巴戟天對慢性應(yīng)激大鼠腸道微生物代謝多樣性的影響

李宇，蔡蕭君，王欽，吳圓圓，頡彥鵬，胡楊

黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150036

巴戟天為茜草科植物巴戟天How的干燥根，以寡糖、多糖、環(huán)烯醚萜苷、黃酮、氨基酸、蒽醌類及維生素等為主要成分，其中寡糖含量近50%，具有明確的抗抑郁活性。研究表明，巴戟天主要通過提高5-羥色胺（5-HT）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）、谷氨酸受體亞單位-1（GluR1）表達(dá)和調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)可塑性發(fā)揮抗抑郁作用。國外研究發(fā)現(xiàn)，巴戟天抗抑郁作用與調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)密切相關(guān)，微生物-腸-腦軸在抑郁癥發(fā)病中起重要作用，但其具體機(jī)制尚不明確。Biolog微生物鑒定分析系統(tǒng)可通過觀察微孔板中 31種碳源的利用情況和顏色變化，分析微生物對目標(biāo)代謝途徑的影響，構(gòu)成群落整體代謝特征指紋。基于此，本研究采用Biolog技術(shù)，結(jié)合《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范》中的菌群檢測方法與判定標(biāo)準(zhǔn)，選取6種常駐菌屬進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，分析巴戟天干預(yù)后大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)和整體代謝的變化規(guī)律，觀察巴戟天對慢性應(yīng)激大鼠腸道微生物的影響，探討其抗抑郁的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)健康雄性SD大鼠，8周齡，40只，體質(zhì)量（200±20）g，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（黑）2019-0001。飼養(yǎng)于黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，溫度（20±1）℃，相對濕度（50±5）%，每日12 h光照，自由攝食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 藥物及制備

巴戟天免煎顆粒劑，江陰天江藥業(yè)有限公司，10 g/袋，稱取20 g，研缽碾碎，加少量蒸餾水，置于100 ℃恒溫水浴鍋中加熱，充分?jǐn)嚢柚镣耆芙?，加蒸餾水定容至60 mL，制成原藥材濃度為0.33 g/mL的藥液，分裝后4 ℃密封保存。鹽酸氟西汀分散片，批號(hào)9492AA，法國禮來，20 mg/片，蒸餾水配制成濃度為0.33 g/mL的藥液。

1.3 主要試劑與儀器

類桿菌-膽汁-七葉苷（BBE）瓊脂（批號(hào)20190327）、伊紅美藍(lán)（EMB）瓊脂（批號(hào) 20190413）、乳酸桿菌選擇性（LBS）瓊脂（批號(hào) 20190223）、莫匹羅星鋰鹽改良（MRS）培養(yǎng)基（批號(hào)20190129）、Pfizer腸球菌選擇性（PSE）瓊脂（批號(hào)20190602）、胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸（TSC）瓊脂（批號(hào)20190516），青島海博生物技術(shù)有限公司。菌落/顯微細(xì)胞分析儀（型號(hào)MF4），杭州迅數(shù)科技有限公司；Biolog微孔板，美國Axygen公司；敞箱，100 cm×100 cm×50 cm，自制；玻璃桶，30 cm×50 cm×5 mm；懸尾儀（型號(hào)SA2100），江蘇賽昂斯公司。

1.4 分組及造模

40只雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、巴戟天組和氟西汀組，每組 10只。除正常組外，其余各組大鼠采用慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激結(jié)合孤養(yǎng)制備慢性應(yīng)激大鼠模型。根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法每日定時(shí)選擇1種刺激方法，包括以下7種：①電擊足底1 min；②4 ℃冰水游泳5 min；③懸尾3 min；④夾尾1 min；⑤禁食24 h；⑥禁水24 h；⑦夜間光照12 h。孤養(yǎng)方法為每只大鼠單獨(dú)1籠，各籠之間用不透光擋板遮擋。共造模6周。

1.5 給藥

造模結(jié)束后，巴戟天組予巴戟天藥液（3.17 g/kg）灌胃，氟西汀組予氟西汀溶液（3.17 mg/kg）灌胃，給藥體積 9.606 mL/kg，正常組和模型組予蒸餾水（6.3 mL/kg）灌胃，每日1次，連續(xù)給藥8周后，進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1.6 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

1.6.1 懸尾實(shí)驗(yàn)

參考文獻(xiàn)[12]方法進(jìn)行懸尾試驗(yàn)。將大鼠尾巴（距離末端約1 cm）固定在桌面上方50 cm處的金屬棒上，持續(xù)6 min，大鼠之間用聚苯乙烯泡沫隔板隔開，測定大鼠在5 min內(nèi)的懸尾掙扎時(shí)間。

1.6.2 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)

參考文獻(xiàn)[13]方法進(jìn)行強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)。將大鼠放入透明無蓋玻璃水桶中，持續(xù)6 min，記錄大鼠在4 min內(nèi)的自主游泳時(shí)間（大鼠處于直立姿勢或僅以微小動(dòng)作保持頭部位于水面上，則被認(rèn)為“不動(dòng)”），實(shí)驗(yàn)時(shí)各玻璃桶間用隔板隔開。

1.6.3 曠場實(shí)驗(yàn)

曠場置于暗室，由不透明鋼板制成，將大鼠單獨(dú)放入曠場一角，記錄大鼠運(yùn)動(dòng)軌跡和行為，分析大鼠在5 min內(nèi)的移動(dòng)總距離。

1.7 糞便收集、處理及檢測

給藥結(jié)束后，收集各組大鼠糞便，置于無菌 EP管中，每管分裝2～3粒，置于4 ℃冰箱保存。無菌條件下稱取糞便樣品1 g，加入10 mL生理鹽水，渦旋振蕩，1 000 r/min離心5 min，除去食物殘?jiān)?，取上清液，稀釋成濃度?0～10g/mL的菌懸液。選取10g/mL菌懸液，用滅菌刮鏟將菌液均勻涂抹在 6種選擇性培養(yǎng)基上，將培養(yǎng)皿倒置，恒溫培養(yǎng)，至長出菌落后計(jì)數(shù)。

采用 Biolog微孔板檢測碳源代謝過程中的吸光度變化，分析腸道微生物對底物碳源的利用能力，碳源分類及編號(hào)同文獻(xiàn)[14]。取10g/mL菌懸液迅速接種至Biolog微孔板，每孔150 μL，放入37 ℃恒溫厭氧培養(yǎng)箱中，利用Biolog微生物鑒定分析系統(tǒng)，分別于接種后24、48、72、96、120、144、168 h進(jìn)行讀數(shù)測定，計(jì)算每孔顏色平均變化率（AWCD）。AWCD＝Σ（C－R）/n，C為碳源孔在波長 590 nm與750 nm吸光度的差值，R為對照孔的吸光度差值，n為碳源數(shù)目31。

選取 Biolog微孔板培養(yǎng) 72 h的數(shù)據(jù)，計(jì)算其Shannon指數(shù)、Shannon均勻度、Simpson指數(shù)和McIntosh指數(shù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 巴戟天對模型大鼠行為學(xué)的影響

與正常組比較，模型組大鼠懸尾掙扎時(shí)間、自主游泳時(shí)間顯著縮短（＜0.05），曠場內(nèi)移動(dòng)總距離顯著減少（＜0.05），伴見嗜睡、反應(yīng)遲鈍、反抗減少等表現(xiàn)；與模型組比較，巴戟天組和氟西汀組大鼠懸尾掙扎時(shí)間、自主游泳時(shí)間顯著延長（＜0.05），曠場內(nèi)移動(dòng)總距離顯著增加（＜0.05）。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)比較（±s）

2.2 巴戟天對模型大鼠代謝組學(xué)的影響

2.2.1 聚類分析

對各組31種碳源進(jìn)行聚類，結(jié)果見圖1。當(dāng)聚類距離≤5時(shí)，正常組和巴戟天組碳源被聚為4類，模型組碳源被聚為6類，氟西汀組碳源被聚為5類。4組中均有 β-甲基-D-葡萄糖苷、D-半乳糖酸-γ-內(nèi)酯、D-半乳糖醛酸、G-肝糖、D-纖維二糖、D,L-α-甘油聚為一類。正常組中N-乙酰基-D-葡萄胺、葡萄糖-1-磷酸鹽、D-葡萄胺酸、D-木糖未聚在該類，模型組中D-甘露醇、L-絲氨酸、D-葡萄胺酸未聚在該類，巴戟天組中吐溫80、L-天冬酰胺酸、α-D-乳糖未聚在該類，氟西汀組中吐溫80、L-絲氨酸未聚在該類。

圖1 各組大鼠腸道微生物代謝聚類分析

2.2.2 巴戟天對模型大鼠腸道 6種常駐菌數(shù)量的影響

與正常組比較，模型組大鼠腸道內(nèi)雙歧桿菌、乳酸菌數(shù)量顯著減少（＜0.05），脆弱擬桿菌、腸球菌、腸桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量顯著增加（＜0.05）；與模型組比較，巴戟天組大鼠腸道內(nèi)雙歧桿菌、乳酸菌數(shù)量顯著增加（＜0.05），脆弱擬桿菌、腸球菌、腸桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量顯著減少（＜0.05），氟西汀組大鼠腸道內(nèi)雙歧桿菌數(shù)量顯著增加（＜0.05），脆弱擬桿菌、腸球菌、腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量顯著減少（＜0.05）；與巴戟天組比較，氟西汀組大鼠腸道內(nèi)脆弱擬桿菌、乳酸菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量顯著減少（＜0.05），腸桿菌數(shù)量顯著增加（＜0.05）。結(jié)果見表2、圖2。

圖2 6種培養(yǎng)基菌落形態(tài)比較

表2 各組大鼠腸道6種常駐菌數(shù)量比較（±s）

2.2.3 巴戟天對模型大鼠腸道微生物每孔顏色平均變化率的影響

AWCD常用于評價(jià)微生物對單一碳源的利用能力和代謝總體活性，可在一定程度上反映微生物群落的數(shù)量和結(jié)構(gòu)特征。厭氧培養(yǎng)48 h內(nèi)，各組大鼠腸道微生物 AWCD均逐漸增加，組間差異不明顯，表明腸道微生物的總體代謝活性隨培養(yǎng)時(shí)間延長而逐漸增加。48 h后，組間開始出現(xiàn)顯著差異，正常組大鼠腸道微生物 AWCD上升速度最快且持續(xù)時(shí)間最長，72 h后趨于平穩(wěn)，其AWCD最大。巴戟天組大鼠腸道微生物AWCD上升速度較平緩，72 h后趨于平穩(wěn)。氟西汀組、模型組大鼠腸道微生物 AWCD上升持續(xù)時(shí)間最短，在48 h后就開始趨于緩和。對各組大鼠腸道微生物培養(yǎng)72 h的AWCD進(jìn)行比較，結(jié)果為正常組＞巴戟天組＞氟西汀組＞模型組。結(jié)果見圖3。

圖3 各組大鼠腸道微生物AWCD比較（±s）

2.2.4 巴戟天對模型大鼠腸道微生物代謝多樣性的影響

與正常組比較，模型組大鼠腸道微生物Shannon指數(shù)、Shannon均勻度、Simpson指數(shù)和McIntosh指數(shù)均顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，巴戟天組大鼠腸道微生物 Shannon指數(shù)、Shannon均勻度、Simpson指數(shù)和McIntosh指數(shù)顯著升高（＜0.01），氟西汀組大鼠腸道微生物Shannon指數(shù)、McIntosh指數(shù)顯著升高（＜0.01），而Shannon均勻度、Simpson指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）；與巴戟天組比較，氟西汀組大鼠腸道微生物 Shannon均勻度、Simpson指數(shù)顯著降低（＜0.01），而Shannon指數(shù)、McIntosh指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）。結(jié)果見表3。

表3 各組大鼠腸道微生物多樣性指數(shù)比較（±s）

2.2.5 主成分分析

Biolog分析結(jié)果表明，大鼠腸道微生物對微孔板中大多數(shù)碳源都具有代謝能力，但不同組別對不同碳源的代謝有明顯差異。主成分分析結(jié)果顯示，正常組、模型組、巴戟天組、氟西汀組碳源中，成分1方差貢獻(xiàn)率分別為84.68%、68.60%、69.69%和84.70%。見圖4。

圖4 各組大鼠腸道微生物代謝主成分分析

分析4組大鼠腸道微生物對31種碳源的代謝能力，正常組成分1在D-甘露醇、D,L-α-甘油、G-肝糖、L-蘇氨酸、衣康酸、D-纖維二糖、L-絲氨酸、腐胺及L-精氨酸等碳源上有較高的載荷，表明在正常組中這些碳源對成分1貢獻(xiàn)率較大。模型組成分1在D-半乳糖酸-γ-內(nèi)酯、α-丁酮酸、L-蘇氨酸、2-羥基苯甲酸、吐溫80、I-赤藻糖醇、D-纖維二糖、衣康酸、腐胺及L-苯基丙氨酸等碳源上有較高載荷。巴戟天組成分1在D-半乳糖醛酸、L-天冬酰胺酸、α-丁酮酸、L-蘇氨酸、D-木糖、N-乙?；?D-葡萄胺、D-纖維二糖、D,L-α-甘油及L-精氨酸等碳源上有較高的載荷。氟西汀組成分1在α-環(huán)式糊精、L-絲氨酸、β-甲基-D-葡萄糖苷、D-半乳糖醛酸、L-蘇氨酸、吐溫40等碳源上有較高載荷。正常組和巴戟天組成分 1在糖類、氨基酸類和羧酸類碳源上都有較高載荷，模型組增加了酚酸類和胺類碳源，氟西汀組增加了聚合物類碳源。

正常組成分2在4-羥基苯甲酸、D-蘋果酸等碳源上有較高載荷，表明在正常組中這些碳源對成分2貢獻(xiàn)率較大。模型組成分2在葡萄糖-1-磷酸鹽、D-甘露醇、甘氨酰-L-谷氨酸及D,L-α-甘油等碳源上有較高載荷。巴戟天組成分2在苯乙基胺、吐溫40及衣康酸等碳源上有較高載荷。氟西汀組成分2在4-羥基苯甲酸等碳源上有較高載荷。D,L-α-甘油等糖類碳源在正常組和巴戟天組中對成分1貢獻(xiàn)率較大，在模型組和巴戟天組中對成分2貢獻(xiàn)率較大。D-半乳糖醛酸等糖類碳源在巴戟天組和氟西汀組中對成分 1貢獻(xiàn)率較大，在正常組和模型組中對成分1和成分2貢獻(xiàn)率都不大。衣康酸等羧酸類碳源在正常組和模型組中對成分1貢獻(xiàn)率較大，在巴戟天組中對成分2貢獻(xiàn)率較大。L-精氨酸等氨基酸類碳源在正常組和巴戟天組中對成分1貢獻(xiàn)率較大，在模型組和氟西汀組中對成分1和成分2貢獻(xiàn)率都不大。

3 討論

腸道菌群是相對穩(wěn)定的定植微生物群落，在大腦與腸道之間的雙向信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用，可通過微生物-腸-腦軸改變大腦的認(rèn)知和情感過程。研究表明，擬桿菌是抑郁癥患者腸道中的主要富集菌種，是抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸（GABA）的主要產(chǎn)生細(xì)菌，可通過谷氨酸-谷氨酰胺-GABA循環(huán)調(diào)控微生物-腸-腦軸而引發(fā)抑郁樣行為。腸球菌能促進(jìn)結(jié)腸上皮細(xì)胞中腫瘤壞死因子（TNF）-α和白細(xì)胞介素（IL）-6的表達(dá)，通過神經(jīng)炎癥途徑導(dǎo)致抑郁。產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素可以激活酪氨酸激活酶A的雙重途徑，誘導(dǎo)A549細(xì)胞中促炎因子IL-8的釋放，通過免疫炎癥引起抑郁相關(guān)行為的發(fā)生。雙歧桿菌能生成大量色氨酸、煙酸酯和葉酸，而色氨酸為單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-HT的主要來源，5-HT和葉酸水平與抑郁癥嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)。同時(shí)，雙歧桿菌還可促進(jìn)抗炎因子IL-5和IL-10的生成，顯著改善抑郁相關(guān)行為。大腸桿菌可通過提高海馬區(qū) TNF-α、IL-1β表達(dá)抑制海馬神經(jīng)再生，還可引起下丘腦-垂體-腎上腺軸亢進(jìn)、血清皮質(zhì)酮含量升高，誘發(fā)抑郁癥。乳酸菌可提高紋狀體 5-HT、多巴胺水平，通過迷走神經(jīng)抑制中樞GABA受體mRNA表達(dá)，抑制TNF-α介導(dǎo)的IL-8表達(dá)，從而改善抑郁癥狀。Huo等研究顯示，抑郁癥患者糞便菌群移植可引起大鼠的抑郁樣行為。Aizawa等隨機(jī)對照臨床試驗(yàn)表明，服用益生菌膠囊（嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌和雙歧桿菌）能明顯改善抑郁癥患者癥狀。因此，明晰抑郁模型大鼠腸道微生物特征及演變規(guī)律是掌握巴戟天抗抑郁機(jī)制的關(guān)鍵，對延緩抑郁癥進(jìn)展具有重要意義。

本研究采用慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激結(jié)合孤養(yǎng)制備抑郁大鼠模型，行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，巴戟天可改善大鼠抑郁行為，且與氟西汀無顯著差異。Biolog微孔板中的31種碳源分為糖類、氨基酸類、聚合物類、羧酸類、胺類和其他化合物6類，但造模和藥物干預(yù)使大鼠腸道菌群發(fā)生明顯變化，傳統(tǒng)化學(xué)分類無法切實(shí)反映微生物菌群對不同碳源的利用情況，因此，需對 31種碳源進(jìn)行重新分類。聚類分析顯示，模型大鼠碳源利用比較分散，經(jīng)巴戟天或氟西汀治療后，碳源利用相對較集中，且巴戟天組碳源利用情況更接近正常組，可見巴戟天療效更顯著。采用稀釋平板菌落計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)大鼠6種常駐菌數(shù)量發(fā)現(xiàn)，巴戟天可調(diào)節(jié)模型大鼠腸道中條件致病菌脆弱擬桿菌、腸球菌、腸桿菌數(shù)量趨于正常水平，促進(jìn)有益菌乳酸菌、雙歧桿菌增殖，使其迅速成為優(yōu)勢菌種，并抑制有害菌產(chǎn)氣莢膜梭菌增殖，最終恢復(fù)腸道微生態(tài)平衡。氟西汀對模型大鼠腸道中脆弱擬桿菌、腸桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌具有明顯抑制作用，對雙歧桿菌和腸球菌的調(diào)節(jié)作用與巴戟天相當(dāng)，而對慢性應(yīng)激引起的乳酸菌數(shù)量下降無顯著調(diào)節(jié)作用。

AWCD表示大鼠腸道微生物對不同碳源的利用能力和整體代謝活性。Shannon指數(shù)用于評價(jià)腸道微生物菌群豐富度，數(shù)值越大表明該微生物群落功能多樣性越高，反之越低。Shannon均勻度是在菌群豐富度基礎(chǔ)上衡量微生物個(gè)體分布的均勻度。Simpson指數(shù)和 McIntosh指數(shù)都表示多樣性測度，表征某些常見菌種優(yōu)勢度和均勻度。Biolog數(shù)據(jù)分析表明，慢性應(yīng)激使大鼠腸道微生物碳源代謝能力和總體活性發(fā)生顯著變化，培養(yǎng)72 h后趨于平穩(wěn)，正常組大鼠腸道微生物 AWCD最大，巴戟天能調(diào)節(jié)模型大鼠腸道微生物 AWCD趨于正常，且調(diào)控作用明顯優(yōu)于氟西汀。巴戟天可上調(diào)模型大鼠 Shannon指數(shù)、Shannon均勻度、Simpson指數(shù)和McIntosh指數(shù)，以上結(jié)果提示，巴戟天有助于大鼠腸道微生物整體豐富度和均勻度、常見菌種優(yōu)勢度和均勻度的恢復(fù)，而氟西汀著重于調(diào)節(jié)Shannon指數(shù)和McIntosh指數(shù)，有助于大鼠腸道微生物整體豐富度和常見菌種均勻度的恢復(fù)，可見巴戟天和氟西汀對大鼠腸道微生物總體均勻度和有益菌種優(yōu)勢度的調(diào)節(jié)作用不同。主成分分析顯示，造模后大鼠腸道微生物總體代謝平衡被破壞，氟西汀能使模型大鼠腸道微生物對聚合物類碳源的利用增加，可能與其經(jīng)肝臟代謝和影響胃腸道功能有關(guān)；巴戟天可恢復(fù)微生物代謝平衡，可能與巴戟天有效成分溶出和對模型大鼠腸道微生物的調(diào)節(jié)作用相關(guān)。巴戟天組 N-乙?；?D-葡萄胺、D-纖維二糖、D,L-α-甘油等糖類碳源和L-天冬酰胺酸、L-蘇氨酸、L-精氨酸等氨基酸類碳源具有較高貢獻(xiàn)率。其中，L-精氨酸為動(dòng)物體蛋白合成的必需氨基酸，經(jīng)一氧化氮合酶氧化生成一氧化氮（NO），而NO作為中樞神經(jīng)遞質(zhì)參與介導(dǎo)抑郁癥等多種疾病的生理病理進(jìn)程，巴戟天可能通過干預(yù) L-精氨酸-NO-環(huán)鳥苷單磷酸信號(hào)通路發(fā)揮抗抑郁作用。

綜上所述，巴戟天對模型大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)和代謝多樣性的調(diào)節(jié)作用與其抗抑郁作用具有相關(guān)性，其對糖代謝和氨基酸代謝具有顯著調(diào)節(jié)作用。本研究結(jié)果可為巴戟天的臨床應(yīng)用和深入研究微生物-腸-腦軸機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。巴戟天對慢性應(yīng)激大鼠腸道微生物代謝的調(diào)控是通過哪些酶和代謝途徑發(fā)揮作用，有待采用高通量基因測序、代謝組學(xué)等方法進(jìn)一步研究。