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    當(dāng)歸補(bǔ)血湯促進(jìn)糖尿病足潰瘍體外創(chuàng)口愈合機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究

    2022-03-05 01:20:56常金霞牛少輝方毅娜曹建春張東萍
    解放軍醫(yī)藥雜志 2022年2期
    關(guān)鍵詞:血清研究

    黃 強(qiáng),常金霞,鄭 碩,牛少輝,曹 乾,方毅娜,曹建春,張東萍

    近年來,糖尿病患者日益增多,而糖尿病并發(fā)癥也成為目前醫(yī)學(xué)攻克的重點(diǎn)。糖尿病足潰瘍(diabetic foot ulcers, DFU)是糖尿病的常見嚴(yán)重慢性并發(fā)癥之一,嚴(yán)重者甚至可致殘和死亡[1-3]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn),在難愈合的糖尿病潰瘍部位存在血管生成受損、內(nèi)皮細(xì)胞及新生血管數(shù)量減少等現(xiàn)象[4]。因此,促進(jìn)血管生成過程有利于DFU的治療[5]。血管生成是一個(gè)動(dòng)態(tài)的調(diào)控過程,血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和一氧化氮(NO)是重要的調(diào)控分子[6-7]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)歸補(bǔ)血湯可降低DFU大鼠模型炎癥反應(yīng),促進(jìn)新生血管生成,從而加快創(chuàng)口愈合[8]。為進(jìn)一步探究當(dāng)歸補(bǔ)血湯促進(jìn)血管生成的分子機(jī)制,本研究采用在高糖環(huán)境下培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)作為研究對(duì)象,探究其對(duì)血管生成相關(guān)信號(hào)分子誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)和VEGF調(diào)控的影響,旨在為DFU的臨床治療提供新的策略。

    1 材料與方法

    1.1材料 雄性Wistar大鼠30只,體質(zhì)量180~190 g,購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,大鼠可自由進(jìn)食和飲水。HUVECs購自上海素冉生物科技有限公司。當(dāng)歸和黃芪來自北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院;NO測定試劑盒(碧云天生物),兔抗人VEGF抗體、兔抗人iNOS抗體均購自Abcam公司。

    1.2實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清制備:黃芪30 g、當(dāng)歸6 g,研磨至細(xì)末后加1000 ml水熬制成湯劑備用。大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為實(shí)驗(yàn)組(生藥含量4 g/kg當(dāng)歸補(bǔ)血湯灌胃)20只和空白對(duì)照組(生理鹽水)10只,灌胃體積2 ml/只,1/d,持續(xù)1周。最后一次灌胃1 h后,給予戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉,于腹主動(dòng)脈取血。室溫靜置2 h后,3500 r/min離心20 min取血清,置于56 ℃水中,水浴30 min。通過在HUVECs完全培養(yǎng)基中添加上述不同體積的血清制備0、15%、30%、60%當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清培養(yǎng)基。

    1.2.2細(xì)胞培養(yǎng):為模擬糖尿病患者血糖情況,使用高糖DMEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清培養(yǎng)HUVECs,培養(yǎng)環(huán)境設(shè)置為37 ℃,5% CO2。

    1.2.3細(xì)胞增殖檢測:MTT法測定HUVECs活力。HUVECs以2×104個(gè)/孔鋪于96孔板中。正常培養(yǎng)基中培養(yǎng),待生長至約80%融合,經(jīng)PBS清洗,分別添加0、15%、30%、60%(V/V)當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清培養(yǎng)24 h。待處理結(jié)束,吸出上層培養(yǎng)基每孔加入20 μl MTT染料,于37 ℃下孵育4 h,棄上清,加入150 μl DMSO,搖床震蕩15 min,檢測490 nm處吸光度。以最大細(xì)胞吸光度為100%,計(jì)算各孔相對(duì)增殖水平。

    1.2.4體外創(chuàng)口愈合模型:用劃痕法評(píng)價(jià)HUVECs的遷移和創(chuàng)口閉合。2×105個(gè)/孔將細(xì)胞鋪于12孔板中,培養(yǎng)過夜后,使用無菌槍頭在細(xì)胞上劃痕,PBS洗滌去除細(xì)胞碎片,更換為0、15%、30%、60%當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清的培養(yǎng)基。孵育48 h后經(jīng)ImageJ測量遷移比例。遷移比例=(1-現(xiàn)有寬度/起始寬度)×100%。以最大遷移比例作為100%,比較各組間差異。

    1.2.5NO水平測定:HUVECs于2×105個(gè)/孔平鋪于6孔板中;細(xì)胞貼壁后更改為含0、15%、30%、60%當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清培養(yǎng)基,處理48 h后,洗滌細(xì)胞,隨后根據(jù)NO檢測試劑盒說明書操作,檢測細(xì)胞內(nèi)NO含量。

    1.2.6iNOS和VEGF蛋白含量檢測:蛋白免疫印跡試驗(yàn)檢測iNOS和VEGF蛋白表達(dá)水平。SDS-PAGE電泳提取和分離總蛋白,將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,5% BSA封閉1 h,然后,將膜在4 ℃與一抗孵育過夜。兔抗人iNOS和VEGF的孵育濃度為1∶2500。孵育結(jié)束后用TBST洗滌膜,用HRP結(jié)合二抗(1∶1000)孵育1 h,TBST清洗后,經(jīng)化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)檢測。利用ImageJ軟件行定量統(tǒng)計(jì)。

    2 結(jié)果

    2.1不同濃度當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)HUVECs增殖的影響 30%和60%當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清組HUVECs相對(duì)活力高于空白對(duì)照組和15%當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清組,60%當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清組高于30%當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清組(P<0.05,P<0.01)。見圖1。

    圖1 不同濃度當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清處理HUVECs增殖情況

    2.2不同濃度當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清對(duì)HUVECs遷移的影響 30%和60%當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清組HUVECs遷移比例高于空白對(duì)照組和15%當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清組,且60%當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清組高于30%當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清組(P<0.05,P<0.01)。見圖2。

    圖2 不同濃度當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清處理HUVECs遷移比例比較

    2.3不同濃度當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清對(duì)NO的影響 30%和60%當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清組HUVECs NO相對(duì)含量高于空白對(duì)照組和15%當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清組,60%當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清組高于30%當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清組(P<0.05,P<0.01)。見圖3。

    圖3 不同濃度當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清處理HUVECs NO相對(duì)含量比較

    2.4不同濃度當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清對(duì)HUVECs iNOS和VEGF表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組比較,15%當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清組HUVECs iNOS含量升高(P<0.05)。與空白對(duì)照組和15%當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清組比較,30%和60%當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清組HUVECs VEGF和iNOS含量顯著升高(P<0.01)。與30%當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清組比較,60%當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清組HUVECs VEGF和iNOS含量升高(P<0.05)。見圖4、5。

    圖4 不同濃度當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清處理HUVECs中VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)水平

    圖5 不同濃度當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清處理HUVECs iNOS相對(duì)表達(dá)水平

    3 討論

    DFU為常見嚴(yán)重的糖尿病并發(fā)癥之一[9]。研究表明,血管再生和順暢的血液流動(dòng)性是組織修復(fù)必要環(huán)節(jié),但是通常DFU血管生成受到抑制,血液流動(dòng)性較差[10]。在本研究中,我們驗(yàn)證了當(dāng)歸補(bǔ)血湯可通過促進(jìn)NO和VEGF的合成,促進(jìn)HUVECs的增殖,加快DFU體外模型創(chuàng)口的愈合。

    當(dāng)歸補(bǔ)血湯具有保護(hù)血管內(nèi)皮、提高機(jī)體免疫、增強(qiáng)心肌收縮力、益氣生血的功效,對(duì)潰瘍、潰后膿血等具有良好的治療效果。目前,當(dāng)歸補(bǔ)血湯已被用于臨床糖尿病足患者的治療中,但其在DFU中的作用機(jī)制尚不清楚[11]。臨床研究發(fā)現(xiàn),在DFU患者中VEGF含量減少,血管豐度降低[9,12]。有研究表明,在病毒性心肌炎模型中,當(dāng)歸補(bǔ)血湯可顯著升高VEGF表達(dá)量,促進(jìn)血管再生,改善心肌缺血[13]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)歸補(bǔ)血湯可增加HUVECs VEGF的表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞遷移及體外創(chuàng)口的愈合。NO是由iNOS催化合成的血管生成物質(zhì)之一,NOS活性的增高與血管生成密切相關(guān)[14]。在炎癥狀態(tài)下iNOS高表達(dá),而使用競爭性抑制劑抑制iNOS可減少膠原沉積,阻礙創(chuàng)口愈合過程[15]。在心肌梗死模型中,當(dāng)歸補(bǔ)血湯可促進(jìn)冠狀動(dòng)脈新血管形成,其作用機(jī)制與提高VEGF和NO的含量有關(guān)[16]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)歸補(bǔ)血湯在體外創(chuàng)口愈合模型中可提高HUVECs的iNOS活性,增加NO的產(chǎn)生。綜合既往研究和本研究結(jié)果,推測當(dāng)歸補(bǔ)血湯作用靶點(diǎn)與血管生成有密切關(guān)系。但本研究僅從動(dòng)物體外模型中探究了當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)血管生成的影響。因此,當(dāng)歸補(bǔ)血湯在分子作用機(jī)制及動(dòng)物乃至人體體內(nèi)的藥效研究還有待更進(jìn)一步地深入研究。

    綜上所述,在DFU體外創(chuàng)口愈合模型中,當(dāng)歸補(bǔ)血湯可通過增加VEGF的表達(dá),促進(jìn)iNOS合成從而上調(diào)NO血管調(diào)控分子的表達(dá),加速創(chuàng)口的愈合。本研究結(jié)果進(jìn)一步豐富了當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療DFU的作用機(jī)制。

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