奶牛副結(jié)核病的診斷方法研究

柴貴明

內(nèi)蒙古自治區(qū)巴彥淖爾市烏拉特中旗動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古巴彥淖爾 015300

0 引言

副結(jié)核病是一種進(jìn)行性慢性傳染性肉芽腫性腸炎，主要危害牛羊生產(chǎn)，可造成患病動(dòng)物腸道、肝臟淋巴結(jié)等器官損傷，導(dǎo)致病畜腹瀉、進(jìn)行性消瘦，從而給牛羊養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。副結(jié)核病于1895年被首次報(bào)道，1906年成功構(gòu)建人工感染模型并命名為約內(nèi)病[2]。我國(guó)于1953年首次報(bào)道該病，1972年后多個(gè)省市的牛場(chǎng)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)該病[3]。副結(jié)核病主要導(dǎo)致腸道炎癥和功能障礙，病理變化通常出現(xiàn)于空腸和回腸，病變?yōu)槟c壁增厚和水腫，腸系淋巴結(jié)腫大水腫，有時(shí)肝臟和肝臟淋巴結(jié)也可出現(xiàn)病變。腸道病變可影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，從而導(dǎo)致病畜出現(xiàn)腹瀉、下頜水腫、體重降低、營(yíng)養(yǎng)不良、消瘦，嚴(yán)重時(shí)可造成病畜死亡[4]。相比于其他動(dòng)物，副結(jié)核病對(duì)奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成的影響更大，可導(dǎo)致牛死淘率增加、產(chǎn)奶量下降、飼料轉(zhuǎn)化效率降低、繁殖能力降低、屠宰價(jià)值降低以及增加對(duì)其他疾病的易感性。本文將重點(diǎn)對(duì)副結(jié)核對(duì)奶牛產(chǎn)業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)危害以及診斷方法進(jìn)行綜述。

1 流行病學(xué)

副結(jié)核病的病原為禽分枝桿菌副結(jié)核亞種，又名副結(jié)核桿菌，主要感染牛、綿羊和山羊，也可感染馬、鹿、羊駝、駱駝、駝鹿、麋鹿、馴鹿、豬、兔、白鼬、獾、狐等動(dòng)物。有流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，家養(yǎng)反芻動(dòng)物可通過(guò)接觸感染副結(jié)核桿菌的野生動(dòng)物從而感染，并且野生動(dòng)物可能是家畜感染副結(jié)核病的重要傳染源[5]。在奶牛場(chǎng)中，副結(jié)核桿菌主要通過(guò)患病或感染牛的糞便和牛奶經(jīng)口傳播，回腸和空腸是該菌主要定殖的部位。此外，子宮內(nèi)傳播和氣溶膠傳播也是該病的重要傳播途徑。奶牛副結(jié)核病的潛伏期較長(zhǎng)，表現(xiàn)出臨床癥狀時(shí)間主要于2～6歲，部分感染牛雖然不表現(xiàn)臨床癥狀，但可通過(guò)糞便、乳汁和精液等向牛群中持續(xù)排出副結(jié)核桿菌，從而導(dǎo)致牛群感染率增加。

2 發(fā)病機(jī)制

副結(jié)核桿菌主要通過(guò)口腔進(jìn)入宿主體內(nèi)，經(jīng)消化系統(tǒng)到達(dá)回腸上皮細(xì)胞，隨后進(jìn)入M細(xì)胞后被巨噬細(xì)胞吞噬，副結(jié)核桿菌可在巨噬細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期存在并逃避宿主的免疫反應(yīng)，進(jìn)而在宿主的小腸內(nèi)隱性感染[6]。副結(jié)核桿菌可通過(guò)多種途徑在巨噬細(xì)胞內(nèi)潛伏感染，包括：抑制吞噬體酸化和吞噬溶酶體融合，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞分泌IL-10，降低巨噬細(xì)胞清除胞內(nèi)病原體的能力[7]。在黏膜下層定殖的副結(jié)核桿菌會(huì)吸引更多的巨噬細(xì)胞、巨細(xì)胞和淋巴細(xì)胞到細(xì)菌定殖區(qū)從而造成肉芽腫性炎癥，破壞腸道組織結(jié)構(gòu)，影響其正常功能[8]。隨著副結(jié)核桿菌數(shù)量逐漸增多，細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)減弱，病原菌進(jìn)一步在宿主組織內(nèi)傳播，并開始通過(guò)糞便脫落，引起宿主體液免疫反應(yīng)。目前對(duì)于副結(jié)核桿菌感染的免疫反應(yīng)的轉(zhuǎn)變過(guò)程和疾病發(fā)展之間的關(guān)系尚不明確，但隨著免疫反應(yīng)的轉(zhuǎn)變，宿主也逐漸出現(xiàn)臨床癥狀。宿主開始通過(guò)糞便排出副結(jié)核桿菌到出現(xiàn)臨床癥狀之間的時(shí)間是不固定的，有些動(dòng)物感染后可在6 個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)明顯的癥狀，但是部分動(dòng)物可通過(guò)糞便排出副結(jié)核桿菌數(shù)年而不表現(xiàn)臨床癥狀[9]。副結(jié)核桿菌感染引起的小腸進(jìn)行性肉芽腫性炎癥會(huì)造成腸道吸收功能障礙，從而導(dǎo)致病牛出現(xiàn)腹瀉癥狀，體重減輕，甚至可出現(xiàn)脫水癥狀。大多數(shù)患病動(dòng)物的病變僅局限于遠(yuǎn)端小腸，不會(huì)延伸至回盲瓣，腸黏膜增厚、起皺、變紅，腸系膜淋巴結(jié)腫大、蒼白。病變部位的組織病理學(xué)特征為肉芽腫性炎癥，腸絨毛固有層和黏膜下層的巨細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)量增多。

3 對(duì)奶牛的危害

副結(jié)核病對(duì)奶牛個(gè)體的健康和福利的影響是直接的，除導(dǎo)致腹瀉、消瘦等明顯的臨床癥狀外，還可損害奶牛的免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致病牛對(duì)其他病原體易感性的增加。有研究表明，奶牛的副結(jié)核病與繼發(fā)性肺炎之間有著顯著的相關(guān)性[10]。

副結(jié)核病對(duì)奶牛養(yǎng)殖可造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)影響。有研究表明，在美國(guó)、加拿大和澳大利亞的奶牛場(chǎng)，因副結(jié)核病造成的經(jīng)濟(jì)損失分別為每頭牛每年100 美元、49 美元和44 美元[11]；奶牛產(chǎn)奶量減少500～1400 kg/頭[12]。副結(jié)核病還會(huì)導(dǎo)致奶牛腸道炎癥和功能障礙、吸收不良綜合征和蛋白質(zhì)丟失性腸病，從而對(duì)飼料轉(zhuǎn)化率和體重增加產(chǎn)生負(fù)面影響。由于副結(jié)核病導(dǎo)致的過(guò)早淘汰和死亡會(huì)導(dǎo)致直接性的經(jīng)濟(jì)損失。

副結(jié)核病還可能還與人類的克羅恩病相關(guān)[13]。牛奶中的副結(jié)核桿菌經(jīng)巴氏消毒后還能存活，這使得感染副結(jié)核菌的奶牛生產(chǎn)的牛奶成為潛在的傳染源，危害牛奶及相關(guān)制品的食品安全。

4 診斷

4.1 診斷方法

奶牛的副結(jié)核病的檢測(cè)方法可分為直接檢測(cè)副結(jié)核桿菌的直接檢測(cè)方法和檢測(cè)宿主對(duì)副結(jié)核桿菌感染引起的特異性免疫反應(yīng)的間接方法。

4.1.1 直接檢測(cè)方法

（1）組織病理學(xué)檢測(cè)

根據(jù)病牛剖檢結(jié)果是否存在腸道增厚、腸道內(nèi)壁變紅和起皺等病理變化的觀察，回腸、空腸、回盲瓣膜和腸系膜淋巴結(jié)是最主要的檢測(cè)部位。該方法是診斷奶牛副結(jié)核病的參考診斷方法，但部分奶牛剖檢后病變不明顯，因此主要用于輔助診斷。

（2）糞便細(xì)菌培養(yǎng)

糞便樣品的細(xì)菌分離鑒定是診斷該病的重要檢測(cè)方法之一，常用的培養(yǎng)基有固體培養(yǎng)基（如Herrold蛋黃培養(yǎng)基）和液體培養(yǎng)基（如M7H9C）。

（3）糞便PCR

糞便PCR檢測(cè)是當(dāng)前檢測(cè)奶牛副結(jié)核病的主要檢測(cè)方法之一，是通過(guò)PCR或熒光PCR特異性擴(kuò)增副結(jié)核桿菌高度保守的特異性基因，該方法能快速、準(zhǔn)確地診斷出糞便樣品中是否存在副結(jié)核桿菌。但是糞便樣品含有的微生物數(shù)量較多，DNA提取難度較大，是影響該方法檢測(cè)效果的重要因素之一。

（4）噬菌體檢測(cè)

使用噬菌體檢測(cè)來(lái)檢測(cè)活的副結(jié)核桿菌是一種相對(duì)較新的技術(shù)，但該方法的檢測(cè)效果仍需進(jìn)一步評(píng)估。噬菌體檢測(cè)方法主要使用的是D29分枝桿菌噬菌體，該噬菌體可靶向一系列分枝桿菌[14]。為了使噬菌體檢測(cè)方法對(duì)副結(jié)核桿菌具有更高特異性，在大多數(shù)已發(fā)表的方法中都應(yīng)用了額外的PCR步驟，但仍需進(jìn)一步評(píng)估和驗(yàn)證噬菌體檢測(cè)方法對(duì)糞便和牛奶樣品的檢測(cè)效果，以確定該方法作為副結(jié)核桿菌新診斷檢測(cè)方法的適用性。

4.1.2 間接檢測(cè)方法

（1）ELISA

最常見的副結(jié)核桿菌間接檢測(cè)方法為間接ELISA，該方法可對(duì)血清或牛奶樣品中的抗副結(jié)核桿菌的特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)，以評(píng)估奶牛的感染情況。使用ELISA檢測(cè)牛奶樣本，進(jìn)而評(píng)估牛奶質(zhì)量和診斷奶牛感染，是一種高效的檢測(cè)方法。

（2）γ-干擾素檢測(cè)

γ-干擾素檢測(cè) （IFN-?）是使用 ELISA 檢測(cè)血液中的IFN-?，該方法可以比 ELISA 抗體檢測(cè)更早地檢測(cè)到副結(jié)核桿菌感染，因?yàn)樵摲椒梢詸z測(cè)到副結(jié)核桿菌感染初期的細(xì)胞免疫反應(yīng)，此階段奶牛未出現(xiàn)特異性的體液免疫。

4.2 群體感染水平檢測(cè)

由于奶牛場(chǎng)奶牛養(yǎng)殖數(shù)量較多，并且副結(jié)核桿菌感染奶牛后的潛伏期較長(zhǎng)，因此當(dāng)個(gè)體發(fā)病時(shí)副結(jié)核桿菌已在群體內(nèi)傳播了較長(zhǎng)的時(shí)間。為了準(zhǔn)確評(píng)估牛群整體感染情況以及降低檢測(cè)成本和工作，經(jīng)常需要進(jìn)行奶牛群體感染水平的檢測(cè)。常用的檢測(cè)方法有全群血清學(xué)檢測(cè)、散裝奶罐樣品檢測(cè)、糞便匯集檢測(cè)以及環(huán)境樣品檢測(cè)，在奶牛場(chǎng)副結(jié)核桿菌的凈化和監(jiān)測(cè)工作中，上述群體檢測(cè)方法常與個(gè)體檢測(cè)方法同時(shí)進(jìn)行，用于評(píng)估牛群中奶牛的感染情況。

5 結(jié)語(yǔ)

奶牛副結(jié)核病是一種慢性疾病，在感染后期病牛才會(huì)逐漸顯示出癥狀，因此該病無(wú)特效治療藥物，需要采取定期監(jiān)測(cè)凈化和有效的生物安全管理措施進(jìn)行科學(xué)的預(yù)防。副結(jié)核桿菌感染后具有較長(zhǎng)的潛伏期，準(zhǔn)確靈敏的檢測(cè)方法在診斷奶牛副結(jié)核病方面具有重要的作用。當(dāng)前，奶牛副結(jié)核病的診斷方法已基本滿足診斷需求，但仍存在檢測(cè)周期長(zhǎng)、成本高、特異性和靈敏度不穩(wěn)定等問(wèn)題，未來(lái)仍需研發(fā)更適合獸醫(yī)臨床使用的低成本、準(zhǔn)確和快速的檢測(cè)方法以提高奶牛副結(jié)核病的診斷效率和準(zhǔn)確性。