鐵線蓮屬植物ISSR分子標(biāo)記體系優(yōu)化及指紋圖譜的構(gòu)建

王鑫，鄭妍，劉志杰，張存石，劉冬云

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林與旅游學(xué)院，河北 保定 071000)

鐵線蓮屬(ClematisL. Sp. Pl.)植物約有300余種，花色豐富，花形多變，花期跨度長(zhǎng)，可從早春至深秋，花果均具有較高的觀賞性和園林應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)，藥用價(jià)值高，又具有較強(qiáng)的抗逆性和耐寒性[1-2]。中國(guó)鐵線蓮屬植物約147種，其中約98種為我國(guó)特有種，主要分布于華中和西南地區(qū)。河北省擁有豐富的野生鐵線蓮屬植物資源，其中不乏觀賞性狀和適應(yīng)性優(yōu)良的類型，但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)鐵線蓮的研究主要集中在藥理化學(xué)、無(wú)性繁殖、生理抗性等方面，對(duì)其種下分類的研究很少[3-6]。長(zhǎng)期以來(lái)，由于大面積栽培和人工選擇，鐵線蓮種下分類一直比較混亂，現(xiàn)采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù),建立鐵線蓮屬植物ISSR-PCR最佳反應(yīng)體系,以期為構(gòu)建鐵線蓮屬植物親緣關(guān)系及遺傳圖譜奠定基礎(chǔ)。

簡(jiǎn)單重復(fù)間序列 (Inter-simple sequence repeat,ISSR) 標(biāo)記技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好和多態(tài)性豐富等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于植物品種鑒定、基因作圖與定位、遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育等的研究[7]。和文志等建立了鐵線蓮ISSR-PCR的反應(yīng)體系，并且進(jìn)行了反應(yīng)體系的優(yōu)化，但只是建立鐵線蓮園藝品種的最優(yōu)體系，試驗(yàn)材料不完善，缺乏鐵線蓮野生種[8]。余偉軍、王楠等分別建立了鐵線蓮屬植物的ISSR最優(yōu)體系，但是在因素選擇方面比較單一，都只優(yōu)化模板DNA、Taq酶、Mg2+和dNTPs 4個(gè)單因素[9-10]。對(duì)于Master Mix用量、PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)等關(guān)鍵因素優(yōu)化還未見報(bào)道。

本試驗(yàn)先通過單因素試驗(yàn)優(yōu)化選取模板DNA含量、目標(biāo)引物濃度、Master Mix、循環(huán)數(shù)等關(guān)鍵因素，然后使用L9(34)正交設(shè)計(jì)對(duì)鐵線蓮ISSR-PCR反應(yīng)體系中的各因素進(jìn)行優(yōu)化，建立適宜鐵線蓮野生種的最優(yōu)ISSR-PCR反應(yīng)體系，為進(jìn)一步利用ISSR分子標(biāo)記進(jìn)行河北省野生鐵線蓮遺傳多樣性分析、種質(zhì)資源鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建等研究提供一定的理論基礎(chǔ)[11]。并利用多態(tài)性引物構(gòu)建了遺傳指紋圖譜，可以對(duì)16種野生鐵線蓮進(jìn)行有效的區(qū)分和鑒定。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為16個(gè)類群的野生鐵線蓮，均采自河北省野外不同地區(qū)，引種后種植于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)基地，供試材料見表1。

表1 供試鐵線蓮信息Table 1 The information of the tested Clematis

1.2 試驗(yàn)方法

采集16種鐵線蓮新鮮葉片，用70%酒精擦洗葉片表面，放于零下80 ℃冰箱保存。

1.2.1 基因組DNA的提取 本試驗(yàn)DNA的提取采用新型植物基因組DNA提取試劑盒(CW0531S，康為世紀(jì))，按照試劑盒說(shuō)明書提取16個(gè)鐵線蓮樣本的DNA，母液電泳圖條帶明亮清晰。以1 μL的ddH2O為空白對(duì)照，用Themro微量紫外分光光度計(jì)進(jìn)行DNA純度檢測(cè)，其純度(OD260/OD280)在1.6～2.0之間，說(shuō)明DNA雜質(zhì)少，純度高可用于后續(xù)反應(yīng)。將DNA母液濃度稀釋成40 ng/μL的工作液，1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)[12]。

1.2.2 目標(biāo)引物的確定 從加拿大哥倫比亞大學(xué)公布的100條ISSR通用引物中隨機(jī)挑選20條引物進(jìn)行初篩，引物序列見表2。

表2 ISSR引物序列信息Table 2 The information of ISSR primer sequence

由表2可知，選取卷萼鐵線蓮和褐毛鐵線蓮各2個(gè)DNA樣本作為模板，選出具有多態(tài)性的引物。根據(jù)公式:η=1- (1-1/2)n(n為樣品數(shù),η為有多態(tài)性引物的選中概率)，計(jì)算選中的有多態(tài)性引物的概率為93.8%。

參考和文志的方法，PCR反應(yīng)體系為25 μL，12.5 μL的2×Es Taq Master Mix PCR反應(yīng)液，2 μL模板DNA，2 μL引物，加入超純水使體系達(dá)到25 μL[8]。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s，退火(溫度取決于引物Tm值)1 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。PCR反應(yīng)在BIO-RAD基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳(1×TAE緩沖液，100 V，0.5 h)檢測(cè)，6×SuperStain染色，再在紫外透射儀下觀察結(jié)果，并記錄。

1.2.3 ISSR反應(yīng)體系單因素優(yōu)化 試驗(yàn)選用1.2.2中初篩出來(lái)能擴(kuò)增出清晰條帶的引物U845，ISSR-PCR反應(yīng)體系中模板DNA含量、目標(biāo)引物濃度、Master Mix、循環(huán)數(shù)各設(shè)定6個(gè)梯度，以單因素優(yōu)化法進(jìn)行4組試驗(yàn)，見表3。

表3 ISSR-PCR反應(yīng)體系的單因素優(yōu)化Table 3 Single factor optimization of ISSR-PCR reaction system

1.2.4 ISSR-PCR反應(yīng)體系正交優(yōu)化 在單因素反應(yīng)優(yōu)化的基礎(chǔ)上，參考董如何的方法設(shè)計(jì)L9(34)正交表，對(duì)模板DNA含量、目標(biāo)引物濃度、Master Mix、循環(huán)數(shù)進(jìn)行4因素3水平分析(表4)[11]。試驗(yàn)所用引物、Master Mix和2 000 bp DNA marker均購(gòu)自北京天根生物有限公司。

表4 ISSR-PCR反應(yīng)體系的正交優(yōu)化Table 4 Orthogonal optimization for ISSR-PCR reaction system

1.2.5 ISSR-PCR正交反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果評(píng)價(jià) 依照ISSR-PCR擴(kuò)增條帶的數(shù)目、亮度、清晰度及特異性分別對(duì)9個(gè)組合評(píng)分，條帶多、亮、無(wú)雜帶拖帶的得分最高，為6分，條帶少、弱、拖帶多的得1分，按照評(píng)分結(jié)果獲得平均分及極差，從而確定最優(yōu)的各因素的水平及最優(yōu)體系，并明確各因素對(duì)體系的影響大小。

1.2.6 ISSR-PCR反應(yīng)體系正交優(yōu)化結(jié)果驗(yàn)證 使用優(yōu)化的鐵線蓮ISSR-PCR反應(yīng)體系，利用初篩出來(lái)的U834、U840、U844、U899這4條引物，隨機(jī)對(duì)黃花鐵線蓮、芹葉鐵線蓮、褐毛鐵線蓮和鈍萼鐵線蓮4份鐵線蓮樣本進(jìn)行擴(kuò)增。

1.2.7 引物篩選及退火溫度的優(yōu)化 嚴(yán)格來(lái)說(shuō)，退火溫度并不一定等于其Tm值，而在Tm值附近波動(dòng)，參考不同引物的Tm值，利用梯度PCR確定該引物的最佳退火溫度[13]。以引物U815、U843、U840、U811(Tm=41.9 ℃、41.8 ℃、41.8 ℃、41.9 ℃)為例，設(shè)定退火溫度梯度分別為45.7 ℃、47.7 ℃、50.4 ℃、51.8 ℃、54.0 ℃、55.4 ℃。以大葉鐵線蓮DNA為模板，最終確定引物各自的退火溫度。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA模板濃度優(yōu)化結(jié)果

本試驗(yàn)中，設(shè)置6個(gè)模板梯度，不同DNA濃度對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果，見圖1。

注：1～6 DNA濃度分別為10、20、30、40、50、60 ng。

由圖1可知，當(dāng)模板濃度過高或過低時(shí)，擴(kuò)增得到的條帶數(shù)較少，且個(gè)別條帶顏色較淡。當(dāng)模板濃度處于20～40 ng時(shí)，擴(kuò)增的條帶清晰且明亮。

2.2 目標(biāo)引物濃度優(yōu)化結(jié)果

不同引物濃度對(duì)PCR反應(yīng)影響的結(jié)果，見圖2。

注：1～6引物濃度分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 μmol/L。

由圖2可知，泳道1條帶最暗淡且不清晰，引物濃度在5～ 7 μmol/L之間時(shí)，能擴(kuò)增出較為清楚的條帶。當(dāng)引物濃度大于7 μmol/L時(shí)，出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，且引物濃度越大，拖尾越為嚴(yán)重，不便于統(tǒng)計(jì)條帶。

2.3 Master Mix體系用量?jī)?yōu)化結(jié)果

Master Mix具有穩(wěn)定性好、靈敏度高、快速簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[10]。Master Mix用量 ISSR-PCR反應(yīng)體系的影響，見圖3。

注：1～6 Master Mix用量分別為9、10、11、12、13、14 μL。

由圖3可知，隨Master Mix加入量增加，擴(kuò)增條帶變亮。當(dāng)Master Mix加入量小于11 μL時(shí)，擴(kuò)增條帶模糊且數(shù)量較少。當(dāng)加入量在12～14 μL時(shí)擴(kuò)增條帶變多且穩(wěn)定清晰?？紤]節(jié)約成本，12 μL為Master Mix最佳用量。

2.4 ISSR-PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)優(yōu)化結(jié)果

PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)對(duì)擴(kuò)增影響的結(jié)果，見圖4。

注：1～6 PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)分別為25、30、35、40、45、50。

由圖4可知，泳道1和泳道6無(wú)擴(kuò)增條帶產(chǎn)生，泳道2條帶彌散有拖尾現(xiàn)象。35、40和45個(gè)循環(huán)數(shù)能在PCR反應(yīng)中擴(kuò)增出條帶，但35和45個(gè)循環(huán)擴(kuò)增出的條帶過淺和過亮，不能將條帶很好的區(qū)分開，當(dāng)PCR循環(huán)數(shù)為40時(shí)，條帶清晰且穩(wěn)定，故PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)的最佳值為40個(gè)循環(huán)。

2.5 ISSR-PCR反應(yīng)體系的正交優(yōu)化

采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)鐵線蓮ISSR-PCR正交優(yōu)化擴(kuò)增產(chǎn)物，見圖5。

圖5 ISSR-PCR反應(yīng)體系的正交優(yōu)化Figure 5 Orthogonal optimization of ISSR-PCR reaction system

由圖5可知，在9組不同組合中，組合1，4，9擴(kuò)增條帶極少且條帶較暗；組合6擴(kuò)增條帶彌散不清晰；組合2，3，5，7，8擴(kuò)增條帶清晰且明亮，其中組合2擴(kuò)增條帶效果最好。參照張麗的方法，依據(jù)擴(kuò)增條帶的清晰度、亮度、擴(kuò)增條帶的多少等因素進(jìn)行評(píng)分，條帶多、亮、無(wú)雜帶拖帶的得分最高，為6分，條帶少、弱、拖帶多的得1分，3次重復(fù)評(píng)分結(jié)果，見表5、表6、表7。

表5 ISSR-PCR擴(kuò)增評(píng)分結(jié)果Table 5 The score results of ISSR-PCR reaction

表6 不同試驗(yàn)因子極差分析表Table 6 Range analysis table for different text factors

表7 ISSR-PCR正交試驗(yàn)方差分析Table 7 Orthogonal test variance analysis of ISSR-PCR

用SPSS 22.0對(duì)評(píng)分結(jié)果進(jìn)行分析，由方差分析結(jié)果可知(表5)，模板DNA和引物濃度對(duì)鐵線蓮ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)存在顯著性影響(P<0.05)。計(jì)算各因子在4個(gè)試驗(yàn)水平的極差值(R值)。R值越大，說(shuō)明此因子對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增的影響越大，R值從大到小依次為：引物>模板DNA>Master Mix>循環(huán)數(shù)(表6)。根據(jù)F值可知，各因子濃度水平對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)體系體系的影響從大到小依次為：引物>模板DNA>Master Mix>循環(huán)數(shù)(表7)。因此，正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果與極差分析結(jié)果一致，說(shuō)明此結(jié)果較為可靠。

δ值的大小可以確定對(duì)應(yīng)因素水平組合。由表6可知，δ31>δ11>δ21、δ22>δ31>δ11、δ33>δ13>δ23、δ24>δ34>δ14，因此組合為A3B2C3D2(ABCD表示4個(gè)因素，該組合的下標(biāo)表示該因素所在的水平)得到ISSR-PCR擴(kuò)增的最優(yōu)結(jié)果。此時(shí)反應(yīng)體系為模板DNA用量40 ng/25 μL，引物濃度6 μmol·L-1，Master Mix用量14 μL/25 μL，循環(huán)數(shù)40個(gè)。

2.6 ISSR-PCR反應(yīng)體系的驗(yàn)證

使用優(yōu)化的鐵線蓮ISSR-PCR反應(yīng)體系，隨機(jī)挑選U834、U840、U844、U899這4條引物，對(duì)4份鐵線蓮樣本進(jìn)行擴(kuò)增，1～4號(hào)樣本分別為黃花鐵線蓮、褐毛鐵線蓮、芹葉鐵線蓮、鈍萼鐵線蓮。結(jié)果見圖6。

注：M是DL 2 000 DNA Ladder；1是黃花鐵線蓮；2是芹葉鐵線蓮；3是褐毛鐵線蓮；4是鈍萼鐵線蓮。

由圖6可知，不同的引物在不同鐵線蓮樣本中均能擴(kuò)增出清晰、明亮的條帶，且不同種擴(kuò)增出的條帶間，均存在多態(tài)性條帶。因此，本研究所建立的鐵線蓮ISSR-PCR反應(yīng)體系是穩(wěn)定、可靠的，適用于后續(xù)鐵線蓮的ISSR分析。

2.7 ISSR引物篩選及多態(tài)性分析

ISSR引物篩選及多態(tài)性分析結(jié)果見圖7、表8、圖8。

圖7 引物U815、U843、U840、U811在不同退火梯度下的篩選結(jié)果

表8 用于16種鐵線蓮基因組DNA ISSR-PCR反應(yīng)的引物信息及多態(tài)性分析Table 8 Primers information and polymorphism used for ISSR-PCR reaction of genomic DNA from 16 plants of Clematis

圖8 引物U824的PCR擴(kuò)增電泳圖譜

鐵線蓮所用引物參考加拿大哥倫比亞大學(xué)(UBC)公布的第9套ISSR引物100條序列(UBC-801～UBC-900)，以鐵線蓮基因組DNA為模板，部分引物不同退火梯度下篩選結(jié)果，見圖7。最終篩選出12條能擴(kuò)增出清晰條帶的引物，并確定各自的退火溫度。篩選出的12條引物可擴(kuò)增出104條明亮，無(wú)拖帶，重復(fù)高的譜帶。其中共擴(kuò)增出多態(tài)性條帶104條，其中特異性條帶104條。每個(gè)引物平均擴(kuò)增出8.7個(gè)位點(diǎn)，特異性位點(diǎn)為8.7個(gè)，多態(tài)性百分比為100%(表8)。這12條引物可擴(kuò)增出6～12條數(shù)量不等的條帶。擴(kuò)增條帶片段大小為200～2 000 bp。其中，引物U824擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶最多，為12條(圖8)。引物U836和引物U844擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶數(shù)最少，為6條。通過ISSR-PCR擴(kuò)增體系的12條引物擴(kuò)增的DNA片段的分子量大部分在200～2 000 bp之間，部分超過2 000 bp。

2.8 16個(gè)野生鐵線蓮的ISSR指紋圖譜構(gòu)建

利用多態(tài)性高、條帶清晰的ISSR引物UBC815、UBC824和UBC845構(gòu)建16個(gè)野生鐵線蓮的數(shù)字指紋圖譜(表9) , 該指紋圖譜可以有效地對(duì)這些鐵線蓮野生種進(jìn)行區(qū)分、鑒定[14]。

表9 構(gòu)建16種野生鐵線蓮的數(shù)字指紋圖譜Table 9 Constructed digital fingerprint of 16 Clematis

3 討論與結(jié)論

ISSR分子標(biāo)記以PCR反應(yīng)為基礎(chǔ)，其擴(kuò)增效果受反應(yīng)體系中各個(gè)因素的影響，前人先后對(duì)金蓮花(TrolliuschinensisBunge)、楓香(LiquidambarformosanaHance)、桑樹(MorusL.)等園林觀賞花卉及樹木的ISSR-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化[15-17]。結(jié)果顯示，不同作物的最優(yōu)ISSR-PCR反應(yīng)體系和適用的引物均不同。經(jīng)優(yōu)化后的反應(yīng)體系能夠擴(kuò)增出多態(tài)性豐富且清晰度高的條帶。

作為正交試驗(yàn)的基本工具，正交表可以確定因子的主次順序，利用方差分析對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析各因子對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)的影響程度，進(jìn)而找出優(yōu)化條件和最優(yōu)組合來(lái)實(shí)現(xiàn)試驗(yàn)?zāi)康腫11]。本研究先用單因素試驗(yàn)確定各影響因子的適宜濃度范圍，在此基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，以確定適合鐵線蓮的最優(yōu)ISSR-PCR反應(yīng)體系。對(duì)于不同的植物材料，ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系所用的DNA模板量、引物濃度、Master Mix用量及擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)數(shù)有所不同，各因子濃度大小及用量的水平變化對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)體系影響大小也各不相同。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，引物濃度對(duì)PCR擴(kuò)增條帶影響最大，DNA模板量和Master Mix用量次之，擴(kuò)增循環(huán)數(shù)對(duì)PCR擴(kuò)增條帶影響最小。

本試驗(yàn)將ISSR分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于鐵線蓮上，建立了適用于鐵線蓮的ISSR-PCR反應(yīng)體系。結(jié)果表明，適用于鐵線蓮的最優(yōu)反應(yīng)體系為模板DNA用量40 ng，引物濃度6 μmol/L，Master Mix用量14 μL，循環(huán)數(shù)40個(gè)。并且利用最優(yōu)體系構(gòu)建了16種野生鐵線蓮的遺傳指紋圖譜。對(duì)于種間區(qū)分以及鑒定都有重大意義。

本試驗(yàn)將DNA模板量、引物濃度、反應(yīng)循環(huán)數(shù)和Master Mix的用量4種單因素作為體系優(yōu)化的主體，并且對(duì)于4種因素的最佳配比及組合也有了明確的結(jié)果，該反應(yīng)體系的建立為鐵線蓮遺傳多樣性研究、DNA指紋圖譜建立及分子標(biāo)記遺傳育種研究提供了一定的理論基礎(chǔ)。