腸道沙門氏菌雙相亞利桑那亞種檢驗特征分析及檢驗方法比較研究

摘 要：目的：通過參加中國食品藥品檢定研究院組織的能力驗證，比對不同檢驗方法對巧克力樣品中沙門氏菌的檢出及鑒定效果，找出不同檢驗方法對樣品中不典型沙門氏菌分離及鑒定的特性，有效提升實驗室對不典型沙門氏菌檢驗?zāi)芰百|(zhì)量控制水平。方法：實驗中樣品前處理按照考核方案作業(yè)指導(dǎo)書進(jìn)行，沙門氏菌的分離按照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 沙門氏菌檢驗》（GB 4789.4—2016）要求進(jìn)行操作，通過BAX? system Q7快速篩查可疑樣品，MALDI-TOF-MS定位可疑菌株，VITEK 2 COMPACT全自動微生物分析系統(tǒng)確認(rèn)陽性菌株，MLST技術(shù)對沙門氏菌陽性菌株進(jìn)行分子生物學(xué)分型。結(jié)果：3個樣品中兩個樣品檢出沙門氏菌，樣品CODE-0695檢出鼠傷寒沙門氏菌，樣品CODE-0050未檢出沙門氏菌，樣品CODE-0542檢出腸道沙門菌雙相亞利桑那亞種。結(jié)論：實驗發(fā)現(xiàn)腸道沙門菌雙相亞利桑那亞種在顯色培養(yǎng)基上菌落形態(tài)及生化表征與常見沙門氏菌不一致，易漏檢，實際工作中應(yīng)加強(qiáng)對不典型沙門氏菌檢驗?zāi)芰Φ慕ㄔO(shè)。

關(guān)鍵詞：腸道沙門菌雙相亞利桑那亞種;菌株鑒定;血清分型;多位點序列分型;基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜

Comparative Study on Test Characteristics Analysis and Test Methods of Salmonella Enterica Subspecies Diarizonae

LIU Yang1， MA Bingcun2， LIU Zheng1， WANG Can1， QIN Yuan1， HE Qiaoling3*

（1.Sichuan Center for Medical Product Technical Inspection， Chengdu 610000， China; 2.Sichuan Institute for Drug Control， Chengdu 610000， China; 3.Sichuan Institute of? Food Inspection， Chengdu 610000， China）

Abstract： Objective： By participating in the capability test organized by China food and drug testing and Research Institute， comparison of the detection and identification effects with different testing methods on Salmonella in chocolate samples， find out the characteristics of different testing methods on the isolation and identification of atypical Salmonella in samples， and effectively improve laboratory atypical Salmonella inspection capability and quality control level. Methods： The samples pre-treatment in this experiment were carried out in accordance with the assessment plan instructions. The isolation of Salmonella was carried out according to the requirements of GB 4789.4—2016 National food safety standard-Food microbiological testing-Salmonella testing. And the suspicious samples could be screened quickly through the BAX? system Q7. Suspicious strains were located by MALDI-TOF-MS. Using VITEK 2 COMPACT automatic microbial analysis system to confirm positive strains. Then performed the molecular biology typing for positive Salmonella by MLST. Results： Salmonella was detected in two of the three samples. Salmonella typhimurium was detected in sample CODE-0695， no Salmonella was detected in sample CODE-0050. Salmonella enterica subspecies diarizonae was detected in sample CODE-0542. Conclusions： The experiment found that the colony morphology and biochemical characteristics of Salmonella enterica subspecies diarizonae in the chromogenic medium were inconsistent with common Salmonella， which could be missed detection easily. The ability to test atypical Salmonella should be strengthened in practical work .

Keywords： salmonella enterica subspecies diarizonae; identification of strains; serotyping; multilocus sequence typing; MALDI-TOF-MS

腸道沙門氏菌（Salmonella enterica）是一種常見的人畜共患病病原菌，主要傳播方式是食用被污染的食物、水及接觸帶菌者，該菌造成的食物中毒事件多發(fā)于夏季。腸道沙門氏菌造成的危害范圍覆蓋全球，在我國腸道沙門氏菌感染是造成食物中毒的主要原因之一[1]。因此，快速準(zhǔn)確地將該菌污染的食物檢出并進(jìn)行有效的分型，對確定污染源進(jìn)而采取有效措施切斷污染源頭，維護(hù)人們的飲食安全有重要意義。

實際工作中面對沙門氏菌污染的食品，傳統(tǒng)國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法雖然能準(zhǔn)確可靠的檢測出被污染樣品，但面對生化表征不典型的沙門氏菌，如腸道沙門菌雙相亞利桑那亞種（Salmonella enterica subspecies diarizonae），對檢驗人員的經(jīng)驗要求較高，且耗時較長。隨著現(xiàn)代微生物學(xué)鑒定技術(shù)的發(fā)展，分子生物學(xué)及基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）鑒定技術(shù)開始大量應(yīng)用于實際檢驗工作中，和傳統(tǒng)檢驗方法相結(jié)合，能有效提高沙門氏菌的檢出效率，減少因人員經(jīng)驗不足導(dǎo)致的漏檢[2]。此次實驗在采用傳統(tǒng)國標(biāo)進(jìn)行沙門氏菌檢驗的同時引入最新的檢驗技術(shù)，比較了不同檢驗方法的優(yōu)點及缺點，為今后實際工作中進(jìn)行非典型沙門氏菌檢驗技術(shù)的選擇提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

食品中沙門氏菌能力驗證樣品，每份考核樣品為裝有巧克力基質(zhì)的獨立樣品瓶，樣品瓶編號分別為CODE-0695、CODE-0050和CODE-0542。

大腸埃希菌（Escherichia coli）〔CMCC（B）44 102〕、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）〔CMCC（B）10 104〕、乙型副傷寒沙門菌（Salmonella paratyphi B）〔CMCC（B）50 094〕、阿貢納沙門氏菌（Salmonella agona）。

緩沖蛋白胨水（BPW）：BD;亞硒酸鹽胱氨酸（SC）增菌液、四硫磺酸鈉煌綠（TTB）增菌液、亞硫酸鉍（BS）瓊脂、沙門氏菌生化鑒定試劑盒：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;沙門氏菌顯色培養(yǎng)基：科馬嘉;營養(yǎng)瓊脂、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）：北京三藥科技開發(fā)公司;沙門氏菌屬診斷血清：寧波天潤生物藥業(yè)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1300型生物安全柜：美國賽默飛公司;KB400培養(yǎng)箱：BINDER;FORMA 311培養(yǎng)箱：Thermo fisher;滅菌器-自動高壓蒸汽：致微（廈門）儀器有限公司;均質(zhì)器400型：IUL公司;BAX? system Q7全自動病原微生物檢測系統(tǒng)：美國杜邦公司;VITEK 2 COMPACT全自動微生物分析系統(tǒng)：法國生物梅里埃公司;BX51顯微鏡：OLYMPUS;基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）：美國布魯克道爾頓公司;PCR擴(kuò)增儀：德國Eppendorf公司等。

1.3 實驗方法

按照NIFDC-PT-135巧克力中沙門氏菌檢驗作業(yè)指導(dǎo)書進(jìn)行沙門氏菌檢驗，依據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 沙門氏菌檢驗》（GB 4789.4—2016）進(jìn)行檢驗，同時輔以BAX? system Q7全自動病原微生物檢測系統(tǒng)進(jìn)行快速篩查，以基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜進(jìn)行可疑菌株鑒定，VITEK 2 COMPACT全自動微生物分析系統(tǒng)對可疑菌株進(jìn)行生化鑒定后，利用多位點序列分型（MLST）方法對沙門氏菌陽性菌株進(jìn)行分型。以阿貢納沙門氏菌作為陽性對照菌，大腸埃希菌作為陰性對照菌開展試驗。

1.3.1 樣品處理與前增菌

準(zhǔn)備90 mL預(yù)熱到45 ℃已滅菌的BPW，在生物安全柜內(nèi)無菌操作打開樣品瓶蓋，加入20 mL滅菌BPW緩沖液，蓋好瓶蓋待巧克力樣品融化后加入無菌均質(zhì)袋內(nèi)。取20 mL滅菌BPW清洗樣品瓶2次，將洗液加入無菌均質(zhì)袋內(nèi)，最后向均質(zhì)袋內(nèi)加入30 mL滅菌BPW充分均質(zhì)混勻，制成樣品稀釋液。陽性對照：取阿貢納沙門氏菌的TSB液體培養(yǎng)物稀釋液1 mL（含菌量約為50～100 CFU/mL）加入到盛有90 mL滅菌BPW增菌液的無菌均質(zhì)袋中，混勻。陰性對照同法操作?？瞻讓φ眨褐苯訉?0 mL滅菌BPW增菌液加入無菌均質(zhì)袋中。將上述各組樣品置36 ℃培養(yǎng)18 h。

1.3.2 BAX? system Q7全自動病原微生物檢測系統(tǒng)檢測

移取0.2 mL上述BPW培養(yǎng)物至10 mL腦心浸液培養(yǎng)基（BHI）中，于37 ℃培養(yǎng)3 h后移取5 μL培養(yǎng)物至盛有200 μL裂解液的裂解管中，于37 ℃金屬浴

20 min，再95 ℃金屬浴10 min，取出裂解管于4 ℃冷卻5 min，再移取50 μL裂解物到PCR反應(yīng)管中，采用BAX? system Q7全自動病原微生物檢測系統(tǒng)檢測。

1.3.3 增菌與分離

輕輕搖動混勻BPW培養(yǎng)物，移取1 mL培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于10 mL的TTB培養(yǎng)基內(nèi)，于42 ℃培養(yǎng)24 h。同時，另取1 mL培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于10 mL的SC培養(yǎng)基內(nèi)，于36 ℃培養(yǎng)24 h。分別用接種環(huán)取TTB和SC增菌液1環(huán)，劃線接種于BS瓊脂平板（36 ℃培養(yǎng)48 h）和沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基瓊脂平板（36 ℃培養(yǎng)24 h），培養(yǎng)結(jié)束后觀察平板上的菌落特征[3]。

1.3.4 基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）檢測

分別從BS、沙門氏菌顯色平板上挑取不同菌落，劃線接種于同種培養(yǎng)基進(jìn)行純化培養(yǎng)后轉(zhuǎn)接于TSA平板。挑取TSA平板上新鮮的純培養(yǎng)物，在MALDI-TOF-MS金屬靶點上涂成一個薄層，在上述靶點上覆蓋1 μL的70%甲酸水溶液并在室溫下自然晾干，然后再覆蓋1 μL的HCCA基質(zhì)并在室溫下自然晾干，采用MALDI-TOF-MS進(jìn)行鑒定（鑒定前對儀器進(jìn)行校準(zhǔn)），同時與實驗室保存的大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌、乙型副傷寒沙門圖譜進(jìn)行比對。

1.3.5 生化鑒定

根據(jù)MALDI-TOF-MS鑒定結(jié)果，挑取相應(yīng)可疑菌落，按照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 沙門氏菌檢驗》（GB 4789.4—2016）進(jìn)行生化鑒定試驗。

1.3.6 VITEK 2 COMPACT全自動微生物分析系統(tǒng)鑒定

根據(jù)MALDI-TOF-MS鑒定結(jié)果，挑取相應(yīng)可疑菌落，接種營養(yǎng)瓊脂平板，取營養(yǎng)瓊脂平板單個菌落，置于3 mL的0.45%生理鹽水的試管中，調(diào)整菌懸液濃度達(dá)到革蘭氏陰性鑒定卡要求的濁度，菌懸液加入到鑒定卡后，用VITEK 2 COMPACT全自動微生物分析系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。

1.3.7 血清學(xué)分型

按照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 沙門氏菌檢驗》（GB 4789.4—2016）進(jìn)行血清學(xué)分型。從營養(yǎng)瓊脂平板上挑取多個儀器鑒定為沙門氏菌屬的單菌落進(jìn)行血清反應(yīng)，根據(jù)上述反應(yīng)結(jié)果，查沙門氏菌抗原表，得出分型結(jié)果。

1.3.8 MLST分型

實驗中采用MLST數(shù)據(jù)庫（https：//enterobase.warwick.ac.uk/）提供的腸道沙門氏菌多位點序列分型引物和擴(kuò)增程序，對實驗中分離陽性菌株的7個等位基因（aroC、thrA、purE、dnaN、sucA、hisD 和hemD）進(jìn)行擴(kuò)增并測序。將獲得的等位基因序列輸入MLST數(shù)據(jù)庫分析待測菌株序列型（Sequence Type，ST）[4-6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 BAX?system Q7全自動病原微生物檢測系統(tǒng)檢測結(jié)果

BAX? system Q7檢測結(jié)果如表1所示，CODE-0695、CODE-0542和陽性對照檢出沙門氏菌，CODE-0050和陰性對照未檢出沙門氏菌。實驗中發(fā)現(xiàn)直接將樣品BPW培養(yǎng)物進(jìn)行BAX? system Q7檢測，儀器無法給出檢驗結(jié)果，這可能是樣品中巧克力基質(zhì)干擾PCR反應(yīng)造成的。將樣品BPW培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到BHI培養(yǎng)基培養(yǎng)后進(jìn)行BAX? system Q7檢測，儀器可以得出正確結(jié)果。因此BAX? system Q7可以快速確定樣品中是否含有沙門氏菌，為后面進(jìn)一步開展確認(rèn)實驗提供了參考。

2.2 不同菌株在篩選平板上的菌落特征

將TTB、SC培養(yǎng)物劃線于BS和沙門氏菌顯色培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果如表2所示。樣品CODE-0695和陽性對照在BS瓊脂平板和沙門氏菌顯色培養(yǎng)基上顯示典型的沙門氏菌菌落形態(tài)特征，判斷為可疑沙門氏菌。樣品CODE-0050在BS瓊脂平板分離出藍(lán)綠色光滑菌落，在沙門顯色培養(yǎng)基分離出乳白色圓形光滑菌落，樣品CODE 0542在BS瓊脂平板分離出黑色圓形菌落，在沙門顯色培養(yǎng)基分離出藍(lán)色光滑圓形菌落，以上兩個樣品在篩選平板菌落特征均不顯著，應(yīng)進(jìn)一步開展確認(rèn)實驗。

2.3 基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）對可疑菌株鑒定

挑取不同樣品TSA培養(yǎng)基上新鮮的純培養(yǎng)物進(jìn)行MALDI-TOF-MS鑒定，結(jié)果如表3所示。3個樣品中CODE-0695、CODE-0542及陽性對照均檢出沙門氏菌，同BAX? system Q7檢測結(jié)果一致。比較不同菌株鑒定圖譜，具體見圖1，可以看出銅綠假單胞菌和沙門氏菌圖譜有明顯區(qū)別，大腸埃希氏菌和沙門氏菌圖譜比較相似。由表4可知，實驗中儀器能準(zhǔn)確將沙門氏菌、大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌鑒定出來，且鑒定評估分?jǐn)?shù)均在2.4分以上。根據(jù)鑒定結(jié)果顯示MALDI-TOF-MS只能將上述兩種不同血清型的沙門氏菌鑒定到屬，無法鑒定出相應(yīng)沙門氏菌的血清型。

2.4 生化鑒定結(jié)果

將樣品中MALDI-TOF-MS鑒定結(jié)果為沙門氏菌陽性的菌落及樣品CODE-0050中生長的菌落進(jìn)一步純化進(jìn)行生化鑒定，結(jié)果如表5所示。樣品CODE-0695篩選菌株生化鑒定結(jié)果與陽性對照結(jié)果一致，均符合GB 4789.4—2016中沙門氏菌生化反應(yīng)特征;樣品CODE-0050生化鑒定結(jié)果不符合GB 4789.4—2016中沙門氏菌生化反應(yīng)特征。因此可以判斷樣品CODE-0695檢出沙門氏菌，樣品CODE 0050未檢出沙門氏菌，檢驗結(jié)果和BAX? system Q7、MALDI-TOF-MS一致。樣品CODE-0542需進(jìn)一步進(jìn)行生化鑒定。

2.5 VITEK 2 COMPACT全自動微生物分析系統(tǒng)對可疑菌株的鑒定結(jié)果

將篩選出的可疑沙門氏菌陽性菌株進(jìn)行VITEK 2 COMPACT全自動微生物分析系統(tǒng)鑒定，結(jié)果如表6所示。樣品CODE 0695、CODE 0542均檢出沙門氏菌，其中CODE 0695鑒定結(jié)果為沙門菌屬，需進(jìn)一步進(jìn)行補充實驗，才能確定為哪一種血清型沙門氏菌，而樣品CODE 0542可通過該儀器直接鑒定為為腸道沙門氏菌雙相亞利桑那亞種，其生化反應(yīng)結(jié)果如表7所示。

2.6 血清型分型結(jié)果

將篩選出的陽性菌株純化后進(jìn)行血清型實驗，結(jié)果如表8所示。樣品CODE-0695培養(yǎng)物自凝實驗：無自凝，A-F O多價為陽性，O抗原：O4為陽性，O12為陽性，H抗原第1相：i為陽性，H抗原第2相：2為陽性;根據(jù)上述反應(yīng)結(jié)果，查詢沙門氏菌抗原表鑒定為鼠傷寒沙門氏菌（S.Typhimurium）。CODE 0542培養(yǎng)物自凝實驗：無自凝，A-F O多價為陰性，通過實驗室現(xiàn)有血清無法判定其血清型。

2.7 多位點序列分型（MLST）對沙門氏菌陽性菌株進(jìn)行分子生物學(xué)分型結(jié)果

將樣品CODE-0695、CODE0-0542陽性菌株的7個等位基因測序，經(jīng)MLST數(shù)據(jù)庫比對分析結(jié)果如表9所示，陽性菌株ST型分別為ST19、ST63。其中ST19抗原式為1，4，12︰i︰1，2，血清型為鼠傷寒沙門氏菌，與本實驗血清型鑒定結(jié)果一致;ST63抗原式為60︰r︰e，n，x，z15，鑒定結(jié)果為腸道沙門菌Ⅲb亞種（腸道沙門菌雙相亞利桑那亞種）[2]，與本實驗VITEK 2 COMPACT全自動微生物分析系統(tǒng)鑒定結(jié)果一致。

3 結(jié)論與討論

本次實驗通過分析腸道沙門菌雙相亞利桑那亞種的生化特征及不同檢驗方法的檢測特性，總結(jié)出以下幾點經(jīng)驗為今后的一線檢驗工作提供參考。

（1）檢驗中通過對樣品BPW培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接BHI培養(yǎng)基能有效避免巧克力基質(zhì)對PCR反應(yīng)的干擾，利用BAX? system Q7可以在30 h內(nèi)準(zhǔn)確快速的篩查出可疑陽性樣品，為后續(xù)實驗提供了參考。

（2）實驗發(fā)現(xiàn)腸道沙門菌雙相亞利桑那亞種在沙門氏菌顯色平板上菌落特征及生化鑒定反應(yīng)不典型，容易造成漏檢。實驗中使用不同篩選平板，挑選不典型菌落結(jié)合BAX? system Q7及MALDI-TOF-MS等檢驗方法能有效降低漏檢風(fēng)險。

（3）利用MALDI-TOF-MS高通量、快速鑒定的特點，對篩選平板上生長的各類型菌株純化后進(jìn)行鑒定，可快速、精準(zhǔn)定位可疑的沙門氏菌菌落，有效降低沙門氏菌陽性菌落在篩選平板上特征不典型造成漏檢的風(fēng)險，為后期的生化鑒定提供了參考。比較MALDI-TOF-MS實驗結(jié)果，該系統(tǒng)可以將沙門氏菌、大腸桿菌及銅綠假單胞菌有效鑒定區(qū)分，但無法指出沙門氏菌具體血清型，但該系統(tǒng)快速、高通量篩選出陽性沙門氏菌菌落的能力是其他鑒定手段暫時無法比擬的。

（4）實驗中由于腸道沙門菌雙相亞利桑那亞種血清凝集試驗A-F O多價為陰性，很多實驗室不一定常備相關(guān)的鑒定血清，通過MLST分型技術(shù)能有效的彌補實驗室血清缺失造成無法分型的困境。

（5）比較VITEK 2 COMPACT全自動微生物分析系統(tǒng)對不同沙門氏菌的鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該系統(tǒng)可以鑒定出腸道沙門菌雙相亞利桑那亞種，鑒定結(jié)果同MLST結(jié)果一致，但無法對鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)行分型鑒定，系統(tǒng)提示需要做補充生化實驗。

此次實驗，在采用傳統(tǒng)國標(biāo)檢驗方法的基礎(chǔ)上，結(jié)合現(xiàn)代檢驗儀器及分子分型，分析了腸道沙門菌雙相亞利桑那亞種的生化特征，比對了不同檢測方法對該菌的檢測特性，不僅有效地提高了檢驗效率，縮短了檢驗時間也提高了檢驗的準(zhǔn)確性降低了漏檢的可能，為今后更好地開展食品中非典型沙門氏菌檢驗，防止漏檢提供了參考。

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