煙草赤星病病原長柄鏈格孢菌快速檢測膠體金試紙條的研制

紀(jì) 元，胡利偉，蔡憲杰，許成悅，范子彥，師默聞，唐綱嶺，鄧惠敏*，閆 鼎*

1.國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)翠竹街6號(hào) 450001

2.中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2號(hào) 450001

3.上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司，上海市長陽路717號(hào) 200082

長柄鏈格孢菌（Alternaria longipes）是鏈格孢屬（Alternaria）真菌，也是引起煙草赤星病的主要病原菌［1］。多個(gè)國家曾報(bào)道過煙草赤星病的爆發(fā)，在我國各煙區(qū)也均有赤星病的發(fā)生，造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失［2-4］。目前赤星病主要通過捕捉田間赤星病原孢子來預(yù)警，該方法需要相應(yīng)的設(shè)備，準(zhǔn)確性較低，檢測用時(shí)較長，赤星病一旦發(fā)生則很難控制。因此，建立一種經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確和快速的煙草赤星病檢測方法，在疾病發(fā)生早期檢測煙草幼苗或葉片中的鏈格孢菌，對(duì)赤星病的綠色防控尤為重要。

檢測鏈格孢菌的傳統(tǒng)方法包括形態(tài)學(xué)法［5-6］、化學(xué)分析法［7-8］、分子檢測法［9-10］和免疫檢測法［11-12］等。其中形態(tài)學(xué)法采用微生物培養(yǎng)手段，要求微生物必須是可培養(yǎng)的，耗時(shí)長且對(duì)操作者的專業(yè)性要求高?；瘜W(xué)分析法是對(duì)微生物特定成分進(jìn)行檢測，無需對(duì)微生物進(jìn)行培養(yǎng)，雖靈敏度高，但由于該方法的檢測儀器不便攜帶，不適用于現(xiàn)場快速檢測。而膠體金免疫層析技術(shù)結(jié)合抗原抗體特異性識(shí)別和微流層析技術(shù)，具有操作簡單、檢測速度快、不受檢測設(shè)備和試劑限制等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)療等行業(yè)［13-15］。Huang等［16］研制的膠體金免疫層析試紙條成功應(yīng)用于水稻條紋病毒的快速檢測，該檢測準(zhǔn)確性高，特異性好。此外，多個(gè)公司制備了檢測血清中抗新型冠狀病毒IgG/IgM抗體的膠體金試紙條，與ELISA結(jié)果比較具有一致的特異性和準(zhǔn)確性，不僅適用于家庭檢測，也適用于醫(yī)院的即時(shí)檢驗(yàn)（Point-of-care testing）［17］。然而，目前還未見針對(duì)鏈格孢菌的膠體金快速檢測試紙條的文獻(xiàn)報(bào)道和商品化的快速檢驗(yàn)試劑盒。

為此，通過將小鼠抗長柄鏈格孢菌單克隆抗體進(jìn)行膠體金標(biāo)記，研制能夠靈敏且特異性地檢測長柄鏈格孢菌的膠體金試紙條，旨在實(shí)現(xiàn)煙葉生產(chǎn)中赤星病的快速檢測和識(shí)別，為赤星病的有效防控提供準(zhǔn)確、及時(shí)的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

主要試劑耗材：牛血清白蛋白（BSA）、檸檬酸三鈉、氯金酸、吐溫80、生物素（美國Sigma-Aldrich公司）。Amicon?親和濃度試劑盒蛋白A（美國Merck Millipore公司）。硝酸纖維素膜（德國Sartouris公司）。吸水濾紙、玻璃纖維紙、聚酯纖維紙和PVC板（上海捷寧生物科技有限公司）。

菌株：長柄鏈格孢菌分離自昆明祿勸，由云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。菌落被接種在含10%（體積分?jǐn)?shù)）新鮮煙葉提取物的馬鈴薯葡萄糖（PDA）培養(yǎng)基上，26°C培養(yǎng)7 d。大腸桿菌（Escherichia coli）、根黑腐串珠霉菌（Thielaviopsis basicola）、煙草黑脛病菌（Phytophthora nicotianae）和疣孢青霉菌（Penicillium verruculosum）來自鄭州煙草研究院生態(tài)環(huán)境與煙葉質(zhì)量重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus）、煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus）和馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y）陽性對(duì)照購自美國Agdia公司。

主要儀器：Megafuge 8R離心機(jī)（美國Thermo Fisher Scientific公司），劃膜噴金標(biāo)機(jī)HGS510和切條機(jī)HGS201（杭州峰航科技有限公司），雙穩(wěn)定時(shí)電泳儀PAC3000（美國Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 長柄鏈格孢菌抗原的制備

將長柄鏈格孢菌菌絲超聲處理15 min，離心后將沉淀進(jìn)行液氮研磨，再次超聲處理后，13 700×g離心10 min，將上清液超濾濃縮，得鏈格孢菌蛋白1。

將長柄鏈格孢菌菌絲進(jìn)行液氮研磨，取1 g粉末溶于NS2T裂解液，置于冰上超聲10 min。1L NS2T裂解液的配方為0.1 mol Tris-HCl、0.1 mol NaCl、0.5 mol蔗糖、0.01 mol EDTA、2.4 mmol脫氧膽酸鈉、3 g Triton X-100、4.9 mmol 3-［3-（膽酰胺丙基）二甲基銨］-1-丙磺酸內(nèi)鹽（CHAPS）、0.01 mol 3-（環(huán)己氨基）2-羥基-1-丙磺酸（CAPSO）、1 mmol蛋白酶抑制劑雞尾酒、2 mmol苯甲基磺酰氟（PMSF）、10 mmol二硫蘇糖醇（DTT）。裂解物13 700×g轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清得鏈格孢菌蛋白2。將蛋白裂解液與上樣緩沖液混合后進(jìn)行SDS-PAGE檢測，考馬斯亮藍(lán)染膠。

將2 g長柄鏈格孢菌菌絲液氮研磨，加入4 mL磷酸鹽緩沖液（PBS）后超聲處理15 min，13 700×g轉(zhuǎn)速下離心10 min獲得鏈格孢菌蛋白3。

1.2.2 單克隆抗體的制備和純化

50μg長柄鏈格孢菌菌絲裂解液與弗氏完全佐劑充分乳化后分別皮下注射2只6~8周齡的BALB/c雌鼠（北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司），之后菌絲裂解液與弗氏不完全佐劑混合并免疫小鼠3次，每次間隔為2周。最后一次免疫完成1周后，取小鼠血清采用間接競爭ELISA法進(jìn)行效價(jià)檢測［18］。細(xì)胞融合3 d前，將50μg菌絲裂解液與PBS混合，對(duì)小鼠進(jìn)行免疫沖擊。將小鼠胰臟細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞以10∶1混合，接種在96孔板中［19］。以長柄鏈格孢菌裂解蛋白為抗原，采用間接競爭ELISA和蛋白質(zhì)電泳法篩選雜交瘤細(xì)胞株［20］，選取高滴度的細(xì)胞株進(jìn)行2次亞克隆。采用體內(nèi)誘生法制備腹水，向BALB/c小鼠腹腔注入滅菌液狀石蠟（0.5 mL/只），7 d后將約5×105個(gè)雜交瘤細(xì)胞注射到小鼠腹腔中。根據(jù)制造商提供的使用說明，利用蛋白A親和層析柱進(jìn)行抗體純化。純化后的抗體通過間接競爭ELISA和蛋白質(zhì)電泳法對(duì)其特異性進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.3 膠體金檢測試紙條的制備

1.2.3.1 膠體金標(biāo)記單克隆抗體

采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金。將100 mL 0.3 mmol/L氯金酸溶液加熱至沸騰，邊攪拌邊加入檸檬酸三鈉溶液0.04 mol/L）至溶液呈透亮的酒紅色，用碳酸鉀溶液將pH調(diào)整為7.2。按每毫升膠體金溶液加入6~16μg單克隆抗體，加BSA至終濃度為1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。以13 700×g轉(zhuǎn)速4°C離心40 min，將沉淀用復(fù)溶緩沖液［含0.2%BSA、0.1%（體積分?jǐn)?shù)）吐溫80的0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.2］重懸，4°C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2 結(jié)合物釋放墊制備

將玻璃纖維釋放墊浸潤于Tris緩沖液（pH 7.4）中，37°C干燥。使用噴膜儀將標(biāo)有膠體金的長柄鏈格孢菌單克隆抗體和IgY噴涂在結(jié)合物釋放墊上，37°C干燥后取出備用。

1.2.3.3 反應(yīng)膜制備

將長柄鏈格孢菌單克隆抗體捕獲抗體包被到反應(yīng)膜上形成檢測線（T），將山羊抗雞抗體包被在反應(yīng)膜上構(gòu)成質(zhì)控線（C）。

1.2.3.4 試紙條組裝

在PVC底板上依次粘貼樣品吸收墊、噴涂有標(biāo)記長柄鏈格孢菌抗體的膠體金和IgY的結(jié)合墊、噴涂有長柄鏈格孢菌抗體和山羊抗雞二抗的反應(yīng)膜、吸水墊，切成3.5 mm的寬度的試紙條后裝入卡殼，試紙條結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 長柄鏈格孢菌檢測試紙條結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic illustration of test strips for the detection of A.longipes

1.2.4 測試方法與檢測結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)

稱取約0.3 g樣品至1.5 mL離心管中，加入1 mL PBST（含10 mmol/L PBS，1%吐溫20，0.6 mol/L NaCl），搖晃后靜置5 min。取上清液0.1 mL至點(diǎn)樣孔中，等待10 min后觀察結(jié)果。

判斷標(biāo)準(zhǔn)：如圖2所示，C線顯色，T線不顯色，表示樣品中長柄鏈格孢菌數(shù)量低于檢測限，即為陰性。C線和T線均顯色，表示樣品中長柄鏈格孢菌數(shù)量等于或高于檢測限，即為陽性。C線不顯色，表示操作不正確或試紙條已失效。

圖2 快速檢測試紙條判斷標(biāo)準(zhǔn)Fig.2 Criteria for rapid detection by test strips

2 結(jié)果與分析

2.1 單克隆抗體制備和評(píng)價(jià)

如圖3所示，長柄鏈格孢菌菌絲裂解液經(jīng)SDS-PAGE分離，主要條帶出現(xiàn)在120、70、38 kDa附近。裂解液與弗氏完全佐劑乳化后免疫小鼠制備單克隆抗體。

圖3 長柄鏈格孢菌蛋白裂解液SDS-PAGE結(jié)果Fig.3 SDS-PAGE analysis of A.longipes protein lysates

使用長柄鏈格孢菌菌絲裂解液免疫BALB/c小鼠，對(duì)小鼠血清中的抗體滴度進(jìn)行檢測。如圖4a所示，與對(duì)照相比，小鼠1和2的血清在450 nm處吸光度明顯高于空白小鼠，說明長柄鏈格孢菌菌絲裂解液作為免疫原誘導(dǎo)抗體效價(jià)較高。因此，選取長柄鏈格孢菌菌絲裂解液免疫的小鼠進(jìn)行單克隆抗體制備，并用蛋白質(zhì)電泳對(duì)腹水純化的抗體進(jìn)行檢測。如圖4b所示，僅在25 kDa和50 kDa有2個(gè)條帶，分別對(duì)應(yīng)IgG的輕鏈和重鏈，說明抗體已經(jīng)被制備并純化。利用ELISA對(duì)抗體效價(jià)進(jìn)行評(píng)價(jià)，包被原為鏈格孢菌蛋白1、2、3，除了蛋白3，抗體對(duì)蛋白1和2響應(yīng)良好（圖4c）。

圖4 單克隆抗體的評(píng)價(jià)Fig.4 Evaluation of the monoclonal antibody

2.2 條件優(yōu)化

為確定結(jié)合墊噴金量，按每厘米結(jié)合墊噴涂1.5、2.0、2.5μL金標(biāo)抗體的噴金量分別將鏈格孢菌蛋白2稀釋1×103倍和1×105倍，檢測結(jié)果見圖5。噴金量為1.5或2.0μL/cm時(shí)試紙條可識(shí)別鏈格孢菌，且噴金量為2.0μL/cm時(shí)信號(hào)更強(qiáng)；當(dāng)噴金量為2.5 μL/cm時(shí)C線有非特異性吸附。因此，選擇噴金量為2.0μL/cm。

圖5 結(jié)合墊噴金量優(yōu)化Fig.5 Optimisation of the amount of colloidal gold-labelled antibody on the conjugate pad

2.3 靈敏度和特異性評(píng)價(jià)以及加標(biāo)樣品中的應(yīng)用

將蛋白濃度為0.2 mg/mL的長柄鏈格孢菌裂解液進(jìn)行梯度稀釋（圖6a）?？瞻讓?duì)照呈陰性，當(dāng)病菌裂解液稀釋10倍至1×104倍時(shí)，均可檢出；當(dāng)稀釋至1×105倍時(shí)，試紙條無檢出，即檢出限為20 ng/mL。但樣品稀釋10倍時(shí)，T線信號(hào)較弱，說明可能由于上樣濃度過高造成了鉤狀效應(yīng)，在實(shí)際檢測中可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果。

如圖6b所示，將培養(yǎng)平板上其他微生物菌落混懸在1 mL長柄鏈格孢菌裂解液中，或?qū)⒉《镜年栃詫?duì)照用裂解液稀釋10倍，用膠體金試紙條進(jìn)行檢測，除長柄鏈格孢菌外，其他試紙條均呈陰性，說明膠體金試紙條與其余7種微生物無交叉反應(yīng)，具有較高的特異性。

在沒有赤星病感染的云煙85煙葉上分別添加無菌PBS和長柄鏈格孢菌，取0.5 g撕碎的煙葉分別置于2個(gè)離心管中，加入1 mL云煙85煙葉的提取液后混合均勻，取100μL混合后的液體進(jìn)行檢測。如圖6c所示，10 min后空白對(duì)照T線無信號(hào)，然而加標(biāo)煙葉有檢出，說明試紙條受實(shí)際樣品中基質(zhì)的干擾較小。

圖6 快速檢測試紙條的靈敏度（a）和特異性（b）評(píng)價(jià)以及在加標(biāo)樣品中的檢測（c）Fig.6 Sensitivity(a)and specificity(b)of test strips and the detection of a spiked sample by test strips(c)

2.4 穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

將膠體金試紙條密封裝在有干燥劑的鋁箔袋中，在37℃下儲(chǔ)存6個(gè)月進(jìn)行加速老化測試。根據(jù)阿倫尼烏斯方程，加速老化測試可評(píng)估長期儲(chǔ)存對(duì)其性能的影響，試紙條在37℃下保存91 d可視為25℃條件下保存1年［21］。檢測陰性對(duì)照和稀釋100倍的長柄鏈格孢菌裂解液，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3次重復(fù)。如表1所示，37℃條件下加速老化0至6個(gè)月期間，結(jié)果無假陽性或假陰性，說明試紙條具有良好的穩(wěn)定性。

表1 37℃儲(chǔ)存條件下快速檢測試紙條檢測結(jié)果Tab.1 Detection results of tests strips stored at 37℃

2.5 討論

赤星病的病原較多，分類較復(fù)雜，有研究鑒定出河南煙區(qū)的煙草赤星病病原菌主要是鏈格孢（A.alternata）、長柄鏈格孢（A.longipes）、鴨梨鏈格孢（A.yalinnficiens）［22］；湖北煙區(qū)煙草赤星病病原菌主要為鏈格孢、長柄鏈格孢、細(xì)極鏈格孢（A.tenuissima）和鴨梨鏈格孢［23］；重慶煙區(qū)煙草赤星病病原菌主要為細(xì)極鏈格孢［24］；貴州煙區(qū)發(fā)生的煙草赤星病病原菌主要為鏈格孢菌和長柄鏈格孢菌［25］。而本試驗(yàn)中所選擇的病菌樣本僅來自云南省部分煙區(qū)，試驗(yàn)材料尚不豐富，對(duì)其18S rRNA測序顯示分離的菌株為長柄鏈格孢菌［26］，因此試紙條適用于檢測煙葉中病原菌為長柄鏈格孢菌引起的赤星病，下一步將通過研制復(fù)合鏈格孢菌的檢測試紙條，擴(kuò)大試紙條的檢測范圍和準(zhǔn)確度。此外，膠體金快速檢測試紙條目前只對(duì)煙葉中的長柄鏈格孢菌進(jìn)行了試驗(yàn)，根據(jù)理論，本檢測方法同樣適用于土壤、煙草幼苗、煙草植株其他部分中長柄鏈格孢菌的定性檢測，但仍需進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

3 結(jié)論

利用裂解的長柄鏈格孢菌菌絲作為免疫原，誘導(dǎo)小鼠制備識(shí)別長柄鏈格孢菌的單克隆抗體，并對(duì)單克隆抗體進(jìn)行膠體金微粒標(biāo)記，構(gòu)建了一種適用于現(xiàn)場快速檢測煙草中長柄鏈格孢菌的免疫層析試紙條。該快速檢測試紙條的檢出限為20 ng/mL，且特異性較高，不與煙草上常見的幾種真菌、病毒等病原體發(fā)生交叉反應(yīng)。該試紙條具有操作快捷、無需特殊設(shè)備和專業(yè)技能等優(yōu)勢。