紀(jì) 元,胡利偉,蔡憲杰,許成悅,范子彥,師默聞,唐綱嶺,鄧惠敏*,閆 鼎*
1.國(guó)家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心,鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)翠竹街6號(hào) 450001
2.中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院,鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2號(hào) 450001
3.上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司,上海市長(zhǎng)陽(yáng)路717號(hào) 200082
長(zhǎng)柄鏈格孢菌(Alternaria longipes)是鏈格孢屬(Alternaria)真菌,也是引起煙草赤星病的主要病原菌[1]。多個(gè)國(guó)家曾報(bào)道過(guò)煙草赤星病的爆發(fā),在我國(guó)各煙區(qū)也均有赤星病的發(fā)生,造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失[2-4]。目前赤星病主要通過(guò)捕捉田間赤星病原孢子來(lái)預(yù)警,該方法需要相應(yīng)的設(shè)備,準(zhǔn)確性較低,檢測(cè)用時(shí)較長(zhǎng),赤星病一旦發(fā)生則很難控制。因此,建立一種經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確和快速的煙草赤星病檢測(cè)方法,在疾病發(fā)生早期檢測(cè)煙草幼苗或葉片中的鏈格孢菌,對(duì)赤星病的綠色防控尤為重要。
檢測(cè)鏈格孢菌的傳統(tǒng)方法包括形態(tài)學(xué)法[5-6]、化學(xué)分析法[7-8]、分子檢測(cè)法[9-10]和免疫檢測(cè)法[11-12]等。其中形態(tài)學(xué)法采用微生物培養(yǎng)手段,要求微生物必須是可培養(yǎng)的,耗時(shí)長(zhǎng)且對(duì)操作者的專業(yè)性要求高?;瘜W(xué)分析法是對(duì)微生物特定成分進(jìn)行檢測(cè),無(wú)需對(duì)微生物進(jìn)行培養(yǎng),雖靈敏度高,但由于該方法的檢測(cè)儀器不便攜帶,不適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。而膠體金免疫層析技術(shù)結(jié)合抗原抗體特異性識(shí)別和微流層析技術(shù),具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快、不受檢測(cè)設(shè)備和試劑限制等優(yōu)點(diǎn),已廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)療等行業(yè)[13-15]。Huang等[16]研制的膠體金免疫層析試紙條成功應(yīng)用于水稻條紋病毒的快速檢測(cè),該檢測(cè)準(zhǔn)確性高,特異性好。此外,多個(gè)公司制備了檢測(cè)血清中抗新型冠狀病毒IgG/IgM抗體的膠體金試紙條,與ELISA結(jié)果比較具有一致的特異性和準(zhǔn)確性,不僅適用于家庭檢測(cè),也適用于醫(yī)院的即時(shí)檢驗(yàn)(Point-of-care testing)[17]。然而,目前還未見(jiàn)針對(duì)鏈格孢菌的膠體金快速檢測(cè)試紙條的文獻(xiàn)報(bào)道和商品化的快速檢驗(yàn)試劑盒。
為此,通過(guò)將小鼠抗長(zhǎng)柄鏈格孢菌單克隆抗體進(jìn)行膠體金標(biāo)記,研制能夠靈敏且特異性地檢測(cè)長(zhǎng)柄鏈格孢菌的膠體金試紙條,旨在實(shí)現(xiàn)煙葉生產(chǎn)中赤星病的快速檢測(cè)和識(shí)別,為赤星病的有效防控提供準(zhǔn)確、及時(shí)的技術(shù)支持。
主要試劑耗材:牛血清白蛋白(BSA)、檸檬酸三鈉、氯金酸、吐溫80、生物素(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)。Amicon?親和濃度試劑盒蛋白A(美國(guó)Merck Millipore公司)。硝酸纖維素膜(德國(guó)Sartouris公司)。吸水濾紙、玻璃纖維紙、聚酯纖維紙和PVC板(上海捷寧生物科技有限公司)。
菌株:長(zhǎng)柄鏈格孢菌分離自昆明祿勸,由云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。菌落被接種在含10%(體積分?jǐn)?shù))新鮮煙葉提取物的馬鈴薯葡萄糖(PDA)培養(yǎng)基上,26°C培養(yǎng)7 d。大腸桿菌(Escherichia coli)、根黑腐串珠霉菌(Thielaviopsis basicola)、煙草黑脛病菌(Phytophthora nicotianae)和疣孢青霉菌(Penicillium verruculosum)來(lái)自鄭州煙草研究院生態(tài)環(huán)境與煙葉質(zhì)量重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus)、煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus)和馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y)陽(yáng)性對(duì)照購(gòu)自美國(guó)Agdia公司。
主要儀器:Megafuge 8R離心機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司),劃膜噴金標(biāo)機(jī)HGS510和切條機(jī)HGS201(杭州峰航科技有限公司),雙穩(wěn)定時(shí)電泳儀PAC3000(美國(guó)Bio-Rad公司)。
1.2.1 長(zhǎng)柄鏈格孢菌抗原的制備
將長(zhǎng)柄鏈格孢菌菌絲超聲處理15 min,離心后將沉淀進(jìn)行液氮研磨,再次超聲處理后,13 700×g離心10 min,將上清液超濾濃縮,得鏈格孢菌蛋白1。
將長(zhǎng)柄鏈格孢菌菌絲進(jìn)行液氮研磨,取1 g粉末溶于NS2T裂解液,置于冰上超聲10 min。1L NS2T裂解液的配方為0.1 mol Tris-HCl、0.1 mol NaCl、0.5 mol蔗糖、0.01 mol EDTA、2.4 mmol脫氧膽酸鈉、3 g Triton X-100、4.9 mmol 3-[3-(膽酰胺丙基)二甲基銨]-1-丙磺酸內(nèi)鹽(CHAPS)、0.01 mol 3-(環(huán)己氨基)2-羥基-1-丙磺酸(CAPSO)、1 mmol蛋白酶抑制劑雞尾酒、2 mmol苯甲基磺酰氟(PMSF)、10 mmol二硫蘇糖醇(DTT)。裂解物13 700×g轉(zhuǎn)速離心10 min,取上清得鏈格孢菌蛋白2。將蛋白裂解液與上樣緩沖液混合后進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè),考馬斯亮藍(lán)染膠。
將2 g長(zhǎng)柄鏈格孢菌菌絲液氮研磨,加入4 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)后超聲處理15 min,13 700×g轉(zhuǎn)速下離心10 min獲得鏈格孢菌蛋白3。
1.2.2 單克隆抗體的制備和純化
50μg長(zhǎng)柄鏈格孢菌菌絲裂解液與弗氏完全佐劑充分乳化后分別皮下注射2只6~8周齡的BALB/c雌鼠(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司),之后菌絲裂解液與弗氏不完全佐劑混合并免疫小鼠3次,每次間隔為2周。最后一次免疫完成1周后,取小鼠血清采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法進(jìn)行效價(jià)檢測(cè)[18]。細(xì)胞融合3 d前,將50μg菌絲裂解液與PBS混合,對(duì)小鼠進(jìn)行免疫沖擊。將小鼠胰臟細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞以10∶1混合,接種在96孔板中[19]。以長(zhǎng)柄鏈格孢菌裂解蛋白為抗原,采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA和蛋白質(zhì)電泳法篩選雜交瘤細(xì)胞株[20],選取高滴度的細(xì)胞株進(jìn)行2次亞克隆。采用體內(nèi)誘生法制備腹水,向BALB/c小鼠腹腔注入滅菌液狀石蠟(0.5 mL/只),7 d后將約5×105個(gè)雜交瘤細(xì)胞注射到小鼠腹腔中。根據(jù)制造商提供的使用說(shuō)明,利用蛋白A親和層析柱進(jìn)行抗體純化。純化后的抗體通過(guò)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA和蛋白質(zhì)電泳法對(duì)其特異性進(jìn)行驗(yàn)證。
1.2.3 膠體金檢測(cè)試紙條的制備
1.2.3.1 膠體金標(biāo)記單克隆抗體
采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金。將100 mL 0.3 mmol/L氯金酸溶液加熱至沸騰,邊攪拌邊加入檸檬酸三鈉溶液0.04 mol/L)至溶液呈透亮的酒紅色,用碳酸鉀溶液將pH調(diào)整為7.2。按每毫升膠體金溶液加入6~16μg單克隆抗體,加BSA至終濃度為1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。以13 700×g轉(zhuǎn)速4°C離心40 min,將沉淀用復(fù)溶緩沖液[含0.2%BSA、0.1%(體積分?jǐn)?shù))吐溫80的0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液,pH 7.2]重懸,4°C保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.3.2 結(jié)合物釋放墊制備
將玻璃纖維釋放墊浸潤(rùn)于Tris緩沖液(pH 7.4)中,37°C干燥。使用噴膜儀將標(biāo)有膠體金的長(zhǎng)柄鏈格孢菌單克隆抗體和IgY噴涂在結(jié)合物釋放墊上,37°C干燥后取出備用。
1.2.3.3 反應(yīng)膜制備
將長(zhǎng)柄鏈格孢菌單克隆抗體捕獲抗體包被到反應(yīng)膜上形成檢測(cè)線(T),將山羊抗雞抗體包被在反應(yīng)膜上構(gòu)成質(zhì)控線(C)。
1.2.3.4 試紙條組裝
在PVC底板上依次粘貼樣品吸收墊、噴涂有標(biāo)記長(zhǎng)柄鏈格孢菌抗體的膠體金和IgY的結(jié)合墊、噴涂有長(zhǎng)柄鏈格孢菌抗體和山羊抗雞二抗的反應(yīng)膜、吸水墊,切成3.5 mm的寬度的試紙條后裝入卡殼,試紙條結(jié)構(gòu)如圖1所示。
圖1 長(zhǎng)柄鏈格孢菌檢測(cè)試紙條結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic illustration of test strips for the detection of A.longipes
1.2.4 測(cè)試方法與檢測(cè)結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)
稱取約0.3 g樣品至1.5 mL離心管中,加入1 mL PBST(含10 mmol/L PBS,1%吐溫20,0.6 mol/L NaCl),搖晃后靜置5 min。取上清液0.1 mL至點(diǎn)樣孔中,等待10 min后觀察結(jié)果。
判斷標(biāo)準(zhǔn):如圖2所示,C線顯色,T線不顯色,表示樣品中長(zhǎng)柄鏈格孢菌數(shù)量低于檢測(cè)限,即為陰性。C線和T線均顯色,表示樣品中長(zhǎng)柄鏈格孢菌數(shù)量等于或高于檢測(cè)限,即為陽(yáng)性。C線不顯色,表示操作不正確或試紙條已失效。
圖2 快速檢測(cè)試紙條判斷標(biāo)準(zhǔn)Fig.2 Criteria for rapid detection by test strips
如圖3所示,長(zhǎng)柄鏈格孢菌菌絲裂解液經(jīng)SDS-PAGE分離,主要條帶出現(xiàn)在120、70、38 kDa附近。裂解液與弗氏完全佐劑乳化后免疫小鼠制備單克隆抗體。
圖3 長(zhǎng)柄鏈格孢菌蛋白裂解液SDS-PAGE結(jié)果Fig.3 SDS-PAGE analysis of A.longipes protein lysates
使用長(zhǎng)柄鏈格孢菌菌絲裂解液免疫BALB/c小鼠,對(duì)小鼠血清中的抗體滴度進(jìn)行檢測(cè)。如圖4a所示,與對(duì)照相比,小鼠1和2的血清在450 nm處吸光度明顯高于空白小鼠,說(shuō)明長(zhǎng)柄鏈格孢菌菌絲裂解液作為免疫原誘導(dǎo)抗體效價(jià)較高。因此,選取長(zhǎng)柄鏈格孢菌菌絲裂解液免疫的小鼠進(jìn)行單克隆抗體制備,并用蛋白質(zhì)電泳對(duì)腹水純化的抗體進(jìn)行檢測(cè)。如圖4b所示,僅在25 kDa和50 kDa有2個(gè)條帶,分別對(duì)應(yīng)IgG的輕鏈和重鏈,說(shuō)明抗體已經(jīng)被制備并純化。利用ELISA對(duì)抗體效價(jià)進(jìn)行評(píng)價(jià),包被原為鏈格孢菌蛋白1、2、3,除了蛋白3,抗體對(duì)蛋白1和2響應(yīng)良好(圖4c)。
圖4 單克隆抗體的評(píng)價(jià)Fig.4 Evaluation of the monoclonal antibody
為確定結(jié)合墊噴金量,按每厘米結(jié)合墊噴涂1.5、2.0、2.5μL金標(biāo)抗體的噴金量分別將鏈格孢菌蛋白2稀釋1×103倍和1×105倍,檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖5。噴金量為1.5或2.0μL/cm時(shí)試紙條可識(shí)別鏈格孢菌,且噴金量為2.0μL/cm時(shí)信號(hào)更強(qiáng);當(dāng)噴金量為2.5 μL/cm時(shí)C線有非特異性吸附。因此,選擇噴金量為2.0μL/cm。
圖5 結(jié)合墊噴金量?jī)?yōu)化Fig.5 Optimisation of the amount of colloidal gold-labelled antibody on the conjugate pad
將蛋白濃度為0.2 mg/mL的長(zhǎng)柄鏈格孢菌裂解液進(jìn)行梯度稀釋(圖6a)??瞻讓?duì)照呈陰性,當(dāng)病菌裂解液稀釋10倍至1×104倍時(shí),均可檢出;當(dāng)稀釋至1×105倍時(shí),試紙條無(wú)檢出,即檢出限為20 ng/mL。但樣品稀釋10倍時(shí),T線信號(hào)較弱,說(shuō)明可能由于上樣濃度過(guò)高造成了鉤狀效應(yīng),在實(shí)際檢測(cè)中可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果。
如圖6b所示,將培養(yǎng)平板上其他微生物菌落混懸在1 mL長(zhǎng)柄鏈格孢菌裂解液中,或?qū)⒉《镜年?yáng)性對(duì)照用裂解液稀釋10倍,用膠體金試紙條進(jìn)行檢測(cè),除長(zhǎng)柄鏈格孢菌外,其他試紙條均呈陰性,說(shuō)明膠體金試紙條與其余7種微生物無(wú)交叉反應(yīng),具有較高的特異性。
在沒(méi)有赤星病感染的云煙85煙葉上分別添加無(wú)菌PBS和長(zhǎng)柄鏈格孢菌,取0.5 g撕碎的煙葉分別置于2個(gè)離心管中,加入1 mL云煙85煙葉的提取液后混合均勻,取100μL混合后的液體進(jìn)行檢測(cè)。如圖6c所示,10 min后空白對(duì)照T線無(wú)信號(hào),然而加標(biāo)煙葉有檢出,說(shuō)明試紙條受實(shí)際樣品中基質(zhì)的干擾較小。
圖6 快速檢測(cè)試紙條的靈敏度(a)和特異性(b)評(píng)價(jià)以及在加標(biāo)樣品中的檢測(cè)(c)Fig.6 Sensitivity(a)and specificity(b)of test strips and the detection of a spiked sample by test strips(c)
將膠體金試紙條密封裝在有干燥劑的鋁箔袋中,在37℃下儲(chǔ)存6個(gè)月進(jìn)行加速老化測(cè)試。根據(jù)阿倫尼烏斯方程,加速老化測(cè)試可評(píng)估長(zhǎng)期儲(chǔ)存對(duì)其性能的影響,試紙條在37℃下保存91 d可視為25℃條件下保存1年[21]。檢測(cè)陰性對(duì)照和稀釋100倍的長(zhǎng)柄鏈格孢菌裂解液,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3次重復(fù)。如表1所示,37℃條件下加速老化0至6個(gè)月期間,結(jié)果無(wú)假陽(yáng)性或假陰性,說(shuō)明試紙條具有良好的穩(wěn)定性。
表1 37℃儲(chǔ)存條件下快速檢測(cè)試紙條檢測(cè)結(jié)果Tab.1 Detection results of tests strips stored at 37℃
赤星病的病原較多,分類較復(fù)雜,有研究鑒定出河南煙區(qū)的煙草赤星病病原菌主要是鏈格孢(A.alternata)、長(zhǎng)柄鏈格孢(A.longipes)、鴨梨鏈格孢(A.yalinnficiens)[22];湖北煙區(qū)煙草赤星病病原菌主要為鏈格孢、長(zhǎng)柄鏈格孢、細(xì)極鏈格孢(A.tenuissima)和鴨梨鏈格孢[23];重慶煙區(qū)煙草赤星病病原菌主要為細(xì)極鏈格孢[24];貴州煙區(qū)發(fā)生的煙草赤星病病原菌主要為鏈格孢菌和長(zhǎng)柄鏈格孢菌[25]。而本試驗(yàn)中所選擇的病菌樣本僅來(lái)自云南省部分煙區(qū),試驗(yàn)材料尚不豐富,對(duì)其18S rRNA測(cè)序顯示分離的菌株為長(zhǎng)柄鏈格孢菌[26],因此試紙條適用于檢測(cè)煙葉中病原菌為長(zhǎng)柄鏈格孢菌引起的赤星病,下一步將通過(guò)研制復(fù)合鏈格孢菌的檢測(cè)試紙條,擴(kuò)大試紙條的檢測(cè)范圍和準(zhǔn)確度。此外,膠體金快速檢測(cè)試紙條目前只對(duì)煙葉中的長(zhǎng)柄鏈格孢菌進(jìn)行了試驗(yàn),根據(jù)理論,本檢測(cè)方法同樣適用于土壤、煙草幼苗、煙草植株其他部分中長(zhǎng)柄鏈格孢菌的定性檢測(cè),但仍需進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。
利用裂解的長(zhǎng)柄鏈格孢菌菌絲作為免疫原,誘導(dǎo)小鼠制備識(shí)別長(zhǎng)柄鏈格孢菌的單克隆抗體,并對(duì)單克隆抗體進(jìn)行膠體金微粒標(biāo)記,構(gòu)建了一種適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)煙草中長(zhǎng)柄鏈格孢菌的免疫層析試紙條。該快速檢測(cè)試紙條的檢出限為20 ng/mL,且特異性較高,不與煙草上常見(jiàn)的幾種真菌、病毒等病原體發(fā)生交叉反應(yīng)。該試紙條具有操作快捷、無(wú)需特殊設(shè)備和專業(yè)技能等優(yōu)勢(shì)。