微生物法測(cè)定嬰幼兒配方粉中煙酸和煙酰胺測(cè)量不確定度的評(píng)定

劉旸 王淼 王麗婷 房玉國(guó)＊ 黃曉林 韓超男

（1.黑龍江省綠色食品科學(xué)研究院，黑龍江哈爾濱 150028；2.黑龍江飛鶴乳業(yè)有限公司，黑龍江哈爾濱 150100）

煙酸和煙酰胺總稱(chēng)為維生素PP，是人體中必需的13種維生素之一。無(wú)論是人體還是動(dòng)物體，煙酸都能轉(zhuǎn)化為具有生物活性的煙酰胺，煙酰胺是輔酶Ⅰ、輔酶Ⅱ的組成部分[1-4]。這兩種輔酶是人體代謝正常氧化還原反應(yīng)中具有關(guān)鍵作用的酶[5-8]。在嬰幼兒配方食品中添加煙酸和煙酰胺，對(duì)嬰幼兒的皮膚、消化和神經(jīng)系統(tǒng)的生長(zhǎng)和正常發(fā)育都十分重要[9-13]?，F(xiàn)行檢驗(yàn)煙酸和煙酰胺的標(biāo)準(zhǔn)是GB 5009.89-2016《食品中煙酸和煙酰胺的測(cè)定》[14]，主要采用高效液相色譜法和微生物法進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)GB/T 27418-2017《測(cè)量不確定度評(píng)定和表示》[15]，只要有檢驗(yàn)檢測(cè)過(guò)程就會(huì)有測(cè)量系統(tǒng)誤差[16-19]，這就在煙酸和煙酰胺的測(cè)定過(guò)程中有不確定度的產(chǎn)生，為了讓測(cè)定的結(jié)果準(zhǔn)確就要引入測(cè)量不確定度。本文主要對(duì)微生物法測(cè)定嬰幼兒配方粉中煙酸和煙酰胺的測(cè)量不確定度進(jìn)行評(píng)定[20-24]。根據(jù)JJF 1059.1-2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》[25]與CNASCL01-G003-2019《測(cè)量不確定度的要求》[26]，確定微生物法測(cè)定嬰幼兒配方粉中煙酸和煙酰胺的測(cè)量不確定度的來(lái)源，作為檢驗(yàn)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室，減小測(cè)量誤差、保證出具的數(shù)據(jù)評(píng)定報(bào)告具有準(zhǔn)確性和有效性，是一個(gè)實(shí)驗(yàn)室的必備要求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氯化鈉，分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水乙醇，分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；硫酸（98%），分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉，分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；煙酸（C6H5NO2，CAS 號(hào)：59-67-6；純度≥98%）或煙酰胺（C6H6N2O，CAS 號(hào)：98-92-0；純度≥98%），西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基，美國(guó)BD Difco；乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基，美國(guó)BD Difco；煙酸測(cè)定用培養(yǎng)基，美國(guó)BD Difco。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱，德國(guó)MMM；722 分光光度計(jì)，上海光譜儀器；電子分析天平，北京賽多利斯；pH 計(jì)，北京賽多利斯；蓋勃離心機(jī)；破壁料理機(jī)，美國(guó)Westinghouse。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法[14]

1.3.1 菌懸液的制備

將實(shí)驗(yàn)用植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum,ATCC 8014）菌株活化后，接種到乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基上，36℃±1℃培養(yǎng)16 h～24 h，再轉(zhuǎn)種2 代-3 代來(lái)增強(qiáng)活力。將24 h 內(nèi)活化后的菌株接種到乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基中，36℃±1℃培養(yǎng)16 h～24 h，以大于3000 轉(zhuǎn)/ 分鐘離心5 min，棄去上清液，加入10 mL 生理鹽水，用渦旋混合器振蕩該懸液。再離心5 min，棄去上清液。如前操作清洗2 次～3次后，再加10 mL 生理鹽水，混勻。吸取適量該菌懸液于10 mL 生理鹽水中，混勻制成測(cè)試菌懸液。以生理鹽水做空白，用分光光度計(jì)于550 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定測(cè)試菌懸液透光率T（%），調(diào)整上述菌液加入量，使測(cè)試菌懸液透光率在60%～80%。

1.3.2 測(cè)定用樣品及制備和保存

1.3.2.1 測(cè)定用樣品信息

嬰幼兒配方粉（中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心的質(zhì)控樣品，證書(shū)編號(hào)為803IP04051，Lot 2017.09.19，煙酸標(biāo)示值范圍為4824 μg/100 g～5595 μg/100 g）。

1.3.2.2 測(cè)定用樣品制備和保存

嬰幼兒配方粉每個(gè)包裝冷凍到-20℃存放，使用前恢復(fù)至室溫。

1.3.3 樣品的前處理

準(zhǔn)確稱(chēng)取2 g～3 g（精確至0.0001 g）試樣于錐形瓶中，加入50 mL、0.5 mol/L 硫酸溶液，121℃水解30 min，取出迅速水浴冷卻至室溫。用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 至4.5±0.2，移入250 mL 容量瓶中用水定容至刻度。用定量濾紙過(guò)濾，最初約10 mL 濾液應(yīng)棄去，吸取1 mL 濾液于100 mL 燒杯中，加水約20 mL，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 至6.8±0.2，移入100 mL 容量瓶中加水定容至刻度。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)品的制備

1.3.4.1 煙酸（或煙酰胺）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100 μg/mL）

在含五氧化二磷的干燥器中取出干燥后的煙酸（或煙酰胺）標(biāo)準(zhǔn)品，稱(chēng)取50.0 mg（精確至0.1 mg），用乙醇溶液（25%）溶解并定容至500 mL。

1.3.4.2 煙酸（或煙酰胺）標(biāo)準(zhǔn)中間液（50 μg/mL）

吸取50 mL 煙酸（或煙酰胺）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100 μg/mL）至100 mL 容量瓶，用乙醇溶液（25%）定容。

1.3.4.3 煙酸（或煙酰胺）標(biāo)準(zhǔn)使用液（500 ng/mL）

吸取1.0 mL 煙酸（或煙酰胺）標(biāo)準(zhǔn)中間液（50 μg/mL）至100 mL 容量瓶，用水定容至刻度。

1.3.4.4 煙酸（或煙酰胺）標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)工作液

分兩個(gè)濃度，高濃度溶液的濃度為10 ng/mL；低濃度溶液的濃度為5 ng/mL。從使用液中（500 ng/mL）吸取兩次各5 mL，用水分別定容到250 mL 和500 mL。

1.3.5 微生物法測(cè)定煙酸和煙酰胺含量的計(jì)算公式

式（1）中：X-樣品中煙酸和煙酰胺含量，單位為微克每百克（μg/100 g）或微克每百毫升（μg/100 mL）；ρ-計(jì)算得到的試樣處理液中煙酸和煙酰胺含量的總平均值，單位為納克（ng）；f-稀釋倍數(shù)；m-試樣的質(zhì)量或體積，單位為克（g）或毫升（mL）。

2 微生物法測(cè)定嬰幼兒配方粉中煙酸和煙酰胺不確定度的評(píng)定

2.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)P 的測(cè)量不確定度[27-28]

經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，微生物法在測(cè)定煙酸和煙酰胺時(shí)，煙酸和煙酰胺具有相同的生物活性，所以只要采用一種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行煙酸和煙酰胺的測(cè)定即可。這里采用煙酸作為標(biāo)準(zhǔn)品，煙酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度P ≥98%（g/g），擴(kuò)展不確定度U=0.49%（g/g），相當(dāng)于：煙酸的純度P=0.98（g/g），擴(kuò)展不確定度U=0.0049（g/g），由于標(biāo)準(zhǔn)證書(shū)上沒(méi)有相關(guān)不確定度的其他信息，故假設(shè)是矩形均勻分布，煙酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(P)=0.0049/=0.002829。煙酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的相對(duì)不確定度urel(P)=u(P)/0.98=0.002887。

2.2 樣品稱(chēng)量m 的測(cè)量不確定度[29-30]

稱(chēng)取嬰幼兒配方粉樣品7 次，選取5 ng/mL 濃度水平進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，在相同的條件下測(cè)定樣品中的煙酸，如表1所示。

表1 微生物法測(cè)定嬰幼兒配方粉中煙酸的結(jié)果

分析天平稱(chēng)量的三個(gè)不確定度來(lái)源：重復(fù)性、可讀性（數(shù)字分辨力）和由于天平校準(zhǔn)產(chǎn)生的不確定度分量。天平的靈敏度及其線(xiàn)性：因?yàn)榉Q(chēng)量范圍很窄，忽略其對(duì)不確定度的貢獻(xiàn)。

樣品稱(chēng)量過(guò)程中，樣品的質(zhì)量m的不確定度受天平最大允許差和天平的分辨力影響。利用校準(zhǔn)證書(shū)的數(shù)據(jù)和制造商關(guān)于不確定度評(píng)定的建議，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品稱(chēng)量有關(guān)的不確定度進(jìn)行估算，結(jié)果為±0.1 mg，這種評(píng)定考慮了前面已識(shí)別的3種分量。即標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(m)=0.0001/=0.00005774。樣品稱(chēng)量質(zhì)量m的相對(duì)不確定度為urel(m)=u(m)/m=0.00005774/2.5565=0.00002259。

2.3 稀釋倍數(shù)f 的測(cè)量不確定度

根據(jù)GB/T 27418-2017《測(cè)量不確定度評(píng)定和表示》[15]可知，測(cè)量不確定度是利用可獲得的信息，表征賦予被測(cè)量量值分散性的非負(fù)參數(shù)。測(cè)量不確定度一般由若干分量組成。其中一些分量可根據(jù)一系列測(cè)量值的統(tǒng)計(jì)分布，按照測(cè)量不確定度的A 類(lèi)進(jìn)行評(píng)定，并可用標(biāo)準(zhǔn)差表征。而另一些分量測(cè)量可根據(jù)經(jīng)驗(yàn)或其他信息所獲得的概率密度函數(shù)，按照測(cè)量不確定度的B 類(lèi)進(jìn)行評(píng)定，也用標(biāo)準(zhǔn)差表征。A 類(lèi)評(píng)定是對(duì)在規(guī)定測(cè)量條件下測(cè)得的量值用統(tǒng)計(jì)分析的方法進(jìn)行的測(cè)量不確定度分量的評(píng)定。B 類(lèi)評(píng)定主要基于權(quán)威機(jī)構(gòu)發(fā)布的量值、有證參考物質(zhì)的量值、校準(zhǔn)證書(shū)、儀器的漂移、經(jīng)檢定的測(cè)量?jī)x器的準(zhǔn)確度等級(jí)和根據(jù)人員經(jīng)驗(yàn)推斷的極限值等。其中電子分析天平的校準(zhǔn)證書(shū)就是B 類(lèi)評(píng)定的主要依據(jù)。

根據(jù)JJG 196-2006《常用玻璃儀器檢定規(guī)程》[31]，在標(biāo)準(zhǔn)品配制和樣品稀釋過(guò)程中涉及的玻璃器皿為100 mL、250 mL和500 mL單刻度容量瓶，1 mL、5 mL和50 mL單刻度移液管。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所使用的天波牌玻璃器皿都是A 級(jí)玻璃器皿，并且在20℃時(shí)都已經(jīng)校準(zhǔn)，并且都取矩形均勻分布[31]，則包含因子為k=。20℃時(shí)水的膨脹系數(shù)α=0.00021℃-1，實(shí)驗(yàn)室溫度變化為Δt±4℃，按矩形均勻分布，包含因子k=。玻璃器皿在測(cè)定過(guò)程中，不僅要考慮玻璃器皿內(nèi)部體積的測(cè)量不確定度，還要考慮溶液溫度和玻璃器皿與校準(zhǔn)溫度引起的不確定度，按矩形均勻分布。各玻璃器皿對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的配制和樣品稀釋的影響，如表2 所示。

表2 各玻璃器皿對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品稀釋的影響

由表2 可知，玻璃器皿對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品配制過(guò)程中產(chǎn)生的相對(duì)不確定度為：

玻璃器皿對(duì)樣品稀釋過(guò)程中產(chǎn)生的相對(duì)不確定度為：

2.4 試樣處理液中煙酸含量ρ 的重復(fù)性的測(cè)量不確定度

2.5 測(cè)量不確定度的合成與評(píng)定

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)P 的測(cè)量不確定度的評(píng)定

根據(jù)2.1 節(jié)和表2 可知，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度是配制過(guò)程中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)上的不確定度以及逐步稀釋配制過(guò)程中玻璃器皿等產(chǎn)生的。由于微生物法測(cè)定的煙酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)符合ATCC 8014 植物乳桿菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)，并不呈現(xiàn)線(xiàn)性，所以不考慮標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的不確定度的影響。即標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)P 相對(duì)不確定度U(P)=(urel2(P)+urel2(P 玻璃器皿))1/2=0.005021。

2.5.2 樣品稱(chēng)量m 的不確定度的評(píng)定

根據(jù)2.2 節(jié)和表1 可知，樣品稱(chēng)量m 的不確定度是樣品重復(fù)性稱(chēng)量和分析天平自身產(chǎn)生的。即樣品稱(chēng)量m 的相對(duì)不確定度

2.5.3 稀釋倍數(shù)f 的不確定度的評(píng)定

根據(jù)2.3 節(jié)和表2 可知，樣品的稀釋倍數(shù)為25000 倍，稀釋過(guò)程中產(chǎn)生的不確定度受玻璃器皿和溫度的影響，其中溫度的影響已經(jīng)包含在玻璃器皿的測(cè)量不確定度里。即稀釋倍數(shù)f的相對(duì)不確定度為U(f)=urel(f 玻璃器皿)=0.01145。

2.5.4 試樣處理液中煙酸含量ρ 的重復(fù)性的不確定度的評(píng)定

根據(jù)2.4 節(jié)和表1 可知，試樣處理液中煙酸含量ρ 的重復(fù)性相對(duì)不確定度為U(ρ)/5.3127=0.001134。

2.5.5 微生物法測(cè)定嬰幼兒配方粉中煙酸和煙酰胺的測(cè)量不確定度的評(píng)定

根據(jù)3.1 節(jié)～3.4 節(jié)可知，微生物法測(cè)定嬰幼兒配方粉中煙酸和煙酰胺的測(cè)量不確定度為：U(X)=(U(P)2+U(m)2+U(f)2+U(ρ)2)1/2=0.01272 ≈0.01。

2.5.6 擴(kuò)展不確定度的計(jì)算根據(jù)測(cè)量不確定度評(píng)定指南對(duì)一般檢驗(yàn)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的要求[16]，包含因子一般取k=2。因此，微生物法測(cè)定嬰幼兒配方粉中煙酸和煙酰胺的相對(duì)擴(kuò)展不確定度Urel=k×U(X)=2×0.01=0.02 。由表1 可知，微生物法測(cè)定嬰幼兒配方粉中煙酸的含量為5209.04 μg/100 g，則擴(kuò)展不確定度U=5209.04×0.02=104.18 μg/100 g ≈100 μg/100 g，k=2。

3 結(jié)論

采用微生物法測(cè)定嬰幼兒配方粉中煙酸和煙酰胺時(shí)，當(dāng)稱(chēng)樣量為2 g～3 g（精確至 0.0001 g）、試樣處理液中煙酸含量ρ 為5.0 ng±0.5 ng 時(shí)，擴(kuò)展不確定度為U=100 μg/100 g，k=2。當(dāng)采用微生物法測(cè)定嬰幼兒配方粉中煙酰胺時(shí)，只需在測(cè)定煙酸的基礎(chǔ)上乘以一個(gè)系數(shù)1.008，即可轉(zhuǎn)化為煙酸的結(jié)果。其測(cè)量不確定度的評(píng)定過(guò)程和煙酸一致。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，影響微生物法測(cè)定嬰幼兒配方粉中煙酸和煙酰胺的主要因素是樣品的稀釋過(guò)程，標(biāo)準(zhǔn)品的配制、樣品稱(chēng)量過(guò)程以及試樣中煙酸和煙酰胺含量的重復(fù)性的影響較小。其中樣品稱(chēng)量過(guò)程以及試樣中煙酸和煙酰胺的含量的重復(fù)性為測(cè)量不確定度A 類(lèi)評(píng)定，樣品的稀釋過(guò)程和標(biāo)準(zhǔn)品的配制為測(cè)量不確定度B 類(lèi)評(píng)定。樣品的稀釋過(guò)程對(duì)測(cè)量不確定度的影響較大原因分析為稀釋倍數(shù)大，采用的玻璃器皿較多，在使用過(guò)程中，人員在操作規(guī)范的同時(shí)，要注意實(shí)驗(yàn)環(huán)境如溫度、水的膨脹系數(shù)等對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程的影響，避免誤差過(guò)大，提高準(zhǔn)確度。