tǒng)發(fā)育、氧化應激反應、對類固醇激素的應答等影響較大。在CC層面上，肉蓯蓉對細胞膜筏、膜微區(qū)、粘合斑、囊腔等影響較大。在MF層面上，肉蓯蓉對蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、內(nèi)肽酶活性、磷酸酶結(jié)合及蛋白磷酸酶結(jié)合等影響較大。

圖3 肉蓯蓉治療便秘潛在作用靶點GO富集分析Fig.3 Gene ontology enrichment analyses of potential targets of Cistanche deserticola in the treatment of constipation

將KEGG富集分析得到的74條通路按照涉及的靶點數(shù)目多少排序，繪制前15條通路的氣泡圖（圖4）。結(jié)果顯示，肉蓯蓉治療便秘的作用靶點主要通過PI3K-Akt信號通路、Ras信號通路、MAPK信號通路、FoxO信號通路、Focal adhesion信號通路等途徑發(fā)揮作用（圖4）。

圖4 肉蓯蓉治療便秘KEGG通路富集分析Fig.4 KEGG pathway enrichment of Cistanche deserticola for constipation

2.6 “結(jié)構(gòu)類型-活性成分-靶點-信號通路”網(wǎng)絡構(gòu)建與分析

利用Cytoscape軟件對前15條信號通路及其對應的作用靶點、活性成分及結(jié)構(gòu)類型進行可視化分析（圖5）。網(wǎng)絡圖中共有87個節(jié)點和722條邊，其中度值（Degree）≥2倍的中位數(shù)的化合物如花生四烯酸（arachidonate）、蘇齊內(nèi)酯（suchilactone）、毛蕊花糖苷（acteoside）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）等通過與HRAS、AKT1、IGF1R、SRC、RAF1等關(guān)鍵靶點結(jié)合，作用于肉蓯蓉治療便秘的重要信號通路。從圖5可以看出，肉蓯蓉的活性成分作用于多個靶點，不同通路之間可通過多個共有靶點相互影響，協(xié)同發(fā)揮治療便秘作用，體現(xiàn)了肉蓯蓉多成分、多靶點、多通路治療便秘的作用特點。

注：藍色三角形節(jié)點代表結(jié)構(gòu)類型；綠色菱形節(jié)點表示活性成分；粉色圓形節(jié)點表示潛在靶點；橙黃色箭頭表示通路；邊表示四者之間的相互作用圖5 肉蓯蓉治療便秘“結(jié)構(gòu)類型-活性成分-靶點-信號通路”網(wǎng)絡Blue triangle nodes represent structure types，green diamond nodes represent active components，pink circle nodes represent potential targets，yellow arrows represent pathways；edges represent interactions among themFig.5 Network of "structure types-active ingredients-targets-signal pathways" of Cistanche deserticola in treating constipation

2.7 分子對接結(jié)果

PPI網(wǎng)絡與“結(jié)構(gòu)類型-活性成分-靶點-通路”網(wǎng)絡篩選得到的前5個靶點均包含有AKT1與SRC，說明這兩個靶點為肉蓯蓉活性成分治療便秘的重要靶點。將AKT1、SRC靶點與其相應的化合物進行分子對接（表3）。一般認為結(jié)合的構(gòu)象越穩(wěn)定，結(jié)合能越低，靶點蛋白與化合物發(fā)生結(jié)合的可能性越大。分子對接結(jié)果顯示，與靶點AKT1結(jié)合較好的化合物有蘇齊內(nèi)酯、半乳糖醛酸，與靶點SRC結(jié)合較好的化合物有β-谷甾醇、蘇齊內(nèi)酯、（1R）-1-［［（2S，3R，11bS）-3-乙基-9，10-二甲氧基-2，3，4，6，7，11b-六氫-1H-吡啶并［2，1-a］異喹啉-2-基］甲基］-2，3，4，9-四氫-1H-吡啶并［3，4-b］吲哚-6-醇。選取與AKT1靶點和SRC靶點對接結(jié)果最好的化合物作圖（圖6）。

圖6 蘇齊內(nèi)酯與AKT1和β-谷甾醇與SRC的分子對接模式Fig.6 Molecular docking patterns of suchilactone with AKT1 and β-sitosterol with SRC

表3 肉蓯蓉活性成分與AKT1、SRC的分子對接結(jié)果Table 3 Molecular docking results of active components of Cistanche deserticola with AKT1 and SRC

3 討論

便秘是一種臨床常見的消化功能紊亂性疾病。中醫(yī)理論認為便秘多為飲食不當、情緒障礙、年老體虛、感受外邪導致的大腸傳導功能異常。與西醫(yī)相比，中醫(yī)藥因其副作用小，療效好且復發(fā)率低等特點，在治療便秘上具有明顯的優(yōu)勢。

中藥肉蓯蓉被譽為“沙漠人參”，是中醫(yī)臨床常用的補益類中藥［13］。李時珍曰∶“此物補而不峻，故有從容之號”。肉蓯蓉治療便秘具有作用緩和、便而不瀉的特點，長于虛性便秘的治療。臨床及動物實驗研究均表明，肉蓯蓉能有效改善便秘的癥狀［10，14-15］。本研究基于中藥數(shù)據(jù)庫、靶標預測技術(shù)、蛋白相互作用網(wǎng)絡、網(wǎng)絡分析平臺的網(wǎng)絡藥理學研究模式揭示了肉蓯蓉治療便秘的作用機制。

本研究以OB≥30%，DL≥0.18為條件，利用TCMSP平臺篩選出6種肉蓯蓉潛在活性成分。查閱文獻發(fā)現(xiàn)肉蓯蓉的主要活性成分為苯乙醇苷類化合物，其中松果菊苷、毛蕊花糖苷含量較高，且為肉蓯蓉的藥典指標性成分。高云佳等［16］研究發(fā)現(xiàn)肉蓯蓉中的總寡糖和半乳糖醇是其通便的藥效物質(zhì)。肉蓯蓉中所含的糖類成分經(jīng)分離純化分析后，具有通便作用的糖類活性成分包括葡萄糖、果糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖、甘露醇、半乳糖醛酸等［16-19］。因此，本文將文獻挖掘與整理獲取的肉蓯蓉活性成分與TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選出的共17個肉蓯蓉潛在活性成分一并納入研究。

“成分-靶點”網(wǎng)絡分析表明肉蓯蓉治療便秘具有多成分、多靶點的作用特點。PPI網(wǎng)絡分析結(jié)果顯示，MAPK1、AKT1、SRC、MAPK8和EGFR為肉蓯蓉治療便秘的核心靶點?！敖Y(jié)構(gòu)類型-活性成分-靶點-信號通路”網(wǎng)絡分析預測肉蓯蓉治療便秘的關(guān)鍵靶點可能為AKT1、SRC。AKT1蛋白是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，主要參與包括細胞凋亡、葡萄糖代謝等細胞過程［20］。孫宇等研究發(fā)現(xiàn)，降低慢傳輸型便秘大鼠的結(jié)腸組織中PI3K、AKTm?RNA及蛋白的表達可減輕其便秘癥狀［21］。SRC是一種酪氨酸蛋白激酶，激活SRC蛋白會導致PGE2釋放而抑制Na+/K+-ATPase，從而改善便秘［22］。分子對接結(jié)果也表明，肉蓯蓉中的大部分活性成分均能較好地與靶點結(jié)合，其中蘇齊內(nèi)酯（Suchilactone）與AKT1靶點結(jié)合效果最好，β-谷甾醇（β-sitosterol）與SRC靶點結(jié)合效果最好。

GO富集分析結(jié)果表明，肉蓯蓉治療便秘主要通過對腺體發(fā)育、生殖結(jié)構(gòu)發(fā)育、生殖系統(tǒng)發(fā)育、氧化應激反應及對類固醇激素的應答等多種生物過程。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，肉蓯蓉主要通過 PI3K-Akt、Ras、MAPK、FoxO、Focal adhesion等信號通路治療便秘。PI3K-Akt信號通路是細胞中重要的信號轉(zhuǎn)導通路，可影響其下游多種效應分子（如TSC1/2、mTOR、FoxO、Caspase-9等）的活化狀態(tài)，對細胞的增殖、凋亡起重要作用［23］。孫路強等研究顯示腸神經(jīng)膠質(zhì)細胞（EGCs）可以通過分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子來降低PI3K-AKT蛋白的表達，并抑制PI3K-AKT通路的激活，從而改善腸道傳輸功能［24］。MAPK信號通路以一種保守的三級激酶模式為基礎(chǔ)，參與細胞生長周期中的多種重要的生理/病理過程［25］。研究表明，慢性傳輸型便秘大鼠結(jié)腸組織中MAPKs表達水平與糞便含水量呈負相關(guān)［26］。上述研究結(jié)果表明PI3K-AKT、MAPK信號通路與便秘的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Ras蛋白處于眾多生長因子相關(guān)信號通路的上游［27］，可與黏著斑激酶（FAK）通過同多種效應蛋白作用，進而激活MAPK、PI3K-AKT等相關(guān)下游信號通路發(fā)揮效應［28-29］，這說明肉蓯蓉活性成分可能通過作用于Ras，F(xiàn)ocal adhesion信號通路，進而調(diào)節(jié)MAPK、PI3K-AKT等信號通路來治療便秘。

本研究應用網(wǎng)絡藥理學對肉蓯蓉治療便秘的潛在活性成分、作用靶點、生物通路等進行了系統(tǒng)研究和分析。結(jié)果顯示，肉蓯蓉中的蘇齊內(nèi)酯、β-谷甾醇等17個潛在活性成分通過AKT1、SRC等 97個靶點調(diào)控PI3K-AKT、MAPK、Ras、FoxO和Focal adhesion等74條信號通路發(fā)揮其治療便秘的作用。這充分顯示出肉蓯蓉通過一個復雜且高度動態(tài)的“成分-靶點-通路-疾病網(wǎng)絡，發(fā)揮其多成分、多靶點、多通路治療便秘的作用，為進一步深入研究肉蓯蓉通便作用機制提供了理論依據(jù)。