1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶制備的帕金森病模型小鼠對帕金森病自主神經(jīng)功能障礙的適用性研究

汪燁，姜雯雯，吳晶，程越，張克忠

帕金森病(PD)是繼Alzheimer’s病后最常見的神經(jīng)退行性疾病。PD患者黑質(zhì)致密部(SNpc)中多巴胺能神經(jīng)元死亡，基底神經(jīng)節(jié)內(nèi)多巴胺缺乏導(dǎo)致經(jīng)典運動障礙，包括運動遲緩、肌強直、靜止性震顫以及姿勢和步態(tài)障礙[1]。隨著對PD研究的不斷深入，認知功能障礙、焦慮抑郁、感覺障礙、自主神經(jīng)功能障礙等非運動癥狀越來越受到重視。自主神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙是一種常見且重要的非運動癥狀，且有證據(jù)[2]表明，PD患者運動功能障礙出現(xiàn)前幾年甚至幾十年可能就存在自主神經(jīng)功能障礙，其形式不一，涉及多個系統(tǒng)及器官，以胃腸功能、膀胱功能、心血管功能障礙多見。有研究[3]發(fā)現(xiàn)，自主神經(jīng)功能障礙出現(xiàn)越早，疾病進展越快，患者的生存期越短。目前關(guān)于PD自主神經(jīng)功能障礙的機制研究較少，且缺乏經(jīng)典實驗?zāi)Ｐ汀?-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)小鼠PD模型能夠模擬PD的病理表現(xiàn)，被廣泛用于PD運動功能障礙研究[4]。本文通過評估MPTP小鼠模型不同時程各內(nèi)臟系統(tǒng)的自主神經(jīng)功能變化，探討MPTP小鼠模型在PD自主神經(jīng)功能障礙機制研究中的適用性，為PD自主神經(jīng)功能障礙研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 2月齡SPF級野生型(WT)雄性C57BL/6J小鼠20只，質(zhì)量24～29 g，購自南京醫(yī)科大學醫(yī)藥實驗動物中心。

1.1.2 常用試劑與儀器 MPTP(Sigma-Aldrich，St. Louis，MO)，丙磺舒(#57-66-9，濟南尚圣化工有限公司)，二甲基亞砜(DMSO，30072418，國藥集團化學試劑有限公司)，生理鹽水，鼠抗酪氨酸羥化酶多克隆抗體(TH，T1299，Sigma-Aldrich)，過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L)(33201ES60，上海翊圣生物科技有限公司)，DAB顯色液(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)。PowerLab 26T多導(dǎo)生理記錄儀，分離代謝籠，JLBehv-RRTG-5通用轉(zhuǎn)棒實驗分析系統(tǒng)(上海吉量軟件科技有限公司)，Leica CM 950冰凍切片機，Bio-Rad儀器，Tanon 5200自動化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)，蔡司AXIO顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 慢性PD小鼠模型的制備及實驗設(shè)計 將20只雄性C57BL/6J小鼠隨機分為對照組(n=10)和MPTP組(n=10)，所有動物在造模前先適應(yīng)1周。對照組皮下注射無菌生理鹽水0.1 ml/10 g，1 h后腹腔注射以DMSO溶解濃度為250 mg/ml的丙磺舒溶液10 μl/10 g；MPTP組皮下注射濃度為2 mg/ml的MPTP生理鹽水溶液0.1 ml/10 g，1 h后腹腔注射丙磺舒溶液10 μl/10 g。注射頻率均為2次/周，持續(xù)5周[5]。在造模期不同時間行胃腸功能、泌尿功能、心血管功能及運動功能評估，造模結(jié)束后取材進行病理學評估，具體實驗流程見圖1。所有實驗步驟及處理均通過南京醫(yī)科大學動物保護與倫理委員會批準。

圖1 實驗流程圖

1.2.2 胃腸功能評估 于第2～6周記錄小鼠的1 h排便顆粒數(shù)及糞便含水量。小鼠禁食過夜，在測試前2 h給予充足食物。將小鼠放在干凈的分離代謝籠中1 h，收集糞便，計數(shù)并稱重，經(jīng)65 ℃烘干過夜再次稱重。糞便含水量=(糞便濕重-糞便干重)/糞便濕重×100%[6]。

1.2.3 泌尿功能評估 于第2～6周評估小鼠的泌尿功能。在清潔干燥的桌面上放好濾紙，用2 000 ml的燒杯將小鼠扣在濾紙上，持續(xù)1 h。在小鼠排尿濾紙充分吸收尿液后更換濾紙，并標記好尿液浸潤的面積，同時記錄1 h內(nèi)小鼠排尿次數(shù)。濾紙風干48 h后剪下標記好的部分，稱重。將0.05 ml、0.10 ml、0.15 ml、0.20 ml、0.25 ml、0.30 ml、0.35 ml、0.40 ml的生理鹽水分別滴在濾紙上，標記浸潤的面積，待48 h風干后剪下稱重，并計算鹽水體積與濾紙干重的線性方程[小鼠平均單次排尿量(ml)=0.8088×吸收尿液的濾紙平均干重-0.0036]，其中相關(guān)系數(shù)r=0.9994[7]。

1.2.4 心血管功能評估 腹腔注射4%水合氯醛(0.1 ml/10 g)麻醉小鼠，通過保溫墊將體溫維持在37 ℃，使用生物電勢電極監(jiān)測ECG，使用powerlab 26T數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)收集圖像。截取基線平穩(wěn)持續(xù)3 min的ECG圖像，通過labchart軟件分析小鼠心率及心率變異性。在時域中以連續(xù)RR間隔差的均方根(RMSSD)(ms2)表示的自主性指標進行測量。

1.2.5 運動功能評估 (1)轉(zhuǎn)棒測試：于第2～6周采用轉(zhuǎn)棒實驗評估MPTP組運動協(xié)調(diào)能力。將小鼠放于儀器的轉(zhuǎn)動滾筒上，轉(zhuǎn)軸可加速。儀器自動記錄小鼠在轉(zhuǎn)棒上的停留時間，參數(shù)：低速≥5 r/min，高速≤25 r/min；加速時間2 min，持續(xù)時間5 min。每只小鼠進行3次測試，結(jié)果取平均值。(2)爬竿測試：于第2～6周采用爬竿測試檢測小鼠的運動能力。制作一根直徑1.2 cm、高 50 cm的直爬桿，頂部有一外面覆蓋紗布的木球。將小鼠頭部向上放置于桿頂端，記錄轉(zhuǎn)頭時間(從開始運動到完全轉(zhuǎn)為頭向下的時間)及爬竿時間(轉(zhuǎn)頭后向下爬并到達底端的時間)。每只小鼠檢測3次，取最短時間記錄。每次測量前用酒精消毒去除殘留氣味，以免影響結(jié)果。

1.2.6 中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的檢測 運動功能及自主神經(jīng)功能檢測結(jié)束后，對黑質(zhì)區(qū)域行TH免疫組化染色。采用4%的水合氯醛進行麻醉，行心臟灌注，取腦后固定并脫水，將厚度20 μm的冰凍中腦切片放置PBS中清洗3次，3% H2O2滅活，5% BSA封閉，一抗過夜，二抗室溫敷育2 h，DAB顯色液顯色，過梯度乙醇、二甲苯脫水，中性樹膠封片。每只小鼠選5張部位一致的中腦切片進行觀察，高倍鏡下隨機選取5個視野進行陽性細胞計數(shù)。計算平均值后，將兩組數(shù)據(jù)進行歸一化比較，以對照組作為陰性對照。

1.2.7 小鼠TH表達的檢測 采用Western blotting法檢測小鼠中腦的TH表達。取小鼠的中腦黑質(zhì)稱重，加入RIPA裂解液，冰上超聲勻漿后裂解30 min，以16 000g在4 ℃離心機中離心分離15 min，收集上層透明液體于EP管中。用BCA方法測蛋白濃度。將蛋白樣品加入提前制好的凝膠中，通過電泳、電轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，再經(jīng)封閉、敷一抗、二抗、漂洗。用顯色液發(fā)光檢測，自動化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)顯影，應(yīng)用Image J軟件分析條帶灰度值，以待測目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值之比表示蛋白的相對表達量。

2 結(jié) 果

2.1 對照組與MPTP組胃腸功能的比較 見表1。與對照組相比，MPTP組第4～6周排便顆粒數(shù)顯著減少(P<0.05～0.01)，第5～6周糞便含水量顯著降低(均P<0.05)。

2.2 對照組與MPTP組泌尿功能的比較 見表2。與對照組相比，MPTP組第5～6周1 h排尿次數(shù)顯著增多(均P<0.01)，平均單次尿量顯著下降(均P<0.01)。

2.3 對照組與MPTP組小鼠心率變異性的比較 見表3。與對照組相比，MPTP組小鼠心率及RMSSD在各時間點差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。

2.4 對照組與MPTP組運動功能的比較 見表4。對照組與MPTP組小鼠第2～5周運動功能差異無統(tǒng)計學意義，第6周MPTP組小鼠轉(zhuǎn)頭時間及爬桿時間顯著延長(均P<0.05)，轉(zhuǎn)棒時間顯著減少(均P<0.05)。

表1 對照組與MPTP組胃腸功能的比較(x±s,n=10)組別排便粒數(shù)(顆)第2周第3周第4周第5周第6周對照組15.10±0.8415.40±0.8515.80±0.8515.30±1.0114.90±0.67MPTP組14.90±1.1013.60±0.8613.30±0.6112.60±0.4512.10±0.48t值0.141.492.382.443.38P值0.890.15<0.05<0.05<0.01組別糞便含水量(%)第2周第3周第4周第5周第6周對照組60.95±1.0161.70±1.0763.22±1.5062.62±0.9961.58±1.36MPTP組63.86±1.7863.52±1.2362.93±1.6459.17±0.8656.55±1.15t值1.421.110.132.622.83P值0.170.280.90<0.05<0.05

表2 對照組與MPTP組泌尿功能的比較(x±s,n=10)組別1 h排尿次數(shù)(次)第2周第3周第4周第5周第6周對照組1.00±0.151.10±0.181.30±0.211.20±0.131.30±0.15MPTP組1.40±0.221.20±0.131.90±0.282.40±0.312.50±0.27t值1.500.451.72-3.60-3.88P值0.150.660.10<0.01<0.01組別平均單次尿量(ml)第2周第3周第4周第5周第6周對照組0.21±0.030.19±0.030.20±0.030.20±0.020.24±0.03MPTP組0.16±0.020.19±0.020.15±0.020.12±0.020.13±0.02t值1.460.111.393.102.90P值0.160.920.18<0.01<0.01

表3 對照組與MPTP組小鼠心率變異性的比較(x±s,n=10)組別心率(次/min)第2周第3周第4周第5周第6周對照組518.20±16.21525.50±13.78537.30±12.04531.20±17.89536.10±15.55MPTP組503.20±15.64516.00±7.97527.90±16.05528.20±10.26531.30±12.89t值0.660.600.470.150.24P值0.520.560.640.890.81組別RMSSD(ms2)第2周第3周第4周第5周第6周對照組1.07±0.210.93±0.150.91±0.080.83±0.110.88±0.14MPTP組1.20±0.211.25±0.090.99±0.081.04±0.110.91±0.12t值0.441.820.711.330.13P值0.670.090.480.200.90

表4 對照組與MPTP組運動功能的比較(x±s,n=10)組別轉(zhuǎn)頭時間(s)第2周第3周第4周第5周第6周對照組2.20±0.252.50±0.222.60±0.312.40±0.162.30±0.21MPTP組2.30±0.262.40±0.272.30±0.302.50±0.313.20±0.29t值0.280.290.700.292.50P值0.780.780.490.78<0.05組別爬竿時間(s)第2周第3周第4周第5周第6周對照組10.10±0.3810.30±0.7810.70±0.6810.10±0.5310.50±0.70MPTP組10.90±0.5011.10±0.5010.40±0.5410.30±0.5012.90±0.59t值1.270.860.340.282.62P值0.220.400.730.79<0.05組別轉(zhuǎn)棒時間(s)第2周第3周第4周第5周第6周對照組281.20±18.25269.90±18.29287.70±9.92266.20±20.47288.90±8.53MPTP組261.20±17.79265.30±17.69271.60±19.36268.10±14.89248.90±14.75t值0.780.180.740.082.35P值0.440.860.470.94<0.05

2.5 病理學評估

2.5.1 對照組與MPTP組中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的比較 見圖2。MPTP組小鼠黑質(zhì)區(qū)域多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量(0.60±0.01)顯著少于對照組(1.00±0.02)(t=19.00，P<0.001)，在組織學上可認定PD模型制作成功。

圖2 小鼠中腦黑質(zhì)區(qū)域TH免疫組化染色圖 A：對照組；B：MPTP組

2.5.2 對照組與MPTP組小鼠中腦TH表達的比較 見圖3。與對照組(1.06±0.10)相比，MPTP組中腦TH表達下降(0.58±0.08)，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.67，P<0.01)，可進一步認定PD模型制作成功。

圖3 對照組與MPTP組小鼠中腦TH表達水平

2.6 MPTP組小鼠中腦黑質(zhì)區(qū)域多巴胺能神經(jīng)能數(shù)量與胃腸功能、泌尿功能相關(guān)性分析 見圖4。MPTP組小鼠中腦多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量與排便顆粒數(shù)、糞便含水量以及平均單次尿量呈正相關(guān)(r=0.6930，P<0.05；r=0.6718，P<0.05；r=0.8149，P<0.05)，與1 h排尿次數(shù)呈負相關(guān)(r=-0.7155，P<0.05)。

圖4 MPTP組小鼠中腦多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量與胃腸功能、泌尿功能相關(guān)性分析

3 討 論

自主神經(jīng)功能障礙是PD重要的非運動癥狀之一[8-9]，主要包括胃腸道功能不全、心血管功能失調(diào)、泌尿系統(tǒng)疾病、性功能障礙、瞳孔調(diào)節(jié)異常等。自主神經(jīng)功能障礙可出現(xiàn)在運動障礙前數(shù)十年，且與患者生存期有密切關(guān)系[3]。但目前PD自主神經(jīng)功能障礙機制尚未完全明確，且缺乏經(jīng)典的實驗?zāi)Ｐ汀PTP是一種神經(jīng)毒素，被廣泛用于制作PD動物模型，主要通過氧化損傷和抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合物造成中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)兒茶酚胺能喪失，能夠模擬PD的病理表現(xiàn)，病變的嚴重程度和穩(wěn)定性取決于給藥方案。常用的MPTP小鼠模型根據(jù)給藥劑量和給藥時間不同分為急性、亞急性、慢性模型，其中急性模型、亞急性模型誘導(dǎo)的黑質(zhì)紋狀體的病變具有顯著可逆性，慢性低劑量模型引起的癥狀及病理改變呈進行性發(fā)展[4]，可模擬PD疾病進行性發(fā)展過程，因此本研究通過對MPTP慢性誘導(dǎo)的PD模型小鼠進行多個時間點、多個自主神經(jīng)系統(tǒng)功能評估，探討MPTP制備的慢性PD模型小鼠對PD自主神經(jīng)功能障礙研究的適用性。

據(jù)報道[2]，88.9%的PD患者在運動癥狀發(fā)作前會出現(xiàn)胃腸道癥狀，其中排便障礙的患病率為77%。既往研究[6,10-11]顯示，給予腹膜內(nèi)急性注射MPTP[60 mg/(kg·d)，4次/d，每次間隔2 h]2～3 d后，小鼠結(jié)腸運動短暫增加，7 d后出現(xiàn)腸道延遲轉(zhuǎn)運和便秘，第18 d出現(xiàn)排便頻率顯著降低，大便質(zhì)量未見改變。目前關(guān)于胃腸功能的研究結(jié)果不一致，可能與MPTP給藥時間、給藥劑量不同有關(guān)。但是，相對于急性、亞急性模型，慢性MPTP模型中發(fā)現(xiàn)的運動衰退及病理變化更加近似于人類PD的主要改變[12]。為此，本研究采用MPTP慢性注射的方法評估兩組小鼠的胃腸功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MPTP組小鼠在第4周開始出現(xiàn)1 h排便顆粒數(shù)下降，第5周、第6周排便顆粒數(shù)及糞便含水量均明顯下降，提示慢性MPTP注射可引起小鼠早期胃腸功能障礙，可用于PD伴胃腸道功能的相關(guān)研究，并且制備該模型所需的時間相對較短，其癥狀表型較為穩(wěn)定。

27%～85%的PD患者出現(xiàn)刺激性排尿障礙，表現(xiàn)為夜尿癥、尿頻、尿急或膀胱排空不良[2]。既往有研究[13]對MPTP處理的猴模型的泌尿功能進行評估，其膀胱逼尿肌也出現(xiàn)收縮增加。另一項研究[14]顯示，過表達人α-突觸核蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠也表現(xiàn)為膀胱排尿反射亢進、排尿頻率增加、單次排尿量減少；在GM2合酶敲除的PD小鼠模型中同樣觀察到膀胱功能亢進的癥狀[15]。但既往尚無研究評估MPTP模型對小鼠泌尿功能的影響，本研究系首次進行該項研究。研究結(jié)果顯示，MPTP組小鼠在第5周、第6周排尿次數(shù)明顯增加，平均單次尿量明顯下降，提示慢性MPTP注射也可導(dǎo)致小鼠膀胱逼尿肌反射亢進，表現(xiàn)出類似PD患者的刺激性排尿障礙癥狀，相對于猴模型或轉(zhuǎn)基因小鼠，制備該模型過程較簡單，所需的實驗藥品及實驗動物易獲得，可用于PD泌尿功能的評估及相關(guān)病理機制的研究。

此外，研究[16]顯示，PD患者心血管自主神經(jīng)功能障礙與周圍神經(jīng)的去甲腎上腺素能神經(jīng)支配喪失有關(guān)，心臟交感神經(jīng)纖維也存在嚴重耗竭。亞急性MPTP中毒使猴子的交感神經(jīng)末梢系統(tǒng)受到影響，實驗中發(fā)現(xiàn)其心外膜神經(jīng)束中表達酪氨酸羥化酶的軸突數(shù)量顯著減少[17]，與上述研究一致。然而，MPTP治療后的小鼠心肌神經(jīng)纖維未見明顯異常[18]，這可能與物種差異有關(guān)。另有研究[19]發(fā)現(xiàn)，在腹膜內(nèi)注射MPTP[10 mg/(kg·d)，連續(xù)4 d]小鼠表現(xiàn)出心率升高以及RMSSD顯著下降的特征。本研究同樣對小鼠的心血管相關(guān)指標進行評估，以明確慢性MPTP注射是否對小鼠造成外周心血管系統(tǒng)的影響。結(jié)果顯示，兩組小鼠心率及心率變異性相關(guān)指標無明顯差異。曾有研究[20]指出，MPTP對嚙齒類動物心臟損傷的影響是暫時的。本研究小組推測，藥物劑量和給藥間隔時間也可能是造成這些研究結(jié)果不同的原因，慢性MPTP間隔給藥的方式可能使得模型小鼠心功能損傷相對不明顯。既往有研究[21]采用MPTP皮下泵誘發(fā)小鼠PD樣癥狀。持續(xù)緩慢給藥的方式或許可以解決這一缺陷，這值得在未來的科學研究中進一步探索。

本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)MPTP處理的小鼠于第6周出現(xiàn)運動功能受損，兩組小鼠中腦免疫組化染色及蛋白質(zhì)免疫印跡的結(jié)果均提示MPTP誘導(dǎo)的PD慢性小鼠模型中腦多巴胺神經(jīng)元顯著減少，再現(xiàn)了PD運動癥狀和神經(jīng)病理特征，提示慢性MPTP皮下注射可成功誘導(dǎo)出PD小鼠模型。既往有研究[22]發(fā)現(xiàn)，大鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元損耗導(dǎo)致升結(jié)腸乙酰膽堿水平降低，多巴胺水平增加以及多巴胺D1和D2受體減少，可引起胃腸運動障礙。另有研究[23]顯示，與單側(cè)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元退化相比，雙側(cè)受損的PD大鼠表現(xiàn)出更廣泛的行為缺陷和尿動力學變化。本研究相關(guān)分析結(jié)果顯示，MPTP組小鼠胃腸功能及泌尿功能障礙與多巴胺能神經(jīng)元受損也存在一定的相關(guān)性，與上述研究一致，均提示腦內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元丟失可能是PD伴胃腸功能、泌尿功能障礙的原因之一，但具體相關(guān)機制有待更多研究來揭示。

PD自主神經(jīng)功能障礙的癥狀復(fù)雜多變，涉及系統(tǒng)較多，考慮到不同動物模型的局限性對實驗設(shè)計至關(guān)重要，本研究在多個時間點對慢性低劑量MPTP制備的PD模型小鼠自主神經(jīng)功能進行了評估，以驗證該模型對PD自主神經(jīng)功能障礙研究的適用性。目前關(guān)于PD動物模型多系統(tǒng)橫向比較的研究分析較少，多數(shù)研究僅針對單一系統(tǒng)進行分析。本研究通過對多個自主神經(jīng)系統(tǒng)進行動態(tài)分析發(fā)現(xiàn)，MPTP處理小鼠的胃腸功能、泌尿功能障礙均在運動癥狀之前出現(xiàn)，且胃腸功能障礙發(fā)生在泌尿功能障礙之前，心血管功能未見明顯損害，中腦多巴胺能神經(jīng)元受損與胃腸功能、泌尿功能障礙存在著相關(guān)性關(guān)系，即慢性MPTP皮下注射制備的PD小鼠模型可誘導(dǎo)部分自主神經(jīng)功能受損，可用于PD早期胃腸及泌尿系統(tǒng)功能的研究，但不適用于心血管功能的研究。本研究也存在一些局限性。首先，本研究未能持續(xù)評估更長時間，以觀察后期癥狀是否發(fā)生改變；其次，本研究也未能同步觀察腦中多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量，為全面分析癥狀與腦內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元受損的相關(guān)性提供綜合性依據(jù)。因此，今后的研究可以此為基礎(chǔ)，進一步探索并構(gòu)建更加完善的PD伴自主神經(jīng)功能障礙的動物模型，以幫助進行PD自主神經(jīng)功能的相關(guān)研究。