禽白血病的診斷與防控措施

李若彤

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 泰安 271000）

在J亞群白血病出現(xiàn)之前，禽白血病就已存在于我國(guó)。從1991年英國(guó)首先報(bào)道J亞群禽白血病病毒（ALV-J）引起新型白血病之后[1]，此病引起了全球的重視。新發(fā)現(xiàn)的ALV-J在1997、1998年對(duì)整個(gè)養(yǎng)雞業(yè)特別是白羽肉雞養(yǎng)殖業(yè)形成了毀滅性的打擊，全球稱那兩年為“禽白血病災(zāi)難年”。我國(guó)在1999年率先鑒定出ALV-J，此后在多個(gè)省份相繼發(fā)現(xiàn)，給全國(guó)養(yǎng)殖業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失[2，3-4]。通過基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，中國(guó)的ALV與美國(guó)的ALV-J有一個(gè)共同的分子標(biāo)志，由此提出了該病毒可能是從美國(guó)引種的過程中傳到了我國(guó)的觀點(diǎn)[5]。為了進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)進(jìn)口雞的檢疫，我國(guó)于2009年制定了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《禽白血病診斷技術(shù)》，從而啟動(dòng)了我國(guó)對(duì)該病的檢疫。

1 病原

禽白血病是由禽白血病/肉瘤病毒群中的病毒引起的禽腫瘤性疾病的統(tǒng)稱，該病毒是雞的一種反轉(zhuǎn)錄病毒，由于其基因組可以整合到宿主雞或鳥類的基因組上，因此是診斷和檢測(cè)的難點(diǎn)。目前發(fā)現(xiàn)ALV共有A~K 11個(gè)亞群，可自然感染雞群的ALV僅限于A、B、C、D、E、J和K七個(gè)亞群，其中K亞群是在中國(guó)實(shí)施禽白血病的凈化過程中從地方本土雞群發(fā)現(xiàn)的一種中國(guó)土雞很早就感染的固有亞群，11個(gè)亞群中以1988年新出現(xiàn)的J亞群致病力最強(qiáng)、傳播性最強(qiáng)，對(duì)我國(guó)各類雞群的危害也是最嚴(yán)重的[6]，而K亞群致病力最弱。J亞群對(duì)肉雞感染最為嚴(yán)重和典型，A亞群對(duì)蛋雞感染最為普遍，K亞群很大一部分易感對(duì)象是地方品種黃雞或原種土雞。禽白血病毒的基因組比較小，長(zhǎng)度7～8 kb，其基因組結(jié)構(gòu)與人的艾滋病病毒非常相似。每個(gè)基因組分子包含了三個(gè)主要編碼基因，即聚合酶基因（pol）、衣殼蛋白基因（gag）、囊膜蛋白基因（env）。其中g(shù)ag基因非常保守[7]，它編碼了p27蛋白，該蛋白存在于所有的亞群中，在內(nèi)源性和外源性的白血病病毒之間十分保守且高度一致，因此由該蛋白制成的用于檢測(cè)禽白血病毒p27抗原的試劑盒和膠體金試紙條，不能區(qū)分是內(nèi)源性病毒表達(dá)還是外源性病毒表達(dá)，也無法鑒定是什么亞群。而env基因表達(dá)的gp85蛋白，是一種囊膜蛋白，它主要與病毒識(shí)別宿主細(xì)胞的特異性以及病毒的中和反應(yīng)有關(guān)，能夠用來鑒定不同的亞群。

白血病病毒還存在一些較特殊的情況，即重組的白血病病毒和復(fù)制缺陷型的白血病病毒，其中復(fù)制缺陷型的白血病病毒是急性腫瘤的一個(gè)重要組成部分，病毒的基因組一段完整的基因或某一段基因或一大段連續(xù)的基因能被雞的部分腫瘤基因取代；不同亞群之間或者內(nèi)源性與外源性白血病病毒之間一部分基因片段發(fā)生了重組從而形成了重組的白血病病毒。

2 流行病學(xué)

雞是已分離到的所有ALV的天然宿主，不同品種和品系的雞均可感染，但抵抗力不同，其中以白羽肉雞發(fā)病率最高，同時(shí)也可感染雞、野雞、珍珠雞、鵪鶉、火雞等。

對(duì)禽白血病傳播途徑的研究是防控該病的關(guān)鍵，傳播途徑包括：①感染母雞及其所產(chǎn)的蛋，這是最為典型的，也是最基本最直接的傳播途徑；②感染公雞及其精液，引起水平或垂直傳播；③育雛中的水平傳播，尤其是J亞群禽白血病病毒，不容小覷。王桂枝等實(shí)驗(yàn)表明陽(yáng)性雞與陰性雞直接接觸混合飼養(yǎng)時(shí)，感染ALV-J的比例高達(dá)63.33%[8]；④使用被外源病毒污染的活疫苗。2017年前報(bào)道的關(guān)于疫苗污染白血病病毒主要屬于A亞群，2017年在我國(guó)廣西發(fā)現(xiàn)疫苗污染J亞群白血病病毒的案例[9]，之后在尼日利亞也相繼發(fā)現(xiàn)。ALV-A的污染通常由SPF蛋質(zhì)量不過關(guān)引起，但是ALV-J致病力非常強(qiáng)，感染SPF雞群后可能導(dǎo)致全群發(fā)病而淘汰，污染造成的后果很嚴(yán)重；⑤野鳥等生物媒介的傳播。哈爾濱獸醫(yī)研究所從300份野鳥樣品中擴(kuò)增ALV亞群的ENV基因和UTR，只分離到ALV-A，未分離到ALV-B和ALV-J[10]；⑥使用注射器造成的物理性傳播。該途徑比較特殊，通常是一些特定的急性腫瘤感染引起，主要是復(fù)制缺陷型的白血病病毒[11]。

3 臨床癥狀及病理變化

3.1 臨床癥狀

ALV不僅能誘發(fā)免疫抑制和生長(zhǎng)遲緩[12]，還能誘發(fā)相當(dāng)高比例的感染雞發(fā)生各種不同表現(xiàn)形式的腫瘤。雞感染ALV后，多數(shù)情況下表現(xiàn)出一些非特異性癥狀，如精神沉郁、食欲減退、消瘦、腹瀉、脫水等。成紅細(xì)胞性白血病患雞前期表現(xiàn)嗜睡、雞冠蒼白，后期表現(xiàn)為下痢，部分毛囊出血。發(fā)生淋巴細(xì)胞性白血病時(shí)，表現(xiàn)為雞冠蒼白皺縮，偶間腹部膨大和雞冠發(fā)紺。骨髓細(xì)胞瘤病表現(xiàn)頭、胸部和腿部異常突起，髓細(xì)胞瘤發(fā)生在眼眶時(shí)會(huì)導(dǎo)致出血或瞎眼，在皮膚上還會(huì)出現(xiàn)血泡樣的血管瘤；受精卵和孵化率降低，蛋雞產(chǎn)軟殼蛋、薄殼蛋，公雞感染后其精液數(shù)量不變但活力下降。

3.2 病理變化

禽白血病引起的腫瘤多種多樣，肝、脾和法氏囊肉眼可見有腫瘤，大小不一，組織學(xué)觀察多為灶性和中心性，主要由淋巴樣瘤細(xì)胞構(gòu)成，胞質(zhì)內(nèi)富含大量的RNA，經(jīng)甲基綠哌咯嚀染色呈紅色。在各種年齡雞的皮膚和內(nèi)臟器官中大多可見血管瘤，充滿血液的腔隙內(nèi)排列著內(nèi)皮細(xì)胞或其它細(xì)胞。在肝脾腫大破裂的病例里，可以看出ALV-J與REV共感染的病理現(xiàn)象[13]。

淋巴細(xì)胞性白血病表現(xiàn)為肝臟彌漫性腫大，表面有大小不一的結(jié)節(jié)樣腫瘤；脾臟腫大，表面有灰白色腫瘤結(jié)節(jié)；此外，心臟、腎臟、肺、骨髓和腸系膜也有腫瘤；淋巴肉瘤表面光滑，質(zhì)地柔軟，切面呈灰白色或乳白色。成紅細(xì)胞性白血病較少見，肉眼觀察到脾、肝、腎呈彌漫性腫大，櫻桃紅色，部分切面可見灰白色腫瘤結(jié)節(jié)；肌肉、內(nèi)臟、皮下可見點(diǎn)狀出血。成髓細(xì)胞性白血病很少自然發(fā)生，一般只發(fā)生于成年雞，毛囊因血液凝固不良而出血、貧血、消瘦，肝臟偶爾見腫瘤結(jié)節(jié)。骨髓細(xì)胞瘤病自然病例極少見，髓細(xì)胞瘤常發(fā)生于胸骨表面、肋骨軟骨結(jié)合處，腫瘤呈結(jié)節(jié)狀。

4 診斷技術(shù)

4.1 病原檢測(cè)

4.1.1 抗原檢測(cè) 應(yīng)用ELISA、膠體金或者磁微?；瘜W(xué)發(fā)光等方法可以檢測(cè)不同樣品中的禽白血病p27抗原，適用檢測(cè)胎糞、蛋清、肛門拭子、精液、細(xì)胞培養(yǎng)物等樣品。種雞凈化過程中常通過采集出殼雛雞的胎糞或種雞產(chǎn)蛋期的蛋清鑒定種雞是否感染ALV?？乖瓩z測(cè)方法簡(jiǎn)單，耗時(shí)較短，適用于大批量檢測(cè)，但缺點(diǎn)是不能區(qū)別內(nèi)源性和外源性抗原。

4.1.2 病毒分離 將不同樣品接種細(xì)胞后經(jīng)過一定時(shí)間或傳代培養(yǎng)后檢測(cè)病毒，其適用樣品是抗凝血、蛋清、精液、臨床組織研磨過濾液等。它是國(guó)際金標(biāo)準(zhǔn)，DF-1細(xì)胞和CEF細(xì)胞均可適于白血病病毒的培養(yǎng)，但是從控制和鑒別內(nèi)外源的角度來說，DF-1細(xì)胞是其中最好的。由于DF-1細(xì)胞只適用于外源性ALV的生長(zhǎng)，接種樣品之后的細(xì)胞上清若用p27抗原檢測(cè)為陽(yáng)性，即可判定是有外源性白血病病毒感染。病毒分離方法特異性靈敏度均較高，結(jié)果比較準(zhǔn)確，可分離和保存流行株并鑒定其亞群，如有需要還可進(jìn)一步做致病性試驗(yàn)。但該方法成本高、周期長(zhǎng)、對(duì)技術(shù)要求高，很多養(yǎng)殖場(chǎng)不易掌握或操作不穩(wěn)定，需要安排專門人員長(zhǎng)期訓(xùn)練。在病毒樣品接種時(shí)，細(xì)胞密度過大會(huì)影響病毒增殖，因此需要注意這一點(diǎn)；抗凝劑應(yīng)選擇肝素鈉或肝素鋰，其中肝素鋰對(duì)病毒的保護(hù)率最高；病毒樣品在細(xì)胞上的維持時(shí)間越長(zhǎng)越好。

4.1.3 核酸檢測(cè) 經(jīng)過特定引物擴(kuò)增后對(duì)片段進(jìn)行測(cè)序并與各參考毒株進(jìn)行比對(duì)以確定感染亞群，所有可用于直接提取高質(zhì)量核酸的樣品或細(xì)胞培養(yǎng)物均可。核酸檢測(cè)方法簡(jiǎn)單，耗時(shí)較短，可適用于大批量檢測(cè)，缺點(diǎn)是不能區(qū)別內(nèi)源性和外源性ALV核酸，容易引起誤判。該方法常被用于分離病毒后的測(cè)序與病毒亞群確定；個(gè)別疑似陽(yáng)性樣品的初篩以及科學(xué)研究中陽(yáng)性樣品的定量分析，但此方法不可以作為確診的唯一判定依據(jù)。

4.2 抗體檢測(cè)

4.2.1 ELISA檢測(cè) 應(yīng)用商品化抗體試劑盒或自包被試劑盒檢測(cè)J亞型或者其它亞型抗體，需要注意的是不同日齡不同品系雞的血清檢測(cè)結(jié)果差異較大。該方法操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)較短，可用于批量檢測(cè)，但不能確定雞群是否處于感染狀態(tài)，有些內(nèi)源性蛋白的表達(dá)也可以誘導(dǎo)產(chǎn)生非感染抗體。它常被用于對(duì)現(xiàn)行SPF雞潔凈度標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估、現(xiàn)行獸藥典疫苗外源病毒檢測(cè)與評(píng)估、對(duì)雞群感染狀態(tài)的總體評(píng)估與大體判定，以及在進(jìn)出口檢疫中作為部分的參考指標(biāo)。

4.2.2 IFA檢測(cè)（免疫熒光檢測(cè)） 應(yīng)用特定亞群病毒接種細(xì)胞后進(jìn)行固定并作為檢測(cè)抗原來識(shí)別血清中的特異性抗體，可直接應(yīng)用特定亞群病毒進(jìn)行檢測(cè)，但操作比較復(fù)雜，需要特定毒株和實(shí)驗(yàn)條件。該方法常被應(yīng)用于復(fù)核不符合臨床表現(xiàn)的疑似陽(yáng)性血清、測(cè)定特定蛋白抗體以及禽白血病血清中和性抗體及其效價(jià)。秦愛建等用ALV-J感染雞胚成纖維細(xì)胞后，用IFA方法檢測(cè)出陽(yáng)性細(xì)胞，表現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，在測(cè)定最小病毒感染量上取得了良好的效果；雞的血清與雞源細(xì)胞會(huì)有非特異性反應(yīng)[14]。應(yīng)用于對(duì)不符合臨床表現(xiàn)的疑似陽(yáng)性血清進(jìn)行復(fù)核；科學(xué)研究過程中對(duì)特定蛋白抗體等進(jìn)行測(cè)定；禽白血病血清中和性抗體及其效價(jià)的測(cè)定。

5 綜合防控措施

禽白血病凈化評(píng)估中常見的硬件設(shè)施問題：未認(rèn)真落實(shí)雨污分流；入門消毒設(shè)計(jì)形同虛設(shè)；凈道和污道存在完全或部分交叉；洗澡消毒設(shè)施不夠科學(xué)和人性化；病死動(dòng)物剖檢設(shè)施不符合生物安全要求；病死動(dòng)物和糞污無害化處理設(shè)施缺失或不符合生物安全要求。針對(duì)這些問題要全方位改善。另外，要完善健康巡查制度、員工培訓(xùn)制度、投入品管理制度、疾病監(jiān)測(cè)凈化制度、病死雞無害化處理制度以及生產(chǎn)區(qū)人員進(jìn)出消毒及管理制度等。

對(duì)地方品系和黃羽肉雞應(yīng)特別注意生物安全，要高度重視在孵化期間使用種雞群、核心群專用孵化箱，即使在特定條件下沒有辦法做到專用，也要盡可能確保不同批次孵化的雞群間隔一段時(shí)間，以保證消毒徹底，避免產(chǎn)生水平傳播；同時(shí)，要在實(shí)施凈化的過程中避免邊凈化邊污染的惡性循環(huán)，若環(huán)境已被高度污染，應(yīng)新建一個(gè)專門的育種場(chǎng)將雞群遷移至干凈的環(huán)境中。對(duì)于陽(yáng)性率低、飼養(yǎng)環(huán)境非常潔凈的雞群，應(yīng)把其中檢測(cè)為陽(yáng)性的雞盡快移走，避免健康雞與其長(zhǎng)時(shí)間接觸而感染。

實(shí)施禽白血病凈化過程中配套的生物安全措施：一是配置凈化專用的孵化廳和孵化器，對(duì)于實(shí)施凈化的種源雞群要保證孵化過程中的潔凈度，避免與祖代或者父母代商品雞進(jìn)行交叉孵化；二是廣泛應(yīng)用紙袋和紙盒孵化，同一家系的母雞放在同一個(gè)紙袋或紙盒里孵化，實(shí)現(xiàn)單家系入孵和出孵。

6 結(jié)語(yǔ)

禽白血病作為國(guó)家中長(zhǎng)期動(dòng)物疫病規(guī)劃的三大禽病之一，現(xiàn)階段仍缺乏針對(duì)性疫苗和特效藥物，預(yù)防該病的主要方式就是建立凈化無禽白血病的雞群[15-18]。凈化措施通常采用國(guó)家制定的四大檢測(cè)節(jié)點(diǎn)和三種檢測(cè)手段相結(jié)合，即選擇出雛期、育雛結(jié)束、初產(chǎn)時(shí)和留種前為主要凈化檢測(cè)節(jié)點(diǎn)，采用胎糞禽白血病抗原檢測(cè)、蛋清禽白血病抗原檢測(cè)和病毒分離鑒定作為檢測(cè)技術(shù)。此外，要加強(qiáng)對(duì)雞群的日常管理，增強(qiáng)雞群的免疫力，從養(yǎng)、防、檢三方面貫徹落實(shí)，保障家禽業(yè)健康發(fā)展。