原位酶譜技術(shù)在土壤酶活性研究中的應(yīng)用進(jìn)展

郭 澍,許佳揚(yáng),魏曉夢(mèng),張煦博,杜劍卿, 4,吳伊波,崔驍勇,4,*

1 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,北京 100049 2 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院,北京 100190 3 中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過(guò)程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 長(zhǎng)沙 410125 4 中國(guó)科學(xué)院燕山地球關(guān)鍵帶與地表通量觀測(cè)研究站, 北京 101408 5 寧波大學(xué)土木與環(huán)境工程學(xué)院, 寧波 315211

土壤酶是陸地生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化及元素循環(huán)的重要參與者與驅(qū)動(dòng)者[1—2]。由于土壤酶對(duì)土壤理化性質(zhì)及環(huán)境因子的變化有較高的敏感性,因此其種類(lèi)多樣性及活性不僅可以反映土壤的健康狀況和肥力水平,也是表征土壤微環(huán)境中植物、微生物的狀態(tài)和變化的敏感指標(biāo)[3—5]。

關(guān)于土壤酶活性的研究已經(jīng)有較長(zhǎng)的歷史,傳統(tǒng)方法中最常用的是熒光法和分光光度法。這些方法都需要破壞性取樣,存在樣品運(yùn)輸和保存困難、前處理過(guò)程繁瑣、測(cè)定周期長(zhǎng)等缺點(diǎn),導(dǎo)致酶活性測(cè)定結(jié)果的精度低、誤差大[6]。所以要想對(duì)土壤酶活性時(shí)空分布進(jìn)行精細(xì)化研究,就亟需一種先進(jìn)的可視化技術(shù)[7]。而土壤原位酶譜技術(shù)是對(duì)土壤酶活性及其二維分布進(jìn)行原位可視化和定量的一種新研究技術(shù),發(fā)端于20世紀(jì)60年代生物學(xué)和醫(yī)學(xué),在近些年引入土壤生態(tài)學(xué)后即引起了廣泛關(guān)注,主要應(yīng)用于植物根際土壤酶活性研究,以揭示植物-植物及植物-土壤微生物的相互作用,探究變化環(huán)境下土壤質(zhì)量變化(如干擾、脅迫及土壤恢復(fù)等)以及土壤微生物群落組成、活性和功能的改變[6]。

圖1 土壤原位酶譜技術(shù)及其在相關(guān)領(lǐng)域研究中的應(yīng)用現(xiàn)狀Fig.1 In situ soil zymography and its application in relative fields

為了直觀展示原位酶譜技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)狀,在Web of Science中以“Rhizosphere”及“Insitusoil zymography”為關(guān)鍵詞檢索,剔除不相關(guān)文獻(xiàn)后篩選出土壤原位酶譜技術(shù)及其應(yīng)用的有關(guān)36篇文獻(xiàn)并歸類(lèi),結(jié)果表明土壤原位酶譜技術(shù)已經(jīng)從早期植物根際的酶活性探索研究,逐漸應(yīng)用到土壤養(yǎng)分循環(huán)、生態(tài)健康檢測(cè)、土壤結(jié)構(gòu)性改良及土壤動(dòng)物活動(dòng)等相關(guān)研究領(lǐng)域(圖1)。但其還存在:(1)操作方法混亂；(2)應(yīng)用領(lǐng)域較為分散,缺乏系統(tǒng)性梳理難以借鑒等問(wèn)題。這些問(wèn)題共同制約了土壤原位酶譜技術(shù)向多學(xué)科領(lǐng)域的拓展。鑒于此,本文概述了土壤原位酶譜技術(shù)的發(fā)展過(guò)程和優(yōu)缺點(diǎn),梳理了其在植物根際養(yǎng)分循環(huán)、土壤生態(tài)健康檢測(cè)、土壤動(dòng)物及土壤孔隙等領(lǐng)域研究中的應(yīng)用現(xiàn)狀,結(jié)合其在各領(lǐng)域研究應(yīng)用中的優(yōu)缺點(diǎn),分析了土壤原位酶譜技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì),以期為推進(jìn)土壤酶學(xué)研究的發(fā)展以及生態(tài)學(xué)微觀和宏觀研究的整合提供新的思路。

1 土壤原位酶譜技術(shù)的優(yōu)化

土壤原位酶譜技術(shù)的操作方法為通過(guò)在土壤樣品表面貼附一張被待測(cè)酶的特異性熒光標(biāo)記底物的飽和溶液浸泡過(guò)的膜,使底物與土壤酶接觸,反應(yīng)后生成熒光產(chǎn)物,分析紫外線(xiàn)照射下的熒光圖像就可以得到土壤表面該酶的活性及其空間分布的信息[8],目前應(yīng)用較多的熒光產(chǎn)物有4-甲基傘形酮(4-methylumbelliferyl, MUF)和7-氨基- 4-甲基香豆素(7-amido- 4-methylcoumarin, AMC)。隨著土壤原位酶譜的應(yīng)用不斷擴(kuò)展,該技術(shù)本身也在不斷優(yōu)化。

1.1 底物載體的選擇

原位酶譜技術(shù)的操作理念最早源于免疫印跡(Western blot)——一種將細(xì)胞或組織中的蛋白質(zhì)通過(guò)電泳的形式從凝膠轉(zhuǎn)移到固相支持物NC膜(硝酸纖維素薄膜)或PVDF(聚偏二氟乙烯膜)膜上,然后用特異性抗體檢測(cè)某特定抗原的一種蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)[9]。之后,Grierson 等[10]將其引入土壤酶學(xué)研究中,使用硝酸纖維膜作為底物溶液的載體和底物-土壤反應(yīng)的表面,并以此為基礎(chǔ)對(duì)根際土壤磷酸酶進(jìn)行原位檢測(cè)。但是由于底物及其熒光產(chǎn)物在膜上的擴(kuò)散速率慢,導(dǎo)致圖像的靈敏度低,絕對(duì)定量較為困難[6,10]。此后的研究改用濾紙、色譜層析紙等介質(zhì),雖然提高了溶質(zhì)的擴(kuò)散速率,但是又出現(xiàn)了熒光產(chǎn)物彌散嚴(yán)重,使得圖像的分辨率低、空間表達(dá)能力較差等問(wèn)題[11]。為了解決以上問(wèn)題,Spohn 等[12]在室內(nèi)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中,嘗試采用在膜-土表面間增置1 mm厚的凝膠層的方式來(lái)限制底物和熒光產(chǎn)物的擴(kuò)散速率,既避免了此前將熒光底物直接摻入凝膠的制備過(guò)程中,因凝膠溶解的溫度較高而導(dǎo)致的熒光底物部分分解的問(wèn)題,也防止了土壤顆粒沾染到圖像表面,從而明顯提高了圖像的分辨率。

但使用凝膠作為底物擴(kuò)散介質(zhì)的原位酶譜法也有諸多不足。該方法在膜與土壤間以凝膠為傳質(zhì)媒介,底物或酶都可以在凝膠中直接擴(kuò)散,并殘留在凝膠中,這不僅會(huì)降低酶譜圖像的分辨率,還可能會(huì)低估土壤酶的活性[13]。正因?yàn)榇?Razavi等[14]提出了將浸泡過(guò)熒光底物的聚酰胺膜直接覆于土壤表面的改進(jìn)方法。由于在60 min內(nèi)MUF和AMC熒光的淬滅可以忽略,在相同條件下直接酶譜法的熱點(diǎn)區(qū)域?qū)偯富钚缘呢暙I(xiàn)(6.8±0.1)%明顯大于凝膠酶譜法(3.3±0.8)%,且得到的酶活性分布更為集中,熒光強(qiáng)度更強(qiáng),圖像的對(duì)比度更高[14]。對(duì)植物根際β-葡萄糖苷酶活性的一項(xiàng)比較研究也發(fā)現(xiàn),直接覆膜的酶譜法得到的酶活性較使用凝膠的酶譜法更為集中于根際,其空間表達(dá)性更強(qiáng)[15]?？傮w上看,與凝膠酶譜法相比,直接酶譜法受擴(kuò)散的干擾更小,得到的酶活性分布更準(zhǔn)確,絕對(duì)定量更精確,因而近年來(lái)得到了更廣泛的應(yīng)用[16—18]。

1.2 酶活性定量方法的發(fā)展

土壤原位酶譜法的酶活性定量過(guò)程如下:對(duì)含有一系列不同濃度的酶作用產(chǎn)物的聚酰胺膜成像,以成像的灰度值與物質(zhì)濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),據(jù)此將土壤樣品所得酶譜圖像中的灰度值轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的酶活性。而酶種類(lèi)的選擇和操作過(guò)程會(huì)直接影響到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制[12—13]。例如Spohn等[12]的研究發(fā)現(xiàn),部分酶活性測(cè)定方法(如測(cè)定蛋白酶活性的考馬斯亮藍(lán)法)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)是非線(xiàn)性的,可能并不適合應(yīng)用于土壤酶活性的原位酶譜法定量。為了使定量結(jié)果更有說(shuō)服力,Razavi 等[14]提出了構(gòu)建基于膜吸收的溶液濃度和體積、膜面積的綜合指標(biāo),再與相應(yīng)的灰度值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的方法。為了簡(jiǎn)化標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作過(guò)程又不影響結(jié)果的精度,Giles 等[16]發(fā)展出了新的測(cè)定流程,將浸泡過(guò)溶液的膜干燥后,根據(jù)單位面積膜上的熒光信號(hào)強(qiáng)度和灰度值的關(guān)系作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),并通過(guò)選擇適當(dāng)?shù)钠毓鈺r(shí)間、使用動(dòng)態(tài)范圍更大的數(shù)字傳感器等方法提高標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的準(zhǔn)確度。在實(shí)際操作中,含飽和底物的膜與土壤的接觸常常并不十分緊密,使得原位酶譜技術(shù)往往會(huì)低估土壤中酶的活性[19]。針對(duì)熒光產(chǎn)物在實(shí)際土壤樣品的酶譜膜中分布不均勻的特點(diǎn),Guber 等[20]提出了一種比均勻膜定量方法更好的半均勻膜定量法,避免了傳統(tǒng)膜稱(chēng)重時(shí)底物揮發(fā)帶來(lái)的誤差,并發(fā)現(xiàn)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)時(shí)半均勻膜定量法MUF的濃度與熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)分段線(xiàn)性關(guān)系,斷點(diǎn)在約0.008 pmol/像素處。該研究結(jié)果大大拓寬了原位酶譜技術(shù)的可用底物范圍,對(duì)土壤原位酶譜技術(shù)的推廣有重要價(jià)值。

2 基于原位酶譜技術(shù)的土壤酶活性研究進(jìn)展

2.1 植物根際土壤酶活性及其主要影響因子

土壤酶是根際物質(zhì)周轉(zhuǎn)和養(yǎng)分代謝的重要催化劑與參與者,是根際微生物群落組成、活性和功能變化的敏感指標(biāo)。而土壤原位酶譜技術(shù)可以直觀、準(zhǔn)確的展示酶活性沿根系的分布及其時(shí)空變化,對(duì)于理解土壤理化因子及植物生理特性對(duì)土壤-根系-土壤微生物相互作用具有十分重要的意義[8]。

2.1.1植物根系發(fā)育和根形態(tài)

根際沉積物包括脫落的根冠和表皮細(xì)胞、死亡和裂解的根細(xì)胞、根排放的氣體、根被動(dòng)和主動(dòng)分泌的溶質(zhì)(根分泌物)以及來(lái)自根表的膠狀物質(zhì)(黏液)[21—23],分解根際沉積物和土壤有機(jī)質(zhì)(Soil organic matter, SOM)的酶的數(shù)量和種類(lèi)都隨時(shí)間和植物物種的變化而變化[23]。例如,豆科植物根際土壤中的酶從根表向外的分布范圍(根際范圍)普遍大于禾本科植物,但酶的活性卻顯著低于禾本科植物[17,24]。此外,根際土壤酶的活性沿豆科植物根系的分布較均一,而在禾本科植物則表現(xiàn)出明顯的部位差異性,例如包括β-葡萄糖苷酶等在內(nèi)的多種酶的活性及其根際效應(yīng)范圍從豆科植物根基部到根尖大體呈均勻分布,僅在接近根尖時(shí)范圍逐漸減弱,這些酶在禾本科植物則是在根尖或根基部酶活性范圍及活性有最大值[14,17]。當(dāng)然,即使是同一科屬的不同植物種,根際酶活性的分布也可能存在明顯的差異[14,17,25]。例如,小麥根際四種酶(β-葡萄糖苷酶、纖維二糖水解酶、亮氨酸氨基肽酶和酸性磷酸酶)的活性高,但范圍窄；玉米根際酶的活性低但范圍大[17],這可能是植物生存策略不同的結(jié)果。

植物和微生物都需要吸收氮、磷等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),而大多數(shù)生態(tài)系統(tǒng)土壤養(yǎng)分供應(yīng)水平通常有限,導(dǎo)致植物與微生物在根際發(fā)生強(qiáng)烈的養(yǎng)分競(jìng)爭(zhēng)。在缺乏外源養(yǎng)分輸入時(shí),植物通常通過(guò)根系形態(tài)學(xué)策略來(lái)克服養(yǎng)分限制[25],包括改變根的粗細(xì)、側(cè)根和根毛的數(shù)量等,進(jìn)而改變根際土壤酶的活性及其范圍。由于主根、側(cè)根和根毛的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能不同,根際沉積物的種類(lèi)、數(shù)量和分布也各不相同[17, 26]。相比于老而粗的主根,側(cè)根和根毛有更大的根表面積,提高了根分泌物的滲出量和作用范圍[27—28]。Giles 等[16]以大麥為材料,通過(guò)改進(jìn)酶譜的曝光時(shí)間,得到了更準(zhǔn)確的定量結(jié)果,發(fā)現(xiàn)根際磷酸酶活性與根毛的長(zhǎng)度呈線(xiàn)性關(guān)系。Ma 等[18]檢測(cè)了β-葡萄糖苷酶等酶在扁豆、玉米和小麥根際的酶活分布范圍,發(fā)現(xiàn)根毛顯著影響了土壤酶在根際的活性分布范圍,而根的粗細(xì)對(duì)酶的比活性(單位根表面積的酶活性)的影響大,例如在小麥根上有根毛的區(qū)段β-葡萄糖苷酶的根際范圍比沒(méi)有根毛的區(qū)段寬1.5倍。在土壤磷缺乏時(shí),排根(具密集根毛的側(cè)根)能極為有效地?cái)U(kuò)大磷酸酶活性的根際范圍,也可以提高磷酸酶的比活性[18, 25]。所以,植物形成高度分枝的側(cè)根和長(zhǎng)而密集的根毛可能是擴(kuò)大酶活性的根際范圍和獲取養(yǎng)分的有效策略。

由于不同酶的功能和根際過(guò)程(如根分泌有機(jī)物等)不同,其根際范圍和比活性也隨酶的種類(lèi)不同而不同,即使在根表同一部位各種土壤酶的根際范圍也可能相去甚遠(yuǎn)。例如,在貧瘠的亞表層黃土或淋溶土基質(zhì)中生長(zhǎng)的盆栽玉米、小麥、扁豆和羽扇豆的酸性磷酸酶的根際范圍是β-葡萄糖苷酶、纖維素水解酶和亮氨酸氨肽酶的1.5—2倍[14, 18, 25],其中C循環(huán)相關(guān)的酶(β-葡萄糖苷酶和纖維二糖水解酶)的根際范圍最小(1—1.5 mm),而磷酸酶的根際范圍可達(dá)2.5—3.5 mm[14]。其原因可能有:磷酸酶的來(lái)源廣泛,植物和微生物都可以產(chǎn)生；環(huán)境中不同營(yíng)養(yǎng)成分的供求狀況也會(huì)影響各種胞外酶的生產(chǎn)和分布[29],各種生物對(duì)磷的需求量大,但是土壤P的供應(yīng)通常相當(dāng)有限。由于酸性磷酸酶在低pH時(shí)活性更高,植物可以通過(guò)釋放質(zhì)子、調(diào)節(jié)根際土壤的pH等,控制磷酸酶在其根際的活性及分布范圍,以滿(mǎn)足自身的需求[30]。上述研究還發(fā)現(xiàn),酶的比活性與根際范圍并不一定是正相關(guān)的。例如,堿性磷酸酶的活性范圍雖然顯著大于酸性磷酸酶,但酸性磷酸酶在根際的比活性明顯大于堿性磷酸酶[24]。

所以,不同植物種類(lèi),根系的不同部分,甚至在根系的不同發(fā)育階段,根際土壤酶活性的強(qiáng)弱、沿剖面的分布和根系作用范圍都有所不同。而土壤原位酶譜技術(shù)因其直觀的空間表達(dá)性,改變了對(duì)植物根際土壤酶活性的傳統(tǒng)認(rèn)知,揭示了不同植物物種及其生理狀態(tài)對(duì)酶活性大小及其沿根系分布影響的差異性,對(duì)深入、準(zhǔn)確地認(rèn)識(shí)植物生理及植物-土壤反饋具有重要的意義。

2.1.2施肥

土壤中胞外酶的活性與植物、微生物所需資源的可給性往往呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,其中磷酸酶最為突出,而由于土壤氮素轉(zhuǎn)化過(guò)程復(fù)雜,氮轉(zhuǎn)化相關(guān)酶與土壤有效氮的關(guān)系較弱[29, 31]。施用速效肥料改變了資源的可給性,進(jìn)而影響了植物及微生物胞外酶的釋放。例如,土壤原位酶譜研究表明,施用磷肥不僅不會(huì)刺激磷酸酶的活性,反而可能使其降低[24]。此外,酸性磷酸酶和堿性磷酸酶對(duì)速效磷肥的響應(yīng)并不一致。添加速效磷肥后無(wú)論根際還是非根際土壤中的堿性磷酸酶活性都有明顯下降[24],但根際土壤中的酸性磷酸酶活性只略微降低[25]或者不受影響[24,31-32]。這一現(xiàn)象在越貧瘠的土壤中越明顯,原因在于酸性磷酸酶主要來(lái)自植物根系,而堿性磷酸酶主要由土壤微生物分泌,而相比于植物根系,產(chǎn)生堿性磷酸酶的土壤微生物受磷可利用性的影響更大[12]。貧磷土壤根際的酸性和堿性磷酸酶的活性均高于富磷土壤,分別高出53%和27%,而在非根際區(qū)土壤中兩種磷酸酶活性沒(méi)有差異[32],且受施磷的影響??；但是施磷后根際區(qū)土壤磷酸酶活性相比于非根際土壤大幅降低,伴隨著根際酶活性的范圍變寬0—2 mm[25]。

施用速效肥料一方面可能會(huì)抑制植物和微生物為獲取該養(yǎng)分而分泌的胞外酶的活性,另一方面也可能間接增加其他酶的活性及根際范圍。例如,施用過(guò)磷酸鈣會(huì)解除植物及土壤微生物的“磷限制”狀態(tài)[32],為維持元素的化學(xué)計(jì)量平衡,它們會(huì)將更多資源投入到獲取生存所需的其他限制性養(yǎng)分上,因而間接地促進(jìn)了β-葡萄糖苷酶、纖維素酶等C、N周轉(zhuǎn)相關(guān)酶類(lèi)的分泌,增強(qiáng)了根際和非根際土壤中的酶活性,擴(kuò)大了酶的根際范圍[33]。

相比于速效肥,緩釋肥料及間接養(yǎng)分添加會(huì)廣泛刺激生長(zhǎng)于貧瘠土壤的植物和微生物分泌胞外酶。例如將牛糞施加到土壤中以后,與C、N、P獲取有關(guān)的酶的活性及根際范圍普遍增大[34]。秸稈還田是農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)常見(jiàn)的間接養(yǎng)分添加措施,其對(duì)土壤酶的影響與死亡根系的作用類(lèi)似。大部分作物收獲后,死亡的根系會(huì)遺留在土壤中,使得短時(shí)間內(nèi)集中向土壤輸入碳源[13],包括高聚物(如纖維素和木聚糖[35])和低分子有機(jī)物,使根-碎屑層成為微生物和土壤酶活性的熱區(qū)[25, 36—37]。但與施用緩釋類(lèi)肥料后酶活性的變化模式不同,在死根分解過(guò)程中,土壤酶活性會(huì)出現(xiàn)先升高后下降的現(xiàn)象[34]。在植物地上部收割后,根尖滲出物增加,直接促進(jìn)了根際微生物活性的提高[13, 22, 38]；纖維素酶[13]、丙氨酸氨基肽酶[39]、磷酸酶[40]、亮氨酸氨基肽酶和幾丁質(zhì)酶[13]首先只在植物根尖處表現(xiàn)出酶活性,隨后范圍擴(kuò)大,逐漸擴(kuò)展到整個(gè)根系周邊,并在某一時(shí)刻達(dá)到最大值,即熱點(diǎn)時(shí)刻。此后隨著滲出物及低分子量有機(jī)物釋放量減少,酶活性及其范圍逐漸回落[33]。

借助原位酶譜技術(shù)的研究揭示了肥料種類(lèi)在植物根際釋放的差異性及植物根系吸收利用的不均勻性的同時(shí),展示了其對(duì)根際土壤中不同種酶的活性的真實(shí)影響,為傳統(tǒng)農(nóng)田施肥管理提供了新的思路。

2.1.3土壤水分變化

土壤水分是養(yǎng)分運(yùn)輸?shù)妮d體,也是土壤中酶與底物反應(yīng)的重要介質(zhì)。Holz等[41]采用土壤原位酶譜方法研究發(fā)現(xiàn),土壤容積含水量通過(guò)影響酶和底物的擴(kuò)散進(jìn)而影響土壤酶活性。無(wú)論是外源添加磷酸酶的滅菌土壤還是種植有大麥的土壤,擴(kuò)散模型都能解釋土壤含水量變化引起的磷酸酶活性變異的60%。土壤復(fù)濕后磷酸酶活性快速回復(fù)到原有水平,進(jìn)一步說(shuō)明了土壤含水量是酶活性的重要控制因子。土壤含水量也影響磷酸酶在根際與非根際土壤中的分布,由于根系分泌的黏液等物質(zhì)的作用[42],不僅在土壤干旱過(guò)程中根際區(qū)含水量一直高于非根際區(qū),而且根際區(qū)含水量降低更為緩慢,當(dāng)土壤容積含水量從接近飽和降低到5%時(shí),非根際區(qū)含水量降幅為87%,而根際區(qū)僅改變了74%；與之相對(duì)應(yīng)的是,在40%土壤含水量時(shí)根際與非根際土壤中磷酸酶活性的比值為10,而遭遇干旱脅迫時(shí),其比值提高到了63[41],此時(shí)植物根系會(huì)通過(guò)分泌黏液提高根際的保水性[43],但是當(dāng)土壤復(fù)濕時(shí),根際含水量恢復(fù)的速度同樣也滯后于非根際區(qū)[42,44]。Ahmadi等[45]利用原位酶譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)向土壤中添加表面活性劑可以提高根際的潤(rùn)濕性,擴(kuò)大酶活性范圍。進(jìn)行六次干旱-復(fù)濕循環(huán)后,與未施加表面活性劑的對(duì)照處理相比,土壤中施加了表面活性劑的玉米根表0—0.5 mm范圍內(nèi)β-葡萄糖苷酶和磷酸酶活性分別增加了4.3倍和1.9倍,酶的活性范圍(酶活性比土體高出至少10%)分別提高到原來(lái)的1.46倍和1.2倍[45]。該研究說(shuō)明表面活性劑降低了根際的疏水性,促進(jìn)了土壤復(fù)濕時(shí)根際的再潤(rùn)濕,根際水分含量的增加刺激了微生物活性和酶的擴(kuò)散能力,進(jìn)而增大了酶的活性及其在根際的活性范圍[46]。以上研究揭示了土壤水分對(duì)土壤酶活性的影響方式,也展現(xiàn)了表面活性劑在干旱土壤中活化和獲取養(yǎng)分的應(yīng)用潛力[45—46]。

2.1.4土壤溫度變化

溫度變化可直接改變酶的構(gòu)象靈活性,也可以間接影響微生物活性及群落變化,進(jìn)而作用于土壤及根際的酶活性[47—48]。利用土壤酶譜技術(shù)原位研究溫度變化對(duì)土壤酶活性的影響,有助于更透徹地了解土壤酶對(duì)氣候變化響應(yīng)的微觀空間特征。

在一定的溫度范圍內(nèi),酶活性一般隨著溫度的升高而增大。農(nóng)業(yè)大棚實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),玉米根際磷酸酶、纖維素酶和亮氨酸氨肽酶的酶活性熱區(qū)面積在30℃下最大[48],溫度較高時(shí)酶活性的熱點(diǎn)區(qū)域增加得更快,擴(kuò)展得更廣,其原因可能與溫度高時(shí)有機(jī)物分解速度較快[49—50],酶和底物的擴(kuò)散速度也較快有關(guān)[51]。同樣,水稻根系原位酶譜實(shí)驗(yàn)顯示,幾丁質(zhì)酶和磷酸酶的活性都隨溫度的升高(從18℃到25℃)而增加,且被測(cè)酶在根-土界面的溫度敏感性Q10>1(約為1.3—1.4),明顯高于非根際土壤(Q10約為1),說(shuō)明全球變暖可能導(dǎo)致根際的養(yǎng)分周轉(zhuǎn)速度的提升快于非根際土壤[52]。該研究還顯示,酶的根際范圍基本上不受溫度變化的影響[52]。所以,原位酶譜更準(zhǔn)確的揭示了溫度變化對(duì)根際土壤酶活性的影響的機(jī)制。

2.2 在土壤生態(tài)健康檢測(cè)中的應(yīng)用

土壤酶活性常用于監(jiān)測(cè)重金屬污染對(duì)生態(tài)系統(tǒng)健康的影響,其中磷酸酶活性對(duì)重金屬脅迫敏感,被廣泛用作土壤中重金屬毒性的指示指標(biāo)[53—55]。在鋅/鉛礦產(chǎn)地不同程度受鉛、鋅、鎘、銅污染的土壤上種植苜蓿,直接酶譜法顯示隨著污染程度的增加,β-葡萄糖苷酶和磷酸酶的活性升高,熱區(qū)面積所占比例增加,其中β-葡萄糖苷酶的熱區(qū)面積比例從0.1%提高到了0.9%,磷酸酶的從3.4%增加到了7.1%[53]。與上述結(jié)果不同,在Pu 等[56]開(kāi)展的玉米銅脅迫實(shí)驗(yàn)中,向土壤施加硫酸銅顯著降低了土壤N-乙酰葡萄糖胺酶、β-葡萄糖苷酶和磷酸酶的活性,加入納米氧化銅也導(dǎo)致催化幾丁質(zhì)水解的N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶(4-methylumbelliferyl N-acetyl-β-D-glucosaminide, NAG)活性略微下降?？赡艿脑?yàn)?(1)植物之間在生存策略和抗脅迫機(jī)理上存在差別,例如豆科植物與根瘤菌共生可以緩解自身的銅脅迫壓力[53]；(2)幾丁質(zhì)是真菌細(xì)胞壁的主要組成成分,納米氧化銅對(duì)真菌有毒,可能導(dǎo)致真菌數(shù)量降低,NAG酶的底物減少,活性下降[56]。

傳統(tǒng)的取樣測(cè)定土壤酶活性的方法也能進(jìn)行土壤生態(tài)健康檢測(cè),但是使用土壤原位酶譜技術(shù)可以有助于更加直觀的理解污染下真實(shí)土壤酶的活性及范圍變化,相比于潛在酶活性更加準(zhǔn)確、真實(shí)。但以上這些不同的研究結(jié)論說(shuō)明人們對(duì)于土壤重金屬污染對(duì)土壤酶的影響機(jī)制的認(rèn)識(shí)仍舊不足,而土壤原位酶譜的結(jié)果無(wú)法解釋其內(nèi)在機(jī)理[53]。所以,要想全面的理解生態(tài)污染的原因、提出應(yīng)對(duì)措施,應(yīng)在例如植物應(yīng)對(duì)策略及微生物等方面進(jìn)行更加深入的研究。

2.3 在土壤動(dòng)物與土壤酶活性關(guān)系研究中的應(yīng)用

土壤原位酶譜法也已被廣泛應(yīng)用于研究土壤動(dòng)物對(duì)土壤酶活性的影響,包括蚯蚓[57]、線(xiàn)蟲(chóng)[58]等。

蚯蚓形成的孔隙系統(tǒng)被稱(chēng)為蚓觸圈(Drilosphere),是土壤微生物活動(dòng)的“熱區(qū)”之一[59],蚯蚓的糞便、黏液、尿液中含有多糖、氨基酸和蛋白質(zhì)等易分解的物質(zhì)[60—61],其路徑通道內(nèi)微生物活性較高,能加速碳、氮、磷的轉(zhuǎn)化和再分配。另外,蚯蚓的腸道也能分泌酶,如磷酸酶等[62]。Hoang等[57]通過(guò)原位酶譜法研究顯示,蚯蚓通道內(nèi)壁的β-葡萄糖苷酶、纖維二糖水解酶、木聚糖酶、幾丁質(zhì)酶和酸性磷酸酶活性都明顯大于無(wú)蚯蚓活動(dòng)土壤。不同酶的活性范圍相差較大,如β-葡萄糖苷酶的熱區(qū)面積是無(wú)蚯蚓活動(dòng)土壤的13.8 倍,幾丁質(zhì)酶約為10.2倍,酸性磷酸酶則僅為2.4倍,提示蚯蚓通道內(nèi)與碳、氮循環(huán)相關(guān)的酶的活性變化大于促進(jìn)磷循環(huán)的酶。土壤原位酶譜法展示蚯蚓洞穴是多種酶的熱區(qū),更清晰的展示了蚯蚓的活動(dòng)對(duì)土壤酶活性和物質(zhì)循環(huán)的促進(jìn)作用。

線(xiàn)蟲(chóng)是重要的小型土壤動(dòng)物,部分線(xiàn)蟲(chóng)會(huì)寄生在農(nóng)作物體內(nèi),它們通過(guò)刺穿和破壞細(xì)胞壁侵染根部,在根內(nèi)活動(dòng)并導(dǎo)致整個(gè)根部感染,進(jìn)而改變植物根分泌物的數(shù)量和組成,影響根際酶活性[63]。原位酶譜結(jié)果顯示,線(xiàn)蟲(chóng)侵染促進(jìn)了多葉羽扇豆的根向土壤中釋放碳,使根際纖維二糖水解酶的分布范圍變窄,從1—1.5 mm下降到0.5—0.8 mm,熱區(qū)面積與總面積之比也下降到了原來(lái)的1/20[58]。線(xiàn)蟲(chóng)誘發(fā)的植物根結(jié)是水解酶的熱點(diǎn)(占侵染根系總活性的0.1%),也是吸引真菌和細(xì)菌等土壤微生物的資源富集區(qū)[64],線(xiàn)蟲(chóng)與生活在植物體內(nèi)的其他病原體之間的養(yǎng)分競(jìng)爭(zhēng)激烈。因?yàn)槭芫€(xiàn)蟲(chóng)侵染的植物提升了對(duì)磷的需求[65],故而與纖維二糖水解酶相反,磷酸酶的活性有所提高,磷酸酶的根際范圍增加,從3—3.5 mm增加到4—4.5 mm,且熱區(qū)面積在總面積中的占比上升了5倍[58]。驗(yàn)證了土壤線(xiàn)蟲(chóng)對(duì)根際微生物的重要影響。

所以,原位酶譜技術(shù)對(duì)于揭示土壤動(dòng)物-植物-微生物的相互關(guān)系具有十分重要的作用,但由于土壤環(huán)境的復(fù)雜性及土壤動(dòng)物的遷移能力較強(qiáng)等因素,目前仍無(wú)法準(zhǔn)確模擬土壤動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)軌跡[63],所以原位酶譜技術(shù)暫時(shí)還難以準(zhǔn)確評(píng)估土壤動(dòng)物對(duì)土壤酶活性、微生物及物質(zhì)循環(huán)的整體影響。

2.4 土壤孔隙對(duì)土壤酶影響的原位酶譜研究

土壤孔隙是指土粒之間、團(tuán)聚體之間以及團(tuán)聚體內(nèi)部的微小孔洞,是容納水分和空氣的空間,也是植物根系伸展和土壤動(dòng)物、微生物活動(dòng)的場(chǎng)所。土壤孔隙度的大小會(huì)直接影響土壤的保水性和通氣性,創(chuàng)造獨(dú)特的水、氣空間,從而間接影響土壤微生物及土壤酶的活性。Kravchenko 等[66]將土壤原位酶譜技術(shù)結(jié)合X射線(xiàn)μCT技術(shù),發(fā)現(xiàn)在非根際區(qū)土壤孔隙在60—180 μm范圍內(nèi)時(shí)酶活性(磷酸酶、纖維素酶、木質(zhì)素酶、幾丁質(zhì)酶和亮氨酸氨基肽酶)最高,這驗(yàn)證了非根際區(qū)域微生物棲息的最佳孔隙范圍,直接證實(shí)了土壤物理結(jié)構(gòu)對(duì)微生物的生存的重要性,為非根際區(qū)的酶學(xué)研究和微生物研究提供了良好的理論基礎(chǔ)。

3 研究展望

土壤原位酶譜技術(shù)借助其無(wú)損、原位的特點(diǎn)和空間分辨率優(yōu)勢(shì)克服了傳統(tǒng)土壤酶學(xué)技術(shù)的不足[12],可直觀地展示各種因素影響下酶活性沿根的分布及其時(shí)空變化[8]。正因?yàn)槿绱?該技術(shù)引入后,已從技術(shù)討論和根際研究逐漸拓展到探究酶活性與土壤理化、土壤動(dòng)物的關(guān)系、揭示其機(jī)理的重要研究中。原位酶譜技術(shù)已在根際酶活性研究中運(yùn)用成熟,但在非根際環(huán)境中應(yīng)用仍然較少(如圖1),且缺乏系統(tǒng)性,難以評(píng)估各研究中偶然因素的影響,所得結(jié)論缺乏普適性,難以直接借鑒。此外,土壤原位酶譜技術(shù)也有自身的局限性,例如結(jié)果的準(zhǔn)確性仍受到質(zhì)疑[19],且目前還只能研究有活性、難降解、可擴(kuò)散的酶[52,67]及遷移能力較弱的物種[63]。因此, 未來(lái)的研究應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步解決所存在的技術(shù)問(wèn)題,擴(kuò)展其應(yīng)用范圍,包括但不限于以下幾個(gè)方面:

(1)改進(jìn)方法過(guò)程。傳統(tǒng)的采樣測(cè)定土壤酶活性的方法有攪拌過(guò)程,因而土壤酶與底物能夠充分接觸[7]。但是在土壤原位酶譜方法中,熒光圖像的形成依賴(lài)于以下幾個(gè)接觸和擴(kuò)散過(guò)程:底物從膜向外擴(kuò)散、膜和土壤酶接觸、反應(yīng)產(chǎn)物(如MUF)到達(dá)膜,因土壤表面的凹凸不平,膜往往難以與土壤表面良好接觸,導(dǎo)致酶譜圖像只能表達(dá)出一小部分土壤表面的酶活性[8]。Guber等[19]的研究表明,覆膜與土壤僅有3.4%—36.5%的接觸面積,模型模擬顯示土壤原位酶譜只表現(xiàn)了直接或通過(guò)溶液間接接觸膜的那部分土壤中酶活性的20%。所以,有必要改進(jìn)土壤原位酶譜的技術(shù)規(guī)程,提高結(jié)果的準(zhǔn)確性,并推進(jìn)土壤原位酶譜技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化。

(2)拓展可測(cè)定的酶的種類(lèi)。早期由于技術(shù)的限制,土壤原位酶譜法測(cè)定的主要是高活性、難降解的胞外酶[52, 67],以水解酶為主。直接酶譜法的提出及分段線(xiàn)性擬合酶活性標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方法的建立,使酶學(xué)與原位酶譜技術(shù)的結(jié)合成為可能,為原位測(cè)定更多種類(lèi)的土壤酶提供了基礎(chǔ)。

(3)探究根系互作。植物種內(nèi)和種間相互作用是生態(tài)系統(tǒng)生物關(guān)系的重要組成部分,包括地上和地下相互作用兩部分。因?yàn)榈厣喜糠忠子谟^察和測(cè)定,所以此前的研究重點(diǎn)關(guān)注植物地上部分的競(jìng)爭(zhēng),而忽略了地下過(guò)程。而隨著近年來(lái)分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展,越來(lái)越多的研究表明植物間的相互關(guān)系受地下根際過(guò)程的制約和調(diào)節(jié)[68]。例如,有研究發(fā)現(xiàn)根系分泌物不僅可以增強(qiáng)種間協(xié)作、提高豆科植物的結(jié)瘤和固氮能力[69],而且還在植物的相互作用中發(fā)揮著重要的信號(hào)傳導(dǎo)作用[70]。與此同時(shí),植物間的相互作用會(huì)通過(guò)根際來(lái)影響土壤養(yǎng)分的循環(huán),根際過(guò)程也可顯著影響許多生態(tài)過(guò)程與生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)功能。所以對(duì)植物間根際土壤空間的各種酶活性的研究有助于深入理解植物種內(nèi)與種間關(guān)系,乃至更高層次上的生態(tài)學(xué)過(guò)程和問(wèn)題,有望成為未來(lái)植物學(xué)、土壤學(xué)、生態(tài)學(xué)和環(huán)境科學(xué)等學(xué)科的前沿研究領(lǐng)域[71]。

綜上所述,雖然目前土壤原位酶譜方法還存在技術(shù)缺陷,應(yīng)用范圍較窄,研究結(jié)果的精度有待提升,但該技術(shù)的優(yōu)勢(shì)和潛力巨大,未來(lái)隨著科技的整體發(fā)展,相信原位酶譜技術(shù)也會(huì)不斷改進(jìn),特別是與其他技術(shù)結(jié)合,在揭示土壤“黑箱”中的物質(zhì)周轉(zhuǎn)、養(yǎng)分轉(zhuǎn)化、污染物消解等關(guān)鍵過(guò)程的研究中發(fā)揮更大的作用,成為多學(xué)科交叉研究的重要手段。