化學助劑對楊木酶水解及發(fā)酵制備枯草芽孢桿菌的影響?

魏立婷 賈麗麗 張軍華

（西北農(nóng)林科技大學林學院，陜西 楊凌 712100）

我國楊木資源豐富，分布廣泛，多用于紙漿造紙、家具制造等行業(yè)。加工楊木時會產(chǎn)生大量廢棄物，為避免資源浪費，將楊木加工廢棄物作為生物質(zhì)化學品的生產(chǎn)原料[1-3]。前期研究發(fā)現(xiàn)，楊木經(jīng)乙酸和乙酸-過氧化氫兩步預處理后，可脫除大量木質(zhì)素，減少木質(zhì)素對纖維素酶的吸附，有利于后續(xù)水解[4]。同時研究表明，添加適量酶水解助劑可提高水解性能[5-8]，然而目前有關酶解助劑對后續(xù)發(fā)酵過程的影響缺少深入的研究。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）生長速度快且易存活[9]，將其引入動物體內(nèi)可以改善腸道微生態(tài)平衡，抑制有害菌生長，提高動物生長性能，可作為替代抗生素的飼料添加劑[10-13]。Wolfenden等[14]發(fā)現(xiàn)，飼料中添加枯草芽孢桿菌PHL-NP123可使肉仔雞體重增加，同時也使腸道中沙門氏菌減少了25%。Giang等[15]發(fā)現(xiàn)，多種復合微生物添加劑可提高仔豬采食量和回腸消化率，平均日增重增加5.9%。陳慧慧[16]以楊木木屑水解液為發(fā)酵基質(zhì)，通過木醋桿菌發(fā)酵進行細菌纖維素的制備，最高產(chǎn)量可達3.14 g/L。因此若以農(nóng)林廢棄物轉(zhuǎn)化制得的單糖作為微生物發(fā)酵碳源，可以進一步促進廢棄物料的高值轉(zhuǎn)化。

本試驗以乙酸-雙氧水預處理楊木殘渣為底物，添加β-葡萄糖苷酶（BG）和表面活性劑吐溫-80、PEG-6000、木質(zhì)素磺酸鈉為輔助劑進行酶水解，對比研究最優(yōu)水解條件，并以纖維素酶水解液中單糖為碳源，添加適量表面活性劑進行枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)，以提高活菌數(shù)，降低生產(chǎn)成本，為生物質(zhì)的高效利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

楊木屑，購自江蘇宿遷，經(jīng)粉碎過60目篩（孔徑＜0.25 mm），冷藏于-20 ℃冰箱保存?？莶菅挎邨U菌（Bacillus subtilis）YS01，由南京林業(yè)大學生物工程系生物化工研究所提供。

纖維素酶Cellic Ctec2（酶活為123 U/g，蛋白含量為176.2 mg/mL）和β-葡萄糖苷酶Novozyme 188（酶活為1 714 U/mL），購自丹麥諾維信（Novozymes）公司。標準品葡萄糖和木糖為色譜純，購于Sigma-Aldrich公司。其他化學試劑均為分析純。

1.2 設備

Agilent 1260 Infinity高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司；ZQTY-50S型振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司；UV-1800 型紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

瓊脂平板培養(yǎng)基：蛋白胨0.5%，酵母膏0.25%，葡萄糖0.1%，瓊脂1.5%，pH調(diào)至7.0±0.2。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖1%，蛋白胨1%，酵母膏0.5%，氯化鈉 1%，pH調(diào)至7.1±0.2。

發(fā)酵培養(yǎng)基：酶水解液中葡萄糖和木糖總和1%，蛋白胨1%，磷酸氫二鉀0.15%，硫酸錳0.01%，硫酸鎂0.05%，無水氯化鈣0.06%，pH調(diào)至7.0±0.2。

1.4 試驗方法

1.4.1 楊木預處理

預先用乙酸對楊木進行第一步預處理（5%濃度乙酸，常溫處理1 h，170 ℃加熱30 min），脫除半纖維素，制備低聚木糖[4,17]，預處理殘渣水洗至中性后用乙酸-雙氧水進行第二步預處理，乙酸-雙氧水濃度為80%，其中雙氧水與乙酸體積比為1∶1，60 ℃加熱2 h，第二步預處理殘渣用蒸餾水洗至中性，備用。

1.4.2 楊木酶水解

稱取6.0 g干物質(zhì)的兩步預處理楊木殘渣，檸檬酸鈉緩沖溶液（pH 5.0）補足體系，配成300 mL 2%底物濃度的水解液，在10 FPU/g DM的纖維素酶CTec2 基礎上，分別添加β-葡萄糖苷酶和吐溫-80、PEG-6000、木質(zhì)素磺酸鈉。在50 ℃、200 r/min條件下水解72 h，反應結(jié)束后將酶解混合物真空過濾，除去殘渣得酶解液。每次試驗做3 個平行，結(jié)果取平均值。

1.4.3 楊木酶水解液發(fā)酵

以未添加酶水解助劑時酶水解液中的單糖作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源，并向培養(yǎng)基中添加不同濃度的吐溫-80、PEG-6000、木質(zhì)素磺酸鈉，進行枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)。本試驗以吸光值（OD600）和活菌數(shù)作為評價飼用枯草芽孢桿菌發(fā)酵性能的主要指標，同時還可結(jié)合單糖消耗情況，判定菌株對培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力。

1.4.4 枯草芽孢桿菌培養(yǎng)方法

菌株活化：將保存的枯草芽孢桿菌YS01 接種到瓊脂平板培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h。

種子培養(yǎng)：挑取單菌落接種到種子培養(yǎng)基，在37 ℃、200 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)24 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：接入5%種子液于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37 ℃、200 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)24 h。

1.4.5 糖含量測定

樣品中葡萄糖、木糖含量用高效液相色譜進行分析。色譜柱為Bio-Rad Aminex HPX-87P（300 mm×7.8 mm）分析柱，檢測器為示差折光檢測器，采用5 mM的H2SO4作為流動相，流速為0.5 mL/min，樣品稀釋后過0.22 μm的水系濾膜。

1.4.6 吸光度測定以未接種的培養(yǎng)基作空白對照，取發(fā)酵液1 mL，無菌水稀釋后測定吸光度(OD600)。

1.4.7 活菌數(shù)測定

按照GB/T 13093—2006《飼料中細菌總數(shù)的測定》對活菌數(shù)進行測定。取發(fā)酵液1 mL稀釋至10-6～10-8，涂布平板計數(shù)，3 個平行，倒置培養(yǎng)24 h確定活菌數(shù)。每次試驗重復3 次，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 預處理后的楊木化學組分和結(jié)構(gòu)分析

按照文獻[4]的方法進行乙酸、乙酸-過氧化氫兩步預處理，預處理前后楊木主要成分和結(jié)構(gòu)如表1。乙酸處理可脫除部分木聚糖，低木聚糖得率明顯提高，可用于制備低聚木糖。但是疏水性高于未處理楊木，使得木質(zhì)素更易吸附纖維素酶，影響酶水解得率。乙酸預處理殘渣進行乙酸-過氧化氫兩步預處理后，木質(zhì)素大量脫除，纖維素相對含量增加，結(jié)晶度升高到64.2%，有利于酶水解。

表1 乙酸、乙酸-雙氧水預處理對楊木化學組成和結(jié)構(gòu)的影響Tab.1 Chemical compositons and structure of AC and HPAC pretreated poplar

2.2 輔助劑對楊木酶水解的影響

2.2.1β-葡萄糖苷酶對酶水解的影響

乙酸-雙氧水二次預處理楊木在水解時產(chǎn)生較高濃度的纖維二糖，抑制纖維二糖水解酶的作用，導致酶解得率降低[18-19]。因此，向水解液中加入適量β-葡萄糖苷酶可降低纖維二糖濃度，緩解其對酶解的抑制。

圖1 所示為β-葡萄糖苷酶的添加量對楊木酶解影響情況。結(jié)果表明，隨著反應時間的延長，酶水解轉(zhuǎn)化率穩(wěn)步提升，且單糖得率隨β-葡萄糖苷酶添加劑量的增加有不同幅度的增加，其中木糖得率增幅較大。加入500 nkat/g含量的β-葡萄糖苷酶水解72 h，葡萄糖和木糖得率分別從68.25%和85.85%提升到71.39%和90.57%。當β-葡萄糖苷酶含量增加到1 000 nkat/g，葡萄糖和木糖得率均為最高，分別為74.35%和95.43%，說明添加β-葡萄糖苷酶能有效促進纖維素酶解。

圖1 β-葡萄糖苷酶對楊木酶水解的影響Fig.1 Effect of β-glucosidase on the hydrolysis of pretreated poplar

2.2.2 吐溫-80 對酶水解的影響

隨后考察吐溫-80 對預處理楊木酶水解得率的影響，結(jié)果如圖2 所示。添加0.5 g/L的吐溫-80 酶水解72 h，葡萄糖得率由64.10%提升至73.01%，當添加量增加到1 g/L，葡萄糖得率進一步提升到78.85%，然而繼續(xù)增加吐溫-80 的濃度未能顯著提高葡萄糖得率。

圖2 吐溫-80 對楊木酶水解的影響Fig.2 Effect of Tween-80 on the hydrolysis of pretreated poplar

酶水解木糖得率也得到相同結(jié)果，吐溫-80 劑量為1 g/L時，酶水解72 h木糖得率最高為95.35%。另外，酶水解時間從48 h延長至72 h，半纖維素水解效率逐漸放緩，木糖得率難以提高?？紤]到吐溫-80 含量過多不利于酶的回收，且增加生產(chǎn)成本，因此，水解過程中表面活性劑吐溫-80 的最適添加量1 g/L。

2.2.3 PEG-6000 對酶水解的影響

與添加吐溫-80 的結(jié)果相似，隨著底物中非離子表面活性劑PEG-6000 含量增加，單糖得率均較未添加PEG-6000 樣品有所提高。由圖3 可知，PEG-6000濃度從0.5 g/L增加到1 g/L，酶解72 h葡萄糖得率和木糖得率均相差不大，說明微量的PEG-6000 對酶水解促進效果不顯著。但當PEG-6000 添加量增加到1.5 g/L，葡萄糖和木糖得率較未添加樣相比，分別提高了25.64%和22.99%。主要原因是PEG-6000 中的親水性基團可對纖維素酶產(chǎn)生誘導[20]，釋放活性，減少木質(zhì)素與纖維素酶之間的靜電吸引，同時PEG-6000 能夠改善固液傳質(zhì)，加速底物與酶運動[21]，從而增加底物與酶的吸附-解吸速率，提高預處理楊木酶水解效率。因此可選用1.5 g/L濃度PEG-6000 作為化學激活劑加入到酶水解試驗中。

圖3 PEG-6000 對楊木酶水解的影響Fig.3 Effect of PEG-6000 on the hydrolysis of pretreated poplar

2.2.4 木質(zhì)素磺酸鈉對酶水解的影響

考察1、5 g/L濃度木質(zhì)素磺酸鈉對楊木殘渣酶水解效率的影響，結(jié)果如圖4 所示。隨著酶水解的進行，酶水解得率快速升高。在3 種酶水解反應中，酶水解效率均在反應72 h時達到最高值。另外，5 g/L濃度的木質(zhì)素磺酸鈉單糖得率最高，葡萄糖、木糖得率分別為70.18%、94.72%，說明添加木質(zhì)素磺酸鈉對酶解反應有促進作用，酶水解后得到更多的單糖，可為木質(zhì)纖維原料的生物轉(zhuǎn)化提供能源。木質(zhì)素磺酸鈉中磺酸基團的負電子與纖維素酶中帶正電的氨基結(jié)合，形成“水包油”型膠束[22-23]，從而使纖維素與纖維素酶連接更穩(wěn)定，阻礙酶與底物接觸，提高酶水解效率。因此，選擇木質(zhì)素磺酸鈉的適宜濃度為5 g/L。

圖4 木質(zhì)素磺酸鈉對楊木酶水解的影響Fig.4 Effect of sodium lignosulfonate on the hydrolysis of pretreated poplar

2.3 表面活性劑對枯草芽孢桿菌發(fā)酵的影響

培養(yǎng)基的碳源來自未添加酶助劑時酶水解液中的葡萄糖和木糖，若在發(fā)酵過程中加入β-葡萄糖苷酶，則會與水解液發(fā)生反應，進而影響培養(yǎng)基碳源含量。因此，試驗僅探究吐溫-80、PEG-6000、木質(zhì)素磺酸鈉對枯草芽孢桿菌發(fā)酵的影響。

2.3.1 吐溫-80 對發(fā)酵的影響

向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0～5 g/L的吐溫-80，菌株具體生長情況如表2所示。由表2可知，添加0.5 g/L吐溫-80，OD600從5.74提高到6.05，活菌數(shù)達到1.12×109CFU/mL。但隨著吐溫-80濃度持續(xù)增加，OD600和活菌數(shù)均不同程度降低，菌株生長受到抑制。這可能是因為較高濃度的吐溫-80產(chǎn)生大量起泡使錐形瓶中溶氧量不足，影響菌株生長[24]。值得注意的是，菌株對葡萄糖利用情況的影響不大，說明枯草芽孢桿菌優(yōu)先以葡萄糖作為碳源營養(yǎng)物質(zhì)。

2.3.2 PEG-6000 對發(fā)酵的影響

培養(yǎng)基中添加0～5 g/L PEG-6000，枯草芽孢桿菌生長情況如表2所示。由表2可知，添加PEG-6000對楊木酶解液發(fā)酵具有抑制作用，隨著PEG-6000濃度增加，抑制作用越強，PEG-6000濃度為5 g/L時，OD600降低到3.89，木糖消耗率僅有41.88%，活菌數(shù)為3.10×107CFU/mL，遠低于空白樣（8.42×108CFU/mL）。添加PEG-6000的發(fā)酵液滲透壓增加，細胞液外滲，同時水解過程中產(chǎn)生的乙酸、糠醛等物質(zhì)與表面活性劑作用，抑制菌株的生長[25]。試驗結(jié)果與羅鵬[26]的研究報道有所差異，主要原因在于原料的化學組成和結(jié)構(gòu)不同。

2.3.3 木質(zhì)素磺酸鈉對發(fā)酵的影響

木質(zhì)素磺酸鈉屬于陰離子表面活性劑，負電性極強。向培養(yǎng)基中添加1 g/L和5 g/L木質(zhì)素磺酸鈉，枯草芽孢桿菌生長情況如表2所示。如表2可知，與吐溫-80、PEG-6000作用效果不同，木質(zhì)素磺酸鈉對水解液發(fā)酵起促進作用，添加1 g/L木質(zhì)素磺酸鈉，OD600增加到6.79，活菌數(shù)最高，可達2.10×109CFU/mL，隨著木質(zhì)素磺酸鈉劑量增加到5 g/L，活菌數(shù)略有下降，為9.62×108CFU/mL，但仍高于空白樣。水解液發(fā)酵過程中木糖消耗明顯更多，最高消耗率可達90.93%。綜合對比3種表面活性劑可知，最好的酶解助劑是木質(zhì)素磺酸鈉，既可以提升酶水解效率，還可以促進枯草芽孢桿菌的發(fā)酵生產(chǎn)。

表2 化學助劑添加量對水解液發(fā)酵影響試驗結(jié)果Tab.2 Effect of chemical additives on hydrolysate fermentationtest results

3 結(jié)論

本研究主要得出以下結(jié)論：

1）水解過程中添加適量輔助劑對預處理楊木酶水解有不同程度的促進作用，且單糖得率隨著酶水解時間延長而增加。β-葡萄糖苷酶對酶水解有明顯促進作用。與吐溫-80、木質(zhì)素磺酸鈉相比，PEG-6000 的促進效果更加顯著；

2）表面活性劑對枯草芽孢菌發(fā)酵的影響效果不同。添加0.5 g/L吐溫-80，在一定程度上有利于菌株生長，但隨著濃度的增加，對酶水解液發(fā)酵產(chǎn)生抑制作用；添加PEG-6000 會抑制菌株生長，而木質(zhì)素磺酸鈉卻對酶水解液發(fā)酵具有促進作用；

3）化學助劑對酶水解和枯草芽孢桿菌發(fā)酵的影響的綜合分析結(jié)果表明，額外補充1.5 g/L 的PEG-6000酶水解得率提升最多，添加1 g/L木質(zhì)素磺酸鈉時菌株生長效果最好。本研究結(jié)果可為楊木酶水解液制備益生菌奠定基礎。