多殺菌素類殺蟲劑的應用及其抗性研究進展

王珂慧，郭 超，劉艷麗，王靖楠，王 超

（1.國家糧食和物資儲備局科學研究院，北京 100037； 2.北京城市學院 生物醫(yī)藥學部，北京 100083）

多殺菌素類殺蟲劑——多殺菌素（又名多殺霉素，spinosad）和乙基多殺菌素（spinetoram），作為一類高效安全的生物殺蟲劑，既對靶標害蟲具有快速高效殺蟲活性，又對非靶標生物安全，主要降解方式是光解和微生物降解，最終分解為碳、氮、氧等[1]，在防治農業(yè)害蟲、儲糧害蟲、衛(wèi)生害蟲以及動物寄生蟲等方面發(fā)揮著重要作用。其主要作用于煙堿型乙酰膽堿受體和γ-氨基丁酸受體，通過刺激害蟲的神經系統(tǒng)從而引起興奮，導致非功能性的肌肉收縮、顫抖、衰竭和麻痹等，最終致害蟲死亡。

多殺菌素是由土壤放線菌——刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）經有氧發(fā)酵產生的大環(huán)內酯類殺蟲劑，具有高效殺蟲活性，1999年獲得美國“總統(tǒng)綠色化學品挑戰(zhàn)獎”。陶氏益農公司在我國登記的多殺霉素產品為菜喜SC （Success?）和催殺SC （Conserves?）。研究者通過明確多殺菌素生物合成的中間體及合成路徑后，篩選出能合成多種新的多殺菌素類物質的菌株后，應用人工神經網絡對多殺菌素類新物質及其活性進行定量-構效關系分析，最終通過半合成修飾獲得了第2代多殺菌素——乙基多殺菌素[2]，并于2008年再次獲獎。此外，國家糧食和物資儲備局科學研究院從國內采集的土樣中篩選獲得了產多殺菌素結構類似物——丁烯基多殺菌素（butenyl-spinosyns）的須糖多孢菌，并對菌株的生長代謝特性進行了相關研究。

1 多殺菌素和乙基多殺菌素的應用

1.1 多殺菌素和乙基多殺菌素對農業(yè)害蟲的防治

多殺菌素類殺蟲劑是新型微生物源殺蟲劑，可用于果蔬、水稻、花卉等作物的害蟲防治，能有效地防治鱗翅目、雙翅目、纓翅目等多種害蟲。雖目前市場上沒有丁烯基多殺菌素產品，但其對蘋果蠹蛾和重要農業(yè)害蟲煙青蟲具有良好的殺蟲活性（表1）。多項研究顯示，多殺菌素和乙基多殺菌素對不同日齡、性別害蟲的毒殺活性不同，且不同處理方式也對致死率有影響，如Moretti等[3]發(fā)現(xiàn)經多殺菌素喂食處理的洋蔥蛆1周幼蟲的死亡率是2周幼蟲的2倍，但觸殺處理對1周和2周幼蟲的毒性相當。金濤等[4]測定了低濃度多殺菌素對云南重大農業(yè)害蟲草地貪夜蛾幼蟲的致死率達100.0%。來有鵬[5]發(fā)現(xiàn)多殺菌素對茴香薄翅野螟幼蟲的毒性較大，處理24 h的LC50為5.3 mg/L，48 h的LC50為1.4 mg/L。

表1 多殺菌素類殺蟲劑殺蟲譜

乙基多殺菌素對某些農業(yè)害蟲具有高毒性且環(huán)境溫度對其防效也有影響，Yee[6]發(fā)現(xiàn)乙基多殺菌素對美國西部櫻桃果蠅雌蠅的防效強于多殺菌素，2種多殺菌素對3～4 d果蠅的產卵率影響較大，且低溫下對果蠅的致死率較低。董麗娜等[7]采用葉管藥膜法測定發(fā)現(xiàn)乙基多殺菌素處理后3～14 d對煙薊馬的田間防治效果達90.0%以上，對黃曲條跳甲的防效為68.6%～78.1%、對猿葉甲的防效為100.0%。乙基多殺菌素1 000和2 000倍稀釋液喇叭口點施，處理后7 d防效均達90.0%以上，能維持穩(wěn)定高效的殺蟲活性[8]。

1.2 多殺菌素和乙基多殺菌素對儲糧害蟲的防治

儲糧害蟲種類繁多，在我國儲糧害蟲種類達200余種，造成糧食在儲藏運輸流通環(huán)節(jié)的大量損失。大量濫用化學農藥使糧食品質受到影響，故生物源殺蟲劑備受青睞。多殺菌素類殺蟲劑的降解方式不會對環(huán)境造成負擔，在植物中也可快速分解代謝，膳食殘留量較低，具有較高的商業(yè)推廣價值。目前，美國登記的此類殺蟲劑可在大麥、玉米、稻谷、小麥等糧食作物上使用，在中國，多殺菌素也應用于倉儲害蟲的防治。在避光缺氧環(huán)境下，在一年的倉儲期內此類殺蟲劑幾乎不分解，殺蟲活性可維持1～2年[9]。大量研究結果顯示，1.0 mg/kg多殺菌素能有效防治常見儲糧害蟲如銹赤扁谷盜谷蠹、鋸谷盜、米象、玉米象等。試驗倉中多殺菌素及多殺菌素復配劑組中，玉米象、赤擬谷盜等主要儲糧害蟲發(fā)現(xiàn)時間均晚于未作任何處理的對照倉，對照倉中蟲口密度是試驗倉的1.4倍[10]。還有學者發(fā)現(xiàn)，多殺菌素能提升儲糧害蟲對溫度的敏感性，降低其耐受能力從而起到殺蟲作用[11]。為了滿足應用需要，此類殺蟲劑被開發(fā)出多種劑型，如粉劑、水乳劑、復配劑、微乳劑等。

在倉儲害蟲的防治中，乙基多殺菌素也取得了很好的效果，楊國浩等[12]測得乙基多殺菌素對煙草粉螟幼蟲的觸殺活性高于高效氯氰菊酯，可大幅降低煙草粉螟的蟲口密度。乙基多殺菌素能維持高的子代種群抑制率，4.0 mg/kg的劑量條件下對麥蛾子代種群的抑制率為100.0%[13]。

1.3 多殺菌素和乙基多殺菌素對衛(wèi)生害蟲的防治

衛(wèi)生害蟲是傳染病傳播的重要媒介，對人類的生活和身體健康有嚴重的影響，長期高劑量有機氯類、有機磷類、氨基甲酸酯類等化學防治使蚊、蠅抗性問題越來越嚴重，從源頭控制和消除病媒生物是保護居民身體健康，促進社會經濟發(fā)展的根本。多殺菌素和乙基多殺菌素的殺滅效果在伊蚊、按蚊和家蠅等衛(wèi)生害蟲上都得到了驗證。利用多殺菌素顆粒劑和片劑對野外模擬水稻田小區(qū)施用防治三帶喙庫蚊幼蟲，顆粒劑處理后大齡幼蟲減退率高于片劑，2種劑型對三帶喙庫蚊控制持效期長[14]。Sheele[15]用多殺菌素防治一種以血為食的人體外寄生蟲溫帶臭蟲，以施用后的血藥濃度峰值為測定藥物劑量，多殺菌素1 000 ng/mL及以上劑量致死能力達75.0%。Gimnig等[16]用多殺菌素乳化劑在處理肯尼亞西部按蚊1周后效果減弱，緩釋劑4周后效果減弱，分散片施用后效果立即降低，可見不同劑型對一些衛(wèi)生害蟲的殺滅效果也不同。

乙基多殺菌素對某些害蟲具有更好的防治效果，有研究顯示，乙基多殺菌素對家蠅的毒性大約是多殺菌素的2倍[17]。

1.4 多殺菌素和乙基多殺菌素對動物寄生蟲的防治

多殺菌素對家畜、寵物寄生蟲也具有優(yōu)越的防治效果，且低毒易降解，對家畜和寵物本身的傷害小。多項研究結果顯示多殺菌素能有效防治寵物寄生蟲。Packianathan等[18]在第0、30、60 d給狗服藥，第14 d跳蚤數相對于第0 d減少94.6%，第60 d對狗的跳蚤的平均有效率大于98.8%。Franc等[19]使用多殺菌素片治療和控制貓身上的跳蚤感染，以塞拉霉素為對照組，用藥60 d后試驗組蚤數平均減少96.0%，高于對照組，接受治療的動物均無不良反應出現(xiàn)。

雖然乙基多殺菌素在防治動物寄生蟲方面的報道不多，但療效顯著。Paarlberg等[20]對比不同藥物對貓蚤的治療效果，結果為乙基多殺菌素處理后0～37 d對貓蚤的有效率大于96.0%，殺蟲效果強于氟蟲腈，且無不良反應出現(xiàn)。這些研究表明多殺菌素和乙基多殺菌素能安全有效地預防和治療貓蚤感染。

2 對多殺菌素和乙基多殺菌素的抗性及抗性機制研究

2.1 害蟲對多殺菌素和乙基多殺菌素的抗性

隨著多殺菌素和乙基多殺菌素的廣泛應用，近年來多種害蟲對其發(fā)展了不同程度的抗性。如伊蚊是幾種蟲媒病毒的主要傳播媒介，埃及伊蚊對多殺菌素和乙基多殺菌素均有中等抗性[21]。從西澳大利亞的核果中采集的西花薊馬出現(xiàn)對乙基多殺菌素的抗性，其LC50和LC99分別為敏感品系的19倍和77倍[22]。多殺菌素是目前巴西用于防治番茄螟蟲的主要殺蟲劑之一，處理世代第7代時，抗性達到18萬倍以上[23]。這2種殺蟲劑對小菜蛾有很高的防治效果，但也發(fā)展了不同程度的抗性[24]，且這2種殺蟲劑之間產生了交互抗性，相似的結構使多殺菌素類殺蟲劑有相似的殺蟲機制[25]，其作用機制不同于其他類殺蟲劑（表2），故與其他殺蟲劑間不存在交互抗性[26]。

表2 生物農藥的特點

2.2 害蟲對多殺菌素和乙基多殺菌素的抗性機制

昆蟲的抗性嚴重影響殺蟲劑防治效果，使殺蟲劑用量增大。昆蟲抗性機制來自多個方面如代謝作用增強、靶標敏感性降低、穿透率降低、行為抗性等，目前研究最深入的2個方面是靶標抗性機制和代謝增強機制。研究表明，靶標突變使得自身結構功能特性發(fā)生改變而導致多殺菌素與煙堿型乙酰膽堿受體（nAChR）或γ-氨基丁酸受體的結合能力下降或靶標表達量改變導致靶標敏感性降低，最終使昆蟲產生抗性。此外一些昆蟲對多殺菌素的抗性與細胞色素P450s （CYP450s）、羧酸酯酶（CarE）、谷胱甘肽-S-轉移酶（GSTs）介導代謝增強有關。

2.2.1 代謝抗性

抗性的發(fā)展是害蟲治理面臨的重大挑戰(zhàn)，代謝 抗性表現(xiàn)為害蟲的解毒酶代謝能力增強。從分子水平研究P450s是否參與了昆蟲對多殺菌素類殺蟲劑產生抗性是有效的方法。此外多項研究表明CarE和GSTs等活性升高也是導致昆蟲產生抗性的機制。

例如，有學者利用轉錄組分析從低、中和高抗性煙草薊馬中發(fā)現(xiàn)多個可能參與多殺菌素抗性的不同表達基因，并且CYP450s表達量隨著抗性程度增加而增加[27]。但也有人對田間桔小實蠅抗性種群采用殺蟲增效劑-羧酸酯酶抑制劑（DEF）和CYP450s酶抑制劑（PBO）進行增效生物測定，發(fā)現(xiàn)其對多殺菌素毒性的協(xié)同作用不顯著[28]，對多殺菌素抗性達到18萬倍以上的番茄螟蟲CarE和CYP450s酶活性降低，表明CarE和CYP450s沒有參與這些昆蟲對多殺菌素的抗性[5]。還有試驗發(fā)現(xiàn)在家蠅中抗性的產生與性別有關，抗性家蠅品系791spin中，外源生物代謝相關的基因CYP4d9和CYP6G4表達高于敏感品系，CYP4G2基因在雌性家蠅中高表達，表明CYP4G2可能與雌性家蠅對多殺菌素產生高抗性有關[29,30]。

不同害蟲及同種害蟲不同種群產生抗性的機制不同，乙基多殺菌素為薊馬、小菜蛾等提供了有效的防治方案，從西花薊馬中發(fā)現(xiàn)代謝增強是其對乙基多殺菌素產生抗性的機制，其羧酸酯酶CarE、谷胱甘肽-S-轉移酶GSTs、微粒體多功能氧化酶MFOs、細胞色素單加氧酶P450活性顯著增強[31]。但黃胸薊馬抗性品系增效試驗結果顯示，代謝抗性不是其對乙基多殺菌素產生抗性的機制[32]。小菜蛾的乙基多殺菌素抗性品系中，顯示有3個上調蛋白GSTs、CarE、AchE，2種品系在mRNA水平上差異顯著[33]。

2.2.2 靶標抗性

盡管多項研究表明昆蟲的CYP450s介導增強是導致抗性的機制，但在番茄螟蟲、桔小實蠅等昆蟲中發(fā)現(xiàn)與代謝抗性無關。nAChRα6 亞基是多殺菌素的作用靶標，其中氨基酸替換是果蠅和薊馬種群對多殺菌素產生抗性的原因。例如，在抗多殺菌素的果蠅和花薊馬品系中分別發(fā)現(xiàn)了nAChRα6亞基的氨基酸替換G275E和G275V，將該突變引入到果蠅的nAChRα6亞基，其對多殺菌素的敏感性降低66倍[34,35]。此外，還有靶標基因突變及其相對表達量改變可能導致昆蟲產生高抗性，在多殺菌素高抗性的地中海果蠅中，在nAChRα6亞基中鑒定出了3個隱性突變等位基因[36]。Wang等[37]證實了小菜蛾對多殺菌素高抗性水平的產生與nAChRα6亞基中的3個氨基酸缺失有關。

在中國，瓜薊馬和棕櫚薊馬對乙基多殺菌素的抗性主要是由nAChRα6亞基的氨基酸替換G275E和F314V引起，突變頻率超過90%的品系，其LC50范圍是未突變品系的60～276倍[38]。

3 結 語

多殺菌素類殺蟲劑為廣譜高效的綠色生物農藥，在害蟲綜合防治中具有很好的應用前景，但多殺菌素和乙基多殺菌素現(xiàn)已出現(xiàn)交互抗性，在抗性治理中需避免二者輪用，延緩抗性發(fā)展。通過化學修飾和生物合成改造，得到其結構類似物是擴大此類殺蟲劑殺蟲譜，提高殺蟲活力和延緩害蟲抗性發(fā)展的有效途徑。丁烯基多殺菌素為天然合成產物，比多殺菌素具有更廣泛的殺蟲譜，能殺滅多殺菌素和乙基多殺菌素防治效果不佳的蘋果蠹蛾和煙青蟲等，在延緩害蟲抗性方面極具潛力[39]。目前，丁烯基多殺菌素的發(fā)酵產量較低，在市場上未見相關產品登記的報道，如何提高其發(fā)酵產量是亟待解決的一大難題。通過基因工程改造、理化誘變篩選丁烯基多殺菌素高產菌株和培養(yǎng)基優(yōu)化提高發(fā)酵產量已成為近年研究的熱點。此外，不同害蟲種群對多殺菌素類殺蟲劑顯示出代謝抗性和靶標抗性兩種抗性機制，對此類殺蟲劑代謝抗性機制研究僅在抗性害蟲的代謝解毒酶活性和CYP450s基因表達量的變化等方面，還需對代謝抗性的調控機制進一步研究。

我國越來越重視低毒低殘留和對生態(tài)環(huán)境無污染的新型農藥開發(fā)，發(fā)展生物農藥是增強農產品國際競爭力和發(fā)展綠色產業(yè)的主要路徑。因此，要加大對生物農藥的分析和研究，以理性、客觀的方式看待生物防治和化學防治的優(yōu)缺點。