煙草米根霉致病力及不同滲透壓和p H環(huán)境下的代謝表型特征分析

陳乾麗，汪漢成，黃 洋，李文紅，蔡劉體，譚清群，陳興江，李 忠

1.貴州省煙草科學(xué)研究院，貴陽市觀山湖區(qū)龍灘壩路29號 550081

2.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴陽市花溪區(qū)甲秀南路 550025

3.四川中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，成都市錦江區(qū)成龍大道一段56號 610066

4.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，貴陽市花溪區(qū)金竹鎮(zhèn) 550006

煙葉霉?fàn)€?。═obacco pole rot）是煙葉在烘烤期間發(fā)生的一種真菌性病害，具有爆發(fā)性強(qiáng)和危害性大的特點(diǎn)［1］，可引起烘烤期間煙葉嚴(yán)重霉變，造成煙葉產(chǎn)質(zhì)量損失［2-3］，在我國云南、貴州和福建等煙區(qū)均有發(fā)生和危害［4-7］。該病害由米根霉（Rhizopus oryzae）引起，是一種繁殖速度快、耐熱性強(qiáng)的真菌，可以在適宜環(huán)境條件下攝取煙葉營養(yǎng)物質(zhì)，破壞煙葉組織［8］。在煙葉烘烤期間，米根霉主要危害葉柄，也可侵染葉片［6-7］。受烤房溫濕度影響，米根霉在不同烘烤階段和烤房部位常表現(xiàn)出不同的侵染能力。米根霉侵染能力與病原菌的致病力及煙葉所處的環(huán)境條件密切相關(guān)［9］。關(guān)于煙葉霉?fàn)€病危害溫度范圍已有一些報(bào)道，Gayed［10］研究發(fā)現(xiàn)，煙葉霉?fàn)€病菌在25~37℃時生長繁殖較快，高于40℃時生長減緩；陳二龍等［11］試驗(yàn)提出，烤房易發(fā)生煙葉霉?fàn)€病的溫度范圍為32~42℃；蘇家恩等［12］研究認(rèn)為，煙葉霉?fàn)€病終止危害溫度在45℃左右。但有關(guān)溫度、煙葉成熟度、外源創(chuàng)傷對米根霉致病力的影響尚不明確，病原菌的滲透壓和pH環(huán)境也不清楚。為此，以米根霉為研究對象，對其可致病的溫度范圍進(jìn)行測定，同時對不同成熟度煙葉以及創(chuàng)傷對其致病力的影響進(jìn)行了檢測，并應(yīng)用微生物代謝表型技術(shù)（Biolog）分析了不同滲透壓和pH環(huán)境下米根霉的代謝表型，旨在確定影響米根霉致病力的關(guān)鍵溫度范圍及不同滲透壓及pH環(huán)境下病原菌的適應(yīng)能力，為煙葉霉?fàn)€病的有效防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株與煙草品種：米根霉菌株Y5（CCTCC M 2015720），由貴州省煙草科學(xué)研究院微生物實(shí)驗(yàn)室分離獲得，供試煙草品種為云煙87。

供試培養(yǎng)基與試劑：采用PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15~20 g、蒸餾水1 000 mL）培養(yǎng)米根霉。Biolog PM 9滲透壓代謝板（#12161）、PM 10 pH代謝板（#12162）、接種液FF-IF（#72106），OmniLog PM系統(tǒng)（91171）、濁度測定儀（3531）、Turbidimeter（3531）及多通道電動移液器（3501A），均購自美國Biolog公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同溫度條件下米根霉致病力的測定

米根霉于PDA培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)48 h，用7 mm打孔器打取菌碟，將菌碟置于煙草離體葉片上，以未接菌培養(yǎng)基為對照。接菌后將葉片置于不同溫度（20℃、25℃、30℃、35℃、38℃和45℃）環(huán)境下培養(yǎng)，分別于接菌后24 h和48 h時觀察葉片發(fā)病情況，測量病斑直徑，并計(jì)算病斑面積。

1.2.2 米根霉對葉柄和葉片致病力的測定

在PDA平板上制備米根霉菌碟（直徑7 mm），將菌碟分別置于煙葉葉柄與葉片上。接菌后的煙葉置于相對濕度（RH）80%和38℃的環(huán)境下培養(yǎng)，分別于接菌后24 h和48 h時觀察煙葉葉柄和葉片的發(fā)病情況，并測量病斑的直徑，計(jì)算病斑面積。

1.2.3 創(chuàng)傷對米根霉致病力影響的測定

制備米根霉菌碟（直徑7 mm），將菌碟分別置于有創(chuàng)傷與無創(chuàng)傷的煙葉上。接菌后將葉片置于RH 80%和38℃的環(huán)境下培養(yǎng)，于接菌后24 h和48 h觀察葉片發(fā)病情況，并測量病斑直徑，計(jì)算病斑面積。

1.2.4 米根霉對不同葉位煙葉致病力的測定

將米根霉菌碟分別置于不同部位的離體葉片（頂葉、上二棚、腰葉、下二棚和腳葉）上。接菌后將葉片置于RH 80%和38℃的環(huán)境下培養(yǎng)，分別于接菌后24 h和48 h觀察葉片發(fā)病情況，并測量病斑直徑，計(jì)算病斑面積。

1.2.5 不同滲透壓和pH環(huán)境下米根霉代謝特征分析

參照Biolog標(biāo)準(zhǔn)程序［13-15］對煙葉米根霉的滲透壓和pH環(huán)境下的代謝表型進(jìn)行分析。將供試菌株在PDA平板上25℃培養(yǎng)48 h，直至產(chǎn)生大量孢子。用無菌水潤濕無菌棉簽，在菌落表面旋轉(zhuǎn)蘸取孢子，將其定容至12 mL的FF-IF接種液中，將孢子懸浮液濃度調(diào)至62%T（T為Biolog標(biāo)準(zhǔn)濃度單位）。吸取600μL孢子懸浮液添加至22.24 mL的PM 9和PM 10接種液中，制備混合接種液，將混合接種液加入PM 9和PM 10代謝板中。將接菌后的代謝板置于35℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 d。設(shè)置OmniLog工作軟件Biolog D5E_OKA_data.exe，記錄米根霉生長過程中代謝板孔內(nèi)的顏色變化值，采用Biolog OL_FM_1.2.exe軟件進(jìn)行顏色值轉(zhuǎn)換，用Biolog OL_PR_1.2.exe軟件分析其代謝特征。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對米根霉致病力的影響

致病力測定結(jié)果（圖1）表明，在20℃~45℃測試溫度范圍內(nèi)，米根霉可致病溫度范圍為20℃~38℃。20℃時，接菌后48 h時離體葉片開始發(fā)病；25℃~38℃處理，接菌后24 h時葉片發(fā)病；38℃時，病斑擴(kuò)展速度最快。

圖1 溫度對米根霉致病力的影響Fig.1 Effects of temperature on pathogenicity of Rhizopus oryzae

2.2 米根霉對葉柄和葉片的致病力

煙草離體葉片的葉柄和葉片組織接種米根霉后均可發(fā)病，接種后24 h時葉柄和葉片的平均病斑面積分別為4.33 cm2和1.65 cm2，接種后48 h時葉柄和葉片的平均病斑面積分別為13.5 cm2和3.72 cm2。

2.3 創(chuàng)傷對米根霉致病力的影響

創(chuàng)傷對米根霉致病力的影響較大，煙葉存在創(chuàng)傷時米根霉更容易侵染。接種后24 h時，創(chuàng)傷和無創(chuàng)傷煙葉的平均病斑面積分別為5.01 cm2和0.60 cm2，接種后48 h時的平均病斑面積分別為12.68 cm2和3.31 cm2。

2.4 米根霉對不同葉位煙葉的致病力

米根霉對不同葉位煙葉均具有致病力，見表1。葉位自下向上，葉片發(fā)病面積隨葉位的增加而逐漸減小。腳葉的病斑擴(kuò)展速度最快，頂葉的病斑擴(kuò)展速度最慢，可見米根霉對底部葉片的致病力最強(qiáng)。

表1 米根霉對不同葉位煙葉致病力的影響①Tab.1 Effects of stalk position on pathogenicity of Rhizopus oryzae to tobacco leaves

2.5 不同滲透壓和p H環(huán)境下米根霉的代謝特征

米根霉在Biolog PM 9和PM 10代謝板上的滲透壓和pH環(huán)境下的代謝表型特征見圖2。米根霉具有廣泛的滲透壓和pH環(huán)境適應(yīng)能力，能在83種滲透壓環(huán)境下生長，包括1%~10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）氯化鈉、3%~6%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）氯化鉀、2%~5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）硫酸鈉、5%~20%（體積分?jǐn)?shù)）乙二醇、1%~2%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）甲酸鈉、2%~3%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）尿素、1%~12%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）乳酸鈉、20~200 mmol·L-1的磷酸鈉（pH 7）、10~100 mmol·L-1的硫酸銨（pH 8）、10~100 mmol·L-1的硝酸鈉、10~100 mmol·L-1的亞硝酸鈉，6%氯化鈉及6%氯化鈉與甜菜堿、氯化鉀、肌氨酸、二甲基磺?；猁}、丙磺酸、四氫嘧啶、膽堿、磷酸膽堿、肌酸、肌酐、左旋肉堿分別共存的滲透壓環(huán)境中生長；不能在3%~6%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）甲酸鈉、4%~7%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）尿素及20~200 mmol·L-1苯甲酸鈉（pH 5.2）的環(huán)境中生長，見表2。

表2 （續(xù)）

圖2 米根霉在Biolog PM 9和PM 10代謝板上的代謝特征Fig.2 Metabolic characteristics of Rhizopus oryzae on Biolog PM 9 and PM 10 microplates

表2 米根霉在不同滲透壓環(huán)境下的代謝表型特征①Tab.2 Metabolic characteristics of Rhizopus oryzae in different osmotic environments

米根霉能在86種pH環(huán)境下正常生長，包括pH環(huán)境3.5~10.0，pH 4.5時能在與L-丙氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酸、L-谷酰胺等35類物質(zhì)分別共存的環(huán)境中生長，pH 9.5時能在與L-丙氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酸、L-谷酰胺、L-蛋氨酸、L-脯氨酸、L-酪氨酸、鄰氨基苯甲酸、色胺、氧化三甲胺、尿素，及辛酯酶、葡萄糖苷、半乳糖苷、葡糖苷酸、氨基葡糖苷、氨基半乳糖苷、甘露糖苷、磷酸鹽和硫酸鹽等分別共存的環(huán)境中生長，pH 9.5時不能在與L-天門冬酰胺、L-天冬氨酸、甘氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-蛋氨酸、L-苯基丙氨酸、L-蘇氨酸分別共存的環(huán)境中生長，見表3。

表3 （續(xù)）

表3 米根霉在不同pH環(huán)境下的代謝表型特征Tab.3 Metabolic phenotypic characteristics of Rhizopus oryzae under different p Hs

3 討論

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，煙葉米根霉的最低致病溫度為20℃，最強(qiáng)致病力溫度為38℃，在45℃條件下不能侵染煙葉，這與陳二龍等［11］的研究結(jié)果基本一致。不同溫度條件下米根霉的致病力變化趨勢與其生長速率的變化趨勢相似，病害潛伏期隨溫度升高而縮短，在45℃時致病力下降，這與溫度對米根霉菌絲生長速率的影響一致［10］。

本試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)米根霉侵染不同葉位的煙葉時病斑擴(kuò)展速度存在差異，頂葉病斑擴(kuò)展最慢，腳葉病斑擴(kuò)展最快，上二棚葉、腰葉和下二棚煙葉間無明顯差異。由于不同葉位煙葉的成熟度不同［16］，推測米根霉致病力與煙葉成熟度密切相關(guān)，還有待進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。此外，試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)米根霉接種后，煙葉葉柄和葉片組織均發(fā)生霉?fàn)€，但煙葉存在創(chuàng)傷時煙葉霉?fàn)€速度更快，無創(chuàng)傷時霉變速度相對較慢。這與烘烤期間煙葉霉?fàn)€病從葉柄創(chuàng)傷處開始發(fā)生，沿著葉基逐漸向葉片主脈、側(cè)脈及葉肉擴(kuò)展的現(xiàn)象一致［17］，推測葉柄創(chuàng)傷為米根霉侵染創(chuàng)造了有利條件。煙草霉變通常是微生物、環(huán)境和寄主等多因素互作的結(jié)果，其中溫度與濕度是重要的影響因子。本試驗(yàn)中僅測定了溫度對米根霉致病力的影響，而有關(guān)米根霉的可致病濕度范圍，以及多種因素交互作用模式下煙葉霉?fàn)€病的發(fā)生發(fā)展規(guī)律還有待進(jìn)一步研究。

本研究中，基于Biolog代謝表型技術(shù)測定了米根霉可生長和產(chǎn)孢的pH范圍在3.5~10.0之間，當(dāng)pH為4.5時，米根霉能代謝大部分被測試的氨基酸；當(dāng)pH為9.5時，不能代謝大部分被測試的氨基酸，表明米根霉具有較強(qiáng)的脫羧酶活性和較弱的脫胺酶活性。這與米根霉在發(fā)酵工程上的應(yīng)用結(jié)果一致［18］。米根霉對不同滲透壓物質(zhì)表現(xiàn)出不同的代謝活性，反映了米根霉在不同逆境條件下的環(huán)境適應(yīng)力，如≥3%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）甲酸鈉、≥4%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）尿素、≥20 mmol·L-1苯甲酸鈉等均不能生長和產(chǎn)孢。因此通過施用不同濃度滲透壓物質(zhì)控制煙葉霉?fàn)€和減輕危害具有潛力，但還有待進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

4 結(jié)論

米根霉的可致病的溫度范圍為20℃~38℃，45℃時無致病力；煙葉葉柄創(chuàng)傷有利于病原菌的侵染，米根霉對煙株下部葉的致病力大于上部葉；米根霉具有廣泛的滲透壓和pH適應(yīng)能力，能在1%~10%氯化鈉、3%~6%氯化鉀、2%~5%硫酸鈉、5%~20%乙二醇等滲透環(huán)境中正常生長，不能在3%~6%甲酸鈉、4%~7%尿素的滲透環(huán)境中生長；米根霉適應(yīng)pH范圍為3.5~10.0，最適pH約為7.0；米根霉具有較強(qiáng)的脫羧酶活性和較弱的脫胺酶活性。