微小RNA-134靶向調(diào)控環(huán)腺苷酸應(yīng)答元件結(jié)合蛋白/腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子通路對(duì)腦卒中后抑郁海馬神經(jīng)細(xì)胞的影響

胡雅坤，王志強(qiáng)，梁家輝

腦卒中后抑郁是急性腦血管損傷后發(fā)生的一種情感障礙性疾病，是腦卒中最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，提高了腦卒中的致殘、病死率[1-2]。研究[3-4]顯示，卒中會(huì)增加抑郁的風(fēng)險(xiǎn)，31%的腦卒中患者卒中后5年內(nèi)會(huì)出現(xiàn)抑郁，腦卒中后抑郁已成為嚴(yán)重的社會(huì)公共健康問(wèn)題。因此，探索腦卒中后抑郁發(fā)病機(jī)制及治療方法是目前亟需解決的問(wèn)題。微小RNA(miRNA)是一種長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸的小分子非編碼RNA，可結(jié)合靶向mRNA的3′-UTR影響靶基因表達(dá)。研究[5]顯示，miR-134在調(diào)節(jié)大鼠慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的結(jié)構(gòu)可塑性和抑郁樣行為方面發(fā)揮重要作用。環(huán)腺苷酸應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(CREB)是一種轉(zhuǎn)錄因子，應(yīng)激后發(fā)生磷酸化，調(diào)控下游靶基因腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)的轉(zhuǎn)錄，在神經(jīng)元生長(zhǎng)、突觸形成等方面發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[6-7]。有研究[8]發(fā)現(xiàn)，CREB/BDNF通路參與梔子果實(shí)油脂發(fā)揮抗抑郁作用的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程。本研究將建立腦卒中后抑郁大鼠模型，檢測(cè)大鼠海馬中miR-134表達(dá)水平，并進(jìn)一步通過(guò)下調(diào)miR-134表達(dá)，探究其對(duì)海馬神經(jīng)細(xì)胞增殖、凋亡的影響及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠購(gòu)自廣州永諾生物科技有限公司[許可證號(hào)：SYXK(粵)2018-0186]，質(zhì)量(250±5)g。

1.1.2 試劑與儀器 胎牛血清(貨號(hào)：FBS500-S)購(gòu)自澳大利亞AusGeneX公司；DMEM培養(yǎng)基(貨號(hào)：GMS12322.1)購(gòu)自美國(guó)GENMED公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(貨號(hào)：11668019)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒(貨號(hào)：4472908)購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司；miRNA NC、miR-134 siRNA、miR-134陰性對(duì)照序列(negative control-miR-134)、miR-134模擬物(miR-134 mimic)及miR-134、CREB1、BDNF、U6、GAPDH引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；p-CREB1抗體、CREB1抗體、BDNF抗體、GAPDH抗體、羊抗兔lgG(貨號(hào)：ab254107、ab178322、ab226843、ab181602、ab6721)購(gòu)自abcam公司；CCK-8試劑(貨號(hào)：CK-04)購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所；AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：S0185)購(gòu)自哈爾濱新?；驒z測(cè)有限公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：556547)購(gòu)自美國(guó)BD公司。恒溫培養(yǎng)箱(型號(hào)：MIR-162-PC/MIR-262-PC)購(gòu)自日本松下公司；熒光定量PCR儀(型號(hào)：ABI 7500)購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司；酶標(biāo)儀、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(型號(hào)：MODEL550、ChemiDocXRS)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；流式細(xì)胞儀(型號(hào)：Guauasoft 6 L)購(gòu)自美國(guó)Millipor公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及造模 30只SD大鼠隨機(jī)分為正常組(10只)和造模組(20只)。造模組采用大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)法建立腦卒中模型，1分

1.2.2 樣本采集、細(xì)胞培養(yǎng)及分組 水合氯醛麻醉后處死大鼠，取腦分離海馬組織，其中正常組10只大鼠海馬組織與造模組10只大鼠海馬組織用于mRNA及蛋白水平檢測(cè)。造模組剩余10只大鼠海馬用組織剪成1 mm×1 mm×1 mm小塊，用胰酶消化，組織塊消失后加胎牛血清終止消化，離心分離細(xì)胞。獲得的海馬神經(jīng)細(xì)胞沉淀用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天更換培養(yǎng)基。

將海馬神經(jīng)細(xì)胞接種于6孔或96孔培養(yǎng)板，分為對(duì)照組、miRNA NC組和miR-134 siRNA組，miRNA NC組、miR-134 siRNA組細(xì)胞用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑分別轉(zhuǎn)染miRNA NC、miR-134 siRNA。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法檢測(cè)miR-134及CREB1、BDNF mRNA表達(dá)水平 將1.2.2中各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h，使用TRIzol試劑提取海馬組織及細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，按照實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)miR-134、CREB1 mRNA、BDNF mRNA表達(dá)水平。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因表達(dá)量，內(nèi)參基因?yàn)閁6、GAPDH。反應(yīng)程序：95 ℃ 60 s；95 ℃ 40 s，55 ℃ 35 s，72 ℃ 90 s，循環(huán)40次。miR-134上游引物：5′-GGG TGT GAC TGG TTG ACC-3′，下游引物：5′-CAG TGC GTG TCG TGG AGT-3′；CREB1上游引物：5′-AGA AGC AGC ACG AAA GAG AG-3′，下游引物：5′-CAC TGC CAC TCT GTT CTC TAA A-3′；BDNF上游引物：5′-GGT ATC CAA AGG CC AAC TGA-3′，下游引物：5′-CTT ATG AAT CGC CAG CCA AT-3′；內(nèi)參U6上游引物：5′-GCT TGC GCA CGA GAT ATA GTA AAA T-3′，下游引物：5′-CCG TTG AGC AAT TTG CCT GTG AT-3′；內(nèi)參GAPDH上游引物：5′-AGG TCG GTG TGA ACG GAT TTG-3′，下游引物：5′-TGT AGA CCA TGT AGT TGA GGT CA-3′。

1.2.4 Western blotting法檢測(cè)p-CREB1、CREB1、BDNF蛋白表達(dá) 將1.2.2中各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h，使用蛋白提取試劑盒提取海馬組織及細(xì)胞總蛋白，BCA法定量。電泳分離、轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉后，加入p-CREB1抗體、CREB1抗體、BDNF抗體、GAPDH抗體(1∶500)，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌3次，加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶2 000)，室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，化學(xué)發(fā)光法顯色、顯影，蛋白條帶采用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.2.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 將1.2.2中各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h，加入CCK-8試劑繼續(xù)培養(yǎng)2 h，在450 nm處檢測(cè)各孔吸光度(OD)值。

1.2.6 細(xì)胞凋亡情況的檢測(cè) 將1.2.2中各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，胰酶消化、洗滌，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml，依次加入Annexin V-FITC、PI各5 μl，避光孵育1 h，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-134與CREB1的靶向作用關(guān)系 利用miRTarBase軟件預(yù)測(cè)miR-134與CREB1的結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建CREB1基因的野生型和突變型3′UTR-CREB1熒光素酶表達(dá)載體(CREB1-WT和CREB1-MUT)，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)分別與negative control-miR-134、miR-134 mimic共同轉(zhuǎn)入海馬神經(jīng)細(xì)胞中。使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒測(cè)定熒光素酶活性。

2 結(jié) 果

2.1 正常組及造模組大鼠海馬組織miR-134及CREB1、BDNF mRNA表達(dá)水平的比較 見(jiàn)表1。與正常組相比，造模組大鼠海馬組織中miR-134表達(dá)水平顯著升高，CREB1、BDNF mRNA表達(dá)水平顯著降低(均P<0.05)。

表1 正常組及造模組大鼠海馬組織miR-134及CREB1、BDNF mRNA表達(dá)水平的比較(x±s)組別例數(shù)miR-134CREB1 mRNABDNF mRNA正常組101.02±0.090.99±0.081.01±0.06造模組101.86±0.120.35±0.050.28±0.04t值-17.70921.45332.013P值-0.0000.0000.000

2.2 正常組及造模組大鼠海馬組織p-CREB1/CREB1、BDNF蛋白表達(dá)的比較 見(jiàn)圖1、表2。與正常組相比，造模組大鼠海馬組織中p-CREB1/CREB1、BDNF蛋白表達(dá)水平顯著降低(均P<0.05)。

2.3 對(duì)照組、miRNA NC組、miR-134 siRNA組海馬神經(jīng)細(xì)胞CREB1、BDNF mRNA表達(dá)水平的比較 見(jiàn)表3。對(duì)照組與miRNA NC組海馬神經(jīng)細(xì)胞CREB1、BDNF mRNA表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。與對(duì)照組、miRNA NC組相比，miR-134 siRNA組海馬神經(jīng)細(xì)胞中CREB1、BDNF mRNA表達(dá)水平顯著升高(均P<0.05)。

圖1 正常組及造模組大鼠海馬組織p-CREB1、CREB1、BDNF蛋白表達(dá)情況

表2 正常組及造模組大鼠海馬組織p-CREB1/CREB1、BDNF蛋白表達(dá)水平的比較(x±s,n=10)組別p-CREB1/CREB1BDNF/GAPDH正常組0.83±0.080.92±0.09造模組0.69±0.090.34±0.04t值3.40818.623P值0.0030.000

表3 對(duì)照組、miRNA NC組、miR-134 siRNA組海馬神經(jīng)細(xì)胞miR-134及CREB1、BDNF mRNA表達(dá)水平的比較(x±s,n=10)組別miR-134CREB1 mRNABDNF mRNA對(duì)照組1.02±0.071.01±0.111.00±0.12miRNA NC組1.01±0.071.01±0.110.99±0.13miR-134 siR-NA組0.33±0.04*△1.98±0.10*△2.25±0.16*△F值247.000165.070166.091P值0.0000.0000.000 注:與對(duì)照組相比*P<0.05;與miRNA NC組相比△P<0.05

2.4 對(duì)照組、miRNA NC組、miR-134 siRNA組海馬神經(jīng)細(xì)胞p-CREB1/CREB1、BDNF蛋白表達(dá)的比較見(jiàn)圖2、表4。對(duì)照組與miRNA NC組海馬神經(jīng)細(xì)胞中p-CREB1/CREB1、BDNF蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；與對(duì)照組、miRNA NC組相比，miR-134 siRNA組海馬神經(jīng)細(xì)胞中p-CREB1/CREB1、BDNF蛋白表達(dá)水平顯著升高(均P<0.05)。

圖2 對(duì)照組、miRNA NC組、miR-134 siRNA組海馬神經(jīng)細(xì)胞p-CREB1、CREB1、BDNF蛋白表達(dá)情況

2.5 對(duì)照組、miRNA NC組、miR-134 siRNA組海馬神經(jīng)細(xì)胞增殖情況 見(jiàn)表5。對(duì)照組與miRNA NC組海馬神經(jīng)細(xì)胞OD值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對(duì)照組、miRNA NC組相比，miR-134 siRNA組海馬神經(jīng)細(xì)胞OD值顯著升高(均P<0.05)。

表4 對(duì)照組、miRNA NC組、miR-134 siRNA組海馬神經(jīng)細(xì)胞p-CREB1/CREB1、BDNF蛋白表達(dá)水平比較(x±s,n=10)組別p-CREB1/CREB1BDNF/GAPDH對(duì)照組0.48±0.050.40±0.04miRNA NC組0.46±0.050.41±0.05miR-134 siRNA組0.76±0.07*△0.66±0.05*△F值51.15259.182P值0.0000.000 注:與對(duì)照組相比*P<0.05;與miRNA NC組相比△P<0.05

2.6 對(duì)照組、miRNA NC組、miR-134 siRNA組海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況的比較 見(jiàn)表5、圖3。對(duì)照組與miRNA NC組海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與對(duì)照組、miRNA NC組相比，miR-134 siRNA組海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率顯著降低(均P<0.05)。

表5 對(duì)照組、miRNA NC組、miR-134 siRNA組海馬神經(jīng)細(xì)胞OD值、凋亡率的比較(x±s,n=10)組別OD值凋亡率(%)對(duì)照組0.34±0.0521.44±1.64miRNA NC組0.35±0.0522.15±1.85miR-134 siRNA組0.52±0.07*△8.57±1.14*△F值18.606141.894P值0.0000.000 注:與對(duì)照組相比*P<0.05;與miRNA NC組相比△P<0.05

圖3 各組對(duì)照組、miRNA NC組、miR-134 siRNA組海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況

2.7 miR-134與CREB1的靶向作用關(guān)系驗(yàn)證 見(jiàn)圖4、表6。miRTarBase網(wǎng)站預(yù)測(cè)顯示，miR-134與CREB1基因存在結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染CREB1-MUT、negative control-miR-134與共轉(zhuǎn)染CREB1-MUT、miR-134 mimic的細(xì)胞熒光素酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與共轉(zhuǎn)染CREB1-WT、negative control-miR-134相比，共轉(zhuǎn)染CREB1-WT、miR-134 mimic的細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)。

圖4 生物信息學(xué)分析miR-134與CREB1的結(jié)合位點(diǎn)

表6 各組海馬神經(jīng)細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性比較(x±s)組別CREB1-MUTCREB1-WTnegative control-miR-1341.03±0.121.01±0.10miR-134 mimic1.01±0.130.42±0.08t值0.27711.285P值0.7870.000

3 討 論

腦卒中是常見(jiàn)的腦血管疾病，發(fā)病率、致殘率、致死率均處于較高水平，且其發(fā)病率隨年齡增加而增高[10]。腦卒中后抑郁是腦卒中發(fā)生后的常見(jiàn)并發(fā)癥，主要表現(xiàn)為自責(zé)、悲傷、睡眠障礙、疲乏、情緒低落、興趣下降甚至產(chǎn)生自殺企圖等，在腦卒中的急性期、恢復(fù)期等階段均可發(fā)生[11]。腦卒中后抑郁會(huì)減慢患者神經(jīng)功能的恢復(fù)程度，影響患者生活質(zhì)量及預(yù)后結(jié)局，但其具體發(fā)病機(jī)制尚不明確，臨床治療也缺乏穩(wěn)定有效的方案。海馬是與認(rèn)知功能相關(guān)的經(jīng)典腦區(qū)，在機(jī)體遭受急性創(chuàng)傷應(yīng)激后發(fā)生病理生理改變，進(jìn)而影響大腦認(rèn)知功能。本研究采用MCAO法、CUMS法建立大鼠腦卒中后抑郁模型，初步探討在腦卒中后抑郁大鼠海馬中差異表達(dá)的分子，并通過(guò)體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)細(xì)胞，探討影響海馬神經(jīng)細(xì)胞增殖、凋亡的因素及相關(guān)機(jī)制。

miRNA是一類(lèi)非編碼小分子RNA，具有調(diào)控功能，廣泛存在于動(dòng)植物中，長(zhǎng)約18～25個(gè)核苷酸，通過(guò)互補(bǔ)配對(duì)與靶基因的3′-UTR結(jié)合，進(jìn)而抑制靶基因翻譯或誘導(dǎo)靶基因降解，在癌癥、卒中等多種疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用[12]。越來(lái)越多的證據(jù)[13]表明，miR-134參與神經(jīng)功能的調(diào)節(jié)。研究[14]報(bào)道，miR-134是大腦特異性的miRNA，在缺血/再灌注損傷過(guò)程中參與誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞死亡。Fiore等[15]研究表明，miR-134依賴性調(diào)節(jié)在穩(wěn)態(tài)突觸抑制過(guò)程中是不可或缺的。而Fan等[5]通過(guò)建立大鼠抑郁模型發(fā)現(xiàn)，miR-134介導(dǎo)的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)可塑性失調(diào)可能與應(yīng)激大鼠抑郁樣行為的表現(xiàn)有關(guān)。本研究檢測(cè)大鼠海馬區(qū)miR-134表達(dá)發(fā)現(xiàn)，其在腦卒中后抑郁模型大鼠海馬組織中顯著升高，提示miR-134上調(diào)可能與大鼠發(fā)生腦卒中后抑郁有關(guān)。體外培養(yǎng)腦卒中后抑郁模型大鼠海馬組織中神經(jīng)細(xì)胞，通過(guò)轉(zhuǎn)染siRNA下調(diào)miR-134表達(dá)發(fā)現(xiàn)，海馬神經(jīng)細(xì)胞增殖水平隨之升高，凋亡水平降低，提示miR-134表達(dá)水平可影響海馬神經(jīng)細(xì)胞的增殖、凋亡過(guò)程，可能通過(guò)影響細(xì)胞生物學(xué)進(jìn)程在大鼠發(fā)生腦卒中后抑郁過(guò)程中發(fā)揮作用，但具體機(jī)制尚不知曉。

CREB是一種與應(yīng)激相關(guān)的重要核蛋白，存在于CNS內(nèi)，在應(yīng)激發(fā)生后磷酸化激活，調(diào)控下游信號(hào)通路，從而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[16]。BDNF是一個(gè)與神經(jīng)損傷修復(fù)有關(guān)的分子，參與抑郁癥病理生理發(fā)生過(guò)程，在抑郁癥大鼠海馬區(qū)表達(dá)下調(diào)，上調(diào)其表達(dá)可減輕大鼠海馬神經(jīng)元皮質(zhì)酮損傷[17]。Liu等[18]研究表明，CREB激活后能促進(jìn)BDNF表達(dá)，激活BDNF相關(guān)信號(hào)通路，恢復(fù)腦卒中導(dǎo)致的神經(jīng)功能損傷。本研究結(jié)果顯示，腦卒中后抑郁模型大鼠海馬組織中CREB1、BDNF mRNA表達(dá)水平及p-CREB1/CREB1、BDNF蛋白表達(dá)水平均顯著降低，提示CREB/BDNF通路受到抑制可能與腦卒中后抑郁發(fā)生有關(guān)。Shen等[19]研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇治療改善CUMS誘發(fā)的抑郁樣行為、認(rèn)知缺陷的潛在機(jī)制與CREB磷酸化、BDNF水平升高及miR-134水平降低有關(guān)。本研究顯示，下調(diào)miR-134在海馬神經(jīng)細(xì)胞中的表達(dá)后，CREB1、BDNF mRNA表達(dá)水平及p-CREB1/CREB1、BDNF蛋白表達(dá)水平均顯著升高。而生物信息學(xué)分析及雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，miR-134與CREB1基因存在結(jié)合位點(diǎn)，miR-134可在海馬神經(jīng)細(xì)胞中靶向CREB1表達(dá)。Yang等[20]研究發(fā)現(xiàn)，miR-134在心肌細(xì)胞凋亡過(guò)程中通過(guò)抑制CREB1表達(dá)發(fā)揮作用。Huang等[14]研究顯示，miR-134通過(guò)下調(diào)CREB表達(dá)在缺血/再灌注損傷過(guò)程中誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞死亡。由此推測(cè)，miR-134可能通過(guò)下調(diào)CREB表達(dá)并抑制其磷酸化，導(dǎo)致BDNF表達(dá)水平降低，進(jìn)而導(dǎo)致腦卒中后抑郁發(fā)生。

綜上所述，腦卒中后抑郁大鼠海馬miR-134表達(dá)上調(diào)，CREB1、BDNF表達(dá)下調(diào)，抑制海馬神經(jīng)細(xì)胞miR-134表達(dá)可導(dǎo)致CREB1、BDNF表達(dá)上調(diào)，并促進(jìn)細(xì)胞增殖，減少細(xì)胞凋亡，推測(cè)miR-134可能通過(guò)抑制CREB/BDNF通路參與腦卒中后抑郁發(fā)生過(guò)程。