左歸降糖解郁方對糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠前額葉皮層IR/IRS-1信號通路和能量代謝的影響

楊蕙，朱青，李薇，雷詩卉，劉檢，孟盼，劉林，肖望重，王宇紅

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)中心，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410208；3.湖南省腫瘤醫(yī)院，中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院，湖南 長沙 410013

2020年發(fā)布的《中國居民營養(yǎng)與慢性病狀況報(bào)告》顯示，我國糖尿病患病率為11.9%，抑郁癥患病率為2.1%。臨床研究顯示，糖尿病與抑郁癥之間存在雙向誘發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，但誘發(fā)因素和機(jī)制仍存在較多爭議。胰島素抵抗是糖尿病的典型病理特征，而針對肥胖型抑郁癥患者的臨床研究發(fā)現(xiàn)，胰島素抵抗的嚴(yán)重程度與患者的抑郁狀態(tài)呈正相關(guān)。糖尿病不僅會(huì)導(dǎo)致外周胰島素抵抗，也會(huì)導(dǎo)致中樞胰島素抵抗。胰島素在中樞具有多種神經(jīng)調(diào)節(jié)功能，其可通過作用于胰島素受體（IR）參與調(diào)控能量代謝等過程和情緒、認(rèn)知等神經(jīng)行為。其中，神經(jīng)元的能量代謝是細(xì)胞所有活動(dòng)的基礎(chǔ)。研究認(rèn)為，胰島素抵抗可通過影響葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體（GLUT）的膜表達(dá)，干擾神經(jīng)元的能量代謝。

左歸降糖解郁方是在經(jīng)典名方左歸丸基礎(chǔ)上化裁而成。前期研究發(fā)現(xiàn)，左歸降糖解郁方可通過調(diào)節(jié)海馬、下丘腦胰島素信號改善糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠外周胰島素抵抗。研究還認(rèn)為，左歸降糖解郁方對下丘腦胰島素信號的調(diào)節(jié)與其調(diào)控外周糖代謝相關(guān)度較高，而對海馬胰島素信號的調(diào)節(jié)則與改善動(dòng)物抑郁樣行為和認(rèn)知功能有關(guān)。前額葉皮層是 IR高表達(dá)的另一腦區(qū)，也是與抑郁癥密切相關(guān)的腦區(qū)之一。本實(shí)驗(yàn)研究左歸降糖解郁方對糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠前額葉皮層 IR/IRS-1信號通路和能量代謝的影響，從而進(jìn)一步豐富左歸降糖解郁方對多腦區(qū)調(diào)節(jié)的作用特點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

SPF級雄性SD大鼠48只，體質(zhì)量190～210 g，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物許可證號SCXK（湘）2019-0004。動(dòng)物飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)中心SPF級動(dòng)物房，自由攝食飲水，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d。

1.2 藥物

左歸降糖解郁方（黃芪、貫葉連翹、姜黃、熟地黃、山萸肉、枸杞子、菟絲子、杜仲、丹參、牡丹皮、牛膝），飲片購于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，并由醫(yī)學(xué)創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)中心制成原藥材濃度為1.14 g/mL水煎液（黃芪甲苷≥30 μg/mL、姜黃素≥0.4 mg/mL、貫葉金絲桃素≥18 μg/mL、丹酚酸B≥1.2 mg/mL、丹皮酚≥0.2 mg/mL）。動(dòng)物造模用高脂乳劑（含10%膽固醇、0.2%丙硫氧嘧啶、20%豬油、2%膽酸鈉、20%聚山梨酯 80和 20%丙二醇），醫(yī)學(xué)創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)中心制備，批號 20200306，-20 ℃冰箱保存，臨用前水浴加熱融化。

1.3 主要試劑與儀器

胰島素受體拮抗劑（S961 TFA），上海MCE公司，批號68525；鏈脲佐菌素（STZ），北京Solarbio公司，批號 1012C031；胰島素受體底物-1（IRS-1）、GAPDH、Na,K-ATPase α1抗體，美國CST公司，貨號分別為2382、7074、3010；p-IR、IR、p-IRS-1、GLUT4 抗體，江蘇 Affinity Biosciences公司，貨號分別為AF3099、AF6099、AF4424、AF5386；葡萄糖、丙酮酸 ELISA檢測試劑盒，南京建成生物工程公司，貨號分別為F006、A081；膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）ELISA檢測試劑盒，中生北控生物科技股份有限公司，批號分別為206021、201651；超敏ECL試劑盒，蘇州新賽美生物科技有限公司，批號 20201201。ChemiDoc XRS+凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司；SMART動(dòng)物行為學(xué)檢測系統(tǒng)，美國東樂自然基因生命科學(xué)公司；Enspire多功能酶標(biāo)儀，美國PerkinElmer公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模、分組及給藥

采用2周高脂乳劑灌胃（10 mL/kg）、一次性STZ（38 mg/kg）尾靜脈注射和4周慢性溫和不可預(yù)知應(yīng)激的聯(lián)合造模方法建立糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠模型。48只大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、陽性藥（二甲雙胍0.18 g/kg＋氟西汀1.8 mg/kg）組、左歸降糖解郁方高（20.52 g/kg）、中（10.26 g/kg）、低（5.13 g/kg）劑量組，每組8只。給藥劑量根據(jù)人與大鼠體表面積換算，相當(dāng)于60 kg成人用藥量的2、1、0.5倍，灌胃體積 10 mL/kg，對照組和模型組灌胃等體積蒸餾水，每日1次，連續(xù)4周。給藥結(jié)束后禁食不禁水12 h，尾尖采血測量大鼠空腹血糖，隨后進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。

2.2 曠場實(shí)驗(yàn)

曠場實(shí)驗(yàn)主要觀察動(dòng)物的自主活動(dòng)行為和探究行為。實(shí)驗(yàn)前將敞箱（80 cm×80 cm×40 cm）底部劃分為25個(gè)面積相等的方格。實(shí)驗(yàn)時(shí)依次將大鼠從同一位置放入敞箱中并適應(yīng)1 min，記錄大鼠3 min內(nèi)活動(dòng)次數(shù)。大鼠每經(jīng)過1個(gè)方格或攀爬在箱壁上均記為1次活動(dòng)。每只大鼠測評結(jié)束后，用消毒紙巾擦拭箱體，以免氣味相互干擾。實(shí)驗(yàn)過程中保持房間內(nèi)光線一致且安靜。

2.3 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)

強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)用來評價(jià)大鼠的抑郁樣行為。將大鼠置于高40 cm、直徑20 cm的圓柱形玻璃缸內(nèi)，缸中水位以大鼠伸展全身而尾部不碰觸缸底為準(zhǔn)，將大鼠放入缸內(nèi)適應(yīng)1 min，記錄大鼠在3 min內(nèi)的不動(dòng)時(shí)間（以大鼠漂浮在水面且四肢不動(dòng)或四肢輕微劃水為靜止不動(dòng)）。實(shí)驗(yàn)中注意保證同期實(shí)驗(yàn)大鼠之間不可見，以減少干擾。

2.4 血清膽固醇和三酰甘油含量檢測

行為學(xué)檢測后，所有大鼠禁食過夜，次日上午以戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，1 200 r/min離心10 min，取上清液，按ELISA試劑盒說明書檢測血清TC和TG含量。

2.5 葡萄糖代謝檢測

取血后頸椎脫臼法處死大鼠并于冰上取腦，分離前額葉皮層組織于液氮中速凍，隨后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存。實(shí)驗(yàn)前將前額葉皮層置于冰上快速勻漿，4 ℃、1 200 r/min離心10 min，取上清液，按ELISA試劑盒說明書檢測葡萄糖和丙酮酸含量。

2.6 Western blot檢測

將樣品分別用不同蛋白提取液處理，總蛋白提取液用于檢測IR、p-IR、IRS-1、p-IRS-1蛋白表達(dá)，膜蛋白提取液用于檢測GLUT4蛋白表達(dá)。BCA法測定蛋白濃度，依次對蛋白進(jìn)行變性、凝膠電泳、濕式轉(zhuǎn)膜，脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入稀釋的GLUT4（1∶2 000）、p-IR（1∶1 000）、p-IRS-1（1∶1 000）、IR（1∶2 000）、IRS-1（1∶2 000）、GAPDH（1∶2 000）和 Na,K-ATPase α1（1∶1 000）一抗，4 ℃孵育過夜，加入二抗（1∶3 000），室溫孵育1 h，洗膜，ECL試劑顯色，采用Image J軟件對蛋白條帶進(jìn)行分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 左歸降糖解郁方對模型大鼠血糖、血脂的影響

與對照組比較，模型組大鼠空腹血糖、血清 TC和TG含量顯著增加（＜0.01，＜0.05）；與模型組比較，左歸降糖解郁方高、中劑量組大鼠空腹血糖、血清TC和TG含量顯著減少（＜0.01，＜0.05）。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠血糖、血脂含量比較（±s，mmol/L）

4.2 左歸降糖解郁方對模型大鼠抑郁樣行為的影響

與對照組比較，模型組大鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間顯著延長，曠場實(shí)驗(yàn)活動(dòng)次數(shù)顯著減少（＜0.01）；與模型組比較，左歸降糖解郁方高劑量組大鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間明顯縮短，曠場實(shí)驗(yàn)活動(dòng)次數(shù)明顯增加（＜0.01），左歸降糖解郁方中劑量組大鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間明顯縮短（＜0.05），曠場實(shí)驗(yàn)活動(dòng)次數(shù)無明顯變化（＞0.05）。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和曠場實(shí)驗(yàn)抑郁樣行為比較（±s）

4.3 左歸降糖解郁方對模型大鼠前額葉皮層能量代謝的影響

與對照組比較，模型組大鼠前額葉皮層葡萄糖含量顯著增加，丙酮酸含量顯著減少（＜0.01）；與模型組比較，左歸降糖解郁方高劑量組大鼠前額葉皮層葡萄糖含量明顯減少，丙酮酸含量明顯增加（＜0.01）。結(jié)果見表3。

表3 各組大鼠前額葉皮層葡萄糖和丙酮酸含量比較（±s）

4.4 左歸降糖解郁方對模型大鼠前額葉皮層胰島素受體、胰島素受體底物-1蛋白表達(dá)的影響

與對照組比較，模型組大鼠前額葉皮層p-IR/IR、p-IRS-1/IRS-1比值顯著降低（＜0.01，＜0.05）；與模型組比較，左歸降糖解郁方高、中劑量組大鼠前額葉皮層p-IR/IR、p-IRS-1/IRS-1比值顯著升高（＜0.01，＜0.05）。結(jié)果見圖1、表4。

表4 各組大鼠前額葉皮層p-IR/IR、p-IRS-1/IRS-1比較（±s）

圖1 各組大鼠前額葉皮層p-IR、IR、p-IRS-1、IRS-1蛋白免疫印跡

4.5 左歸降糖解郁方對模型大鼠前額葉皮層葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4蛋白膜表達(dá)的影響

與對照組比較，模型組大鼠前額葉皮層 GLUT4蛋白膜表達(dá)顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，左歸降糖解郁方高、中、低劑量組大鼠前額葉皮層GLUT4蛋白膜表達(dá)顯著升高（＜0.01）。結(jié)果見圖2、表5。

圖2 各組大鼠前額葉皮層GLUT4蛋白免疫印跡

表5 各組大鼠前額葉皮層GLUT4蛋白膜表達(dá)比較（±s）

5 討論

近年來有研究提出，腦胰島素抵抗是糖尿病和抑郁癥的共同病理機(jī)制。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因糖尿病小鼠存在腦胰島素信號紊亂，并從5月齡開始表現(xiàn)出明顯的抑郁樣行為。C57BL/6小鼠經(jīng)高脂飼料喂養(yǎng)后也表現(xiàn)出明顯的焦慮和抑郁樣行為，且與腦胰島素信號損傷密切相關(guān)。糖尿病誘發(fā)的中樞胰島素抵抗會(huì)影響腦神經(jīng)元存活和中樞能量代謝穩(wěn)態(tài)。中樞胰島素抵抗的具體表現(xiàn)形式是以 IR/IRS-1為核心的胰島素信號異常。胰島素進(jìn)入腦內(nèi)后特異性作用于IR，進(jìn)而誘導(dǎo)IRS-1磷酸化，激活PI3K、MAPK等多條下游信號通路，調(diào)節(jié)神經(jīng)能量代謝和突觸可塑性等。前額葉皮層功能障礙與大部分情感障礙疾病相關(guān)，包括重度抑郁癥。但糖尿病并發(fā)抑郁癥是否存在前額葉皮層胰島素信號異常，目前并不清楚。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠前額葉皮層p-IR和p-IRS-1表達(dá)均顯著降低，提示前額葉皮層存在胰島素抵抗。

GLUT4是葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的成員之一，由12個(gè)跨膜片段和1個(gè)位于N端的胞外環(huán)狀結(jié)構(gòu)域組成。與肌肉組織類似，前額葉皮層中的GLUT4同樣屬于胰島素敏感性葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，胰島素可刺激GLUT4從胞漿轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜，并增加神經(jīng)元對葡萄糖的攝取。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠前額葉皮層細(xì)胞膜表面GLUT4蛋白表達(dá)顯著降低，而前額葉皮層中葡萄糖含量顯著增加，提示糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠前額葉皮層可能存在神經(jīng)元對葡萄糖的攝取異常，而丙酮酸的含量變化進(jìn)一步確定了神經(jīng)元對葡萄糖的攝取和利用異常。此外，推測模型大鼠前額葉皮層葡萄糖含量增加可能是由于糖尿病腦胰島素抵抗導(dǎo)致葡萄糖消耗減少，堆積增加。

左歸降糖解郁方中熟地黃為君，滋養(yǎng)腎陰；山萸肉、枸杞子為臣，合君藥以加強(qiáng)滋補(bǔ)腎陰作用；佐以菟絲子、牛膝、杜仲補(bǔ)肝腎，黃芪健脾益氣，丹參、牡丹皮活血散瘀，姜黃、貫葉連翹化瘀行氣、疏肝解郁。全方共奏疏肝解郁、活血化瘀之功。前期研究發(fā)現(xiàn)，左歸降糖解郁方可調(diào)節(jié)糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠部分腦區(qū)的胰島素信號。故本實(shí)驗(yàn)觀察該方對大鼠前額葉皮層胰島素信號的干預(yù)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，左歸降糖解郁方可提高糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠前額葉皮層p-IR、p-IRS-1蛋白表達(dá)及GLUT4蛋白的膜表達(dá)，推測左歸降糖解郁方可通過改善前額葉皮層胰島素信號，促進(jìn)GLUT4蛋白由細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位，從而增加神經(jīng)元的能量利用。此外，左歸降糖解郁方降低前額葉皮層葡萄糖含量、增加丙酮酸含量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為上述結(jié)論提供了佐證。同時(shí)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，左歸降糖解郁方高、中、低劑量對GLUT4的膜表達(dá)均有顯著影響，故推測該方可能不僅通過改善胰島素信號促進(jìn)GLUT4膜轉(zhuǎn)位，其對GLUT4的易位是否還有直接或其他間接作用值得進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，左歸降糖解郁方可能通過調(diào)節(jié)大鼠前額葉皮層胰島素信號，改善神經(jīng)元的能量代謝水平，從而發(fā)揮抗抑郁作用。