茶花雞FSHR 基因多態(tài)性及其與產(chǎn)蛋性能的相關(guān)性研究

自先念，柳明正，孫大衛(wèi)，杜彥麗，何洋，劉永，王坤，豆騰飛，賈俊靜，葛長榮

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201）

茶花雞是云南六大名雞之一，具有抗病力強、肉質(zhì)鮮美等特點［1］。在養(yǎng)殖過程中，雞的繁殖、生長性能對雞場的經(jīng)濟效益有重要影響，因此在生產(chǎn)過程中如何提高雞的產(chǎn)蛋性能引起越來越多研究者的關(guān)注。雞的產(chǎn)蛋性能通常包括開產(chǎn)日齡、產(chǎn)蛋量、產(chǎn)蛋數(shù)和蛋品質(zhì)等［2］，主要受下丘腦-垂體-性腺軸（HPG）的調(diào)控，由下丘腦和垂體釋放的激素可調(diào)節(jié)卵泡的發(fā)育和排卵［3］。產(chǎn)蛋性能受遺傳和環(huán)境因素影響且遺傳力較低，傳統(tǒng)育種方法（成本高、時間長）很難對其進行選育，利用有效的分子標記對產(chǎn)蛋性能進行分析，將會加速家禽育種進程，豐富我國地方雞種的遺傳資源庫。目前，對茶花雞的研究主要集中在肉質(zhì)和生長等方面，對產(chǎn)蛋性能的研究相對較少。促卵泡激素（FSH）屬于G 蛋白偶聯(lián)受體家族，由垂體分泌，是HPG軸中卵泡發(fā)育關(guān)鍵的調(diào)控因子［4］。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SHR能促進卵細胞成熟、抑制卵泡閉鎖、誘導(dǎo)芳香化酶活性、刺激顆粒細胞增生、誘導(dǎo)黃體素受體（LHR）的產(chǎn)生及誘發(fā)排卵［5］。FSH對類固醇生成、卵泡生長和顆粒細胞的成熟起至關(guān)重要作用［6］。FSH與受體（FSHR）結(jié)合，通過刺激腺苷酸環(huán)化酶和細胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷的產(chǎn)生來介導(dǎo)FSH信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［7-8］。然而，到目前為止關(guān)于茶花雞FSHR基因多態(tài)性及其產(chǎn)蛋性狀的相關(guān)性研究仍未見報道，本研究以高低產(chǎn)茶花雞為研究對象，通過直接測序?qū)ふ褾SHR基因在茶花雞群體中的SNPs 位點，并進行基因分型、群體遺傳學(xué)分析及其與產(chǎn)蛋性狀的關(guān)聯(lián)分析，檢測該基因在2 個群體各組織中的表達水平，旨在發(fā)現(xiàn)有意義的分子標記，為茶花雞的選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗雞

本試驗在西雙版納云嶺茶花雞產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司的育種場進行，挑選同批次1304 只茶花雞在相同環(huán)境內(nèi)進行飼養(yǎng)，并按照我國地方雞飼養(yǎng)標準進行飼喂。雞群開產(chǎn)后記錄每只個體每天產(chǎn)蛋情況及成活率至43 周，經(jīng)整理后得到試驗雞群18周至43 周每周產(chǎn)蛋數(shù)和每周平均蛋重。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣本采集

隨機挑選300 只雞，翅下靜脈采血采集茶花雞血液樣本保存于采血管，采血管中加入抗凝劑保存于?20 ℃冰箱，用于DNA 提取。挑選記錄期內(nèi)實驗雞群產(chǎn)蛋總數(shù)的前20%組成高產(chǎn)組，后20%組成低產(chǎn)組。分別采集高、低產(chǎn)組下丘腦、垂體和卵巢組織，低溫環(huán)境下分割切塊于凍存管迅速置于液氮中，保存于?80 ℃冰箱，用于RNA 提取。

1.2.2 組織RNA 提取與FSHRmRNA 表達水平檢測

按試劑盒操作步驟提取上述組織的RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。利用熒光定量PCR，以β-ac?tin 作為內(nèi)參，利用引物對Fq/Rq 對FSHRmRNA在各組織內(nèi)的表達水平進行檢測。

1.2.3 血液DNA 提取與FSHR基因克隆

按試劑盒操作步驟提取血液的DNA，利用PCR 對FSHR基因進行克隆。經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測后，合格的樣品送至昆明擎科生物有限公司進行測序。

1.2.4 實時定量PCR（RT?qPCR）檢測FSHR的表達

基因組DNA 提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，總RNA 提取試劑盒（柱式法）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒以及SYBR? Premix Ex TaPTM II熒光定量試劑盒均購自寶生物工程（大連）有限公司；根據(jù)GenBank 中原雞（Gallus gallus）的基因序列，使用Primer 5.0 軟件設(shè)計引物（表1），送至北京擎科（昆明）生物有限公司合成。

表1 熒光定量引物信息Table1 Fluorescence quantitative primers information

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

等位基因和基因型頻率，遺傳多樣性和Har?dy-Weinberg 群體遺傳平衡計算采用SHEsis 軟件進行計算。

采用最小二乘法對基因多態(tài)位點和產(chǎn)蛋性狀進行分析，首先建立以下模型：

Y表示產(chǎn)蛋性能的測定值，u表示測定群體性狀的均值，G表示基因型的固定效應(yīng)，e表示隨機誤差，數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析采用SAS（v9.1）系統(tǒng)進行，數(shù)據(jù)用“最小二乘均值±標準誤”的形式表示。

本試驗采用相對定量PCR 檢測目的基因與內(nèi)參基因量，采用SPSS 進行差異顯著性檢驗，通過Excel 處理數(shù)據(jù)和計算得到基因的相對表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1 FHSR 基因多態(tài)性檢測

2.1.1 基因組DNA 提取結(jié)果

從茶花雞血液樣本中用試劑盒提取基因組DNA 后，紫外分光光度計測定OD260nm/OD280nm 的值在1.70~1.85。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，基因組DNA 無污染和降解，滿足PCR擴增要求，可用于后續(xù)試驗。

2.1.2 PCR 擴增產(chǎn)物和結(jié)果

茶花雞FSHR基因外顯子1 的擴增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，條帶清晰無拖尾，所得片段320 bp 與預(yù)期片段大小一致，可用于后續(xù)測序試驗（圖1）。茶花雞FSHR基因的外顯子進行測序，利用DNAstar 軟件對測序結(jié)果與GenBank上提交的雞FSHR基因原序列進行比對分析。結(jié)果在茶花雞FSHR基因外顯子1 上共發(fā)現(xiàn)2 個SNPs，分別位于基因組的34 847 bp 和35 000 bp處，命名為：g.34847A→G、g.35000C→T（圖2）。

圖1 FSHR 基因PCR 產(chǎn)物Fig.1 PCR products of FSHR gene

圖2 FSHR 基因突變位點Fig.2 FSHR gene mutation sites

2.2 FHSR 基因群體遺傳學(xué)分析

2.2.1FHSR基因的群體遺傳參數(shù)

對茶花雞FSHR等位基因和基因型進行統(tǒng)計分析和適合性卡方檢驗（表2），在茶花雞FSHR基因外顯子1 中發(fā)現(xiàn)g.34847A→G 和g.35000C→T兩個SNPs。其中，g.34847A→G 位點只存在AA和GG 兩種基因型，不存在雜合型，AA 基因型頻率為0.07，GG 基因型頻率0.93，GG 型為優(yōu)勢基因型，G 等位基因為優(yōu)勢等位基因，適合性卡方檢驗卡方值為55.88，此位點偏離哈溫平衡（P<0.01）；g.35000C→T 位點存在CC、TT 和CT 基因型，CC 基因型頻率為0.46，TT 基因型頻率為0.12，CT 基因型頻率為0.42，C 等位基因為優(yōu)勢等位基因，卡方檢驗結(jié)果顯示，此位點符合哈溫平衡（P>0.05）。

表2 FSHR 基因SNPs 位點基因型及基因頻率分布Table2 FSHR gene SNPs locus genotype and gene frequency distribution

2.2.2FHSR基因的遺傳多樣性度量參數(shù)

對茶花雞FSHR基因外顯子1 的2 個SNPs 進行群體遺傳學(xué)分析（表3），g.34847A→G 位點的有效基因數(shù)為1.15，純合度為0.87，多態(tài)信息含量為0.12，屬于低度多態(tài)；g.35000C→T 位點有效基因數(shù)為1.79，純合度為0.56，多態(tài)信息含量為0.34，屬于中度多態(tài)。

表3 FSHR 基因純合度、雜合度、有效基因數(shù)及多態(tài)信息含量Table3 FSHR gene homozygosity，heterozygosity，effective gene number and polymorphism information content

2.3 FHSR 基因與茶花雞產(chǎn)蛋性能的關(guān)聯(lián)分析

在FSHR基因不同基因型與茶花雞產(chǎn)蛋性能的相關(guān)分析中（表4），g.34847A→G 位點的AA 型個體的開產(chǎn)日齡早于GG 型，開產(chǎn)體重小于GG型，30 周齡產(chǎn)蛋數(shù)高于GG 型，但差異均不顯著。g.35000C→T 位點的TT 型個體的開產(chǎn)日齡平均值 為167.51，CT 型 平 均 值 為165.43，TT 型 平 均值 為170.26，TT 型 高 于CC 型，顯 著 高 于CT 型（P<0.05）；在43 周齡產(chǎn)蛋數(shù)上，CT 型個體平均值為89.57，CC 型平均值為85.67，TT 型平均值為84.85，CT 型 顯 著 高 于 CC 型 和 TT 型（P<0.05）。

表4 FSHR 基因各SNPs 位點基因型與茶花雞產(chǎn)蛋性能關(guān)聯(lián)分析Table4 Correlation analysis of genotype of each SNPs site of FSHR gene and egg production performance of Chahua chicken

2.4 組織總RNA 提取結(jié)果

采用試劑盒提取茶花雞高低產(chǎn)組各組織總RNA，利用紫外分光光度計測定OD260nm/OD280nm 值，結(jié)果在1.85~2.1，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，分別呈現(xiàn)清晰的28S、18S、5S 三條帶，亮度和寬度逐漸降低，條帶完整無拖尾，表明所提RNA 完整性較好無降解，可用于后續(xù)試驗（圖3）。

圖3 茶花雞組織RNAFig.3 Chahua chicken tissue RNA

2.5 FSHR 基因表達量分析

FSHR基因表達量見圖4，相同組織間比較顯示：FSHR基因在茶花雞垂體的表達量高產(chǎn)組高于低產(chǎn)組，在卵巢和下丘腦的表達量高產(chǎn)組顯著高于低產(chǎn)組（P<0.05）；不同組織間比較顯示：高產(chǎn)組FSHR基因的表達量高低依次為卵巢、下丘腦、垂體，卵巢顯著高于下丘腦和垂體（P<0.05），低產(chǎn)組表達量高低依次為卵巢、垂體、下丘腦，卵巢顯著高于下丘腦（P<0.05）。

圖4 FSHR 基因表達量Fig.4 FSHR gene expression

2.6 FSHR 基因表達量與產(chǎn)蛋性能相關(guān)性分析

FSHR基因表達量與茶花雞產(chǎn)蛋性能相關(guān)分析（表5），F(xiàn)SHR基因在卵巢組織中的表達量與茶花雞30 周齡產(chǎn)蛋數(shù)和43 周齡產(chǎn)蛋數(shù)極顯著相關(guān)（P<0.01），相關(guān)系數(shù)分別為0.81 和0.85；在下丘腦的表達量與30 周齡和43 周齡產(chǎn)蛋數(shù)顯著相關(guān)（P<0.05），相關(guān)系數(shù)分別為0.61 和0.63；在垂體中的表達量與43 周齡產(chǎn)蛋數(shù)顯著相關(guān)（P<0.05），相關(guān)系數(shù)為0.42。

表5 FSHR 基因表達量與產(chǎn)蛋性能相關(guān)性Table5 Correlation between FSHR gene expression and egg production performance

3 討論

廣泛研究表明，F(xiàn)SHR基因多態(tài)性對人和其它動物的生殖性狀有遺傳影響［9-10］。國外有研究人員發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SHR基因啟動上的SNP（?29G>A）影響人類雄性激素水平分泌［11］。Zhang 等［12］在巴克夏豬和皖南黑豬的FSHR基因第10 外顯子上發(fā)現(xiàn)了3 個SNPs（C1491T、G1885A、C1977T）對豬的產(chǎn)子數(shù)有顯著影響，可用于豬品種的標記輔助選擇。Wang 等［13］在小尾寒羊和湖羊上均發(fā)現(xiàn)了g.47C>T 位點與產(chǎn)羔數(shù)顯著相關(guān)聯(lián)。楊孔等［14］在對藏雞產(chǎn)蛋性能的研究中，發(fā)現(xiàn)FSHR基因外顯子1 上也發(fā)現(xiàn)了1 個SNP 位點，且該位點會對藏雞產(chǎn)蛋量產(chǎn)生一定的影響。Li 等［15］在對蘇肯雞和東鄉(xiāng)雞的研究中，在啟動子區(qū)發(fā)現(xiàn)了200 bp 的插入缺失位點，突變位點與雞開產(chǎn)日齡顯著相關(guān)聯(lián)；該研究結(jié)果與Kang 等［16］的研究結(jié)果相同。在本研究中在茶花雞FSHR基因外顯子1 上發(fā)現(xiàn)SNP（g.35000C→T）與茶花雞的開產(chǎn)日齡顯著相關(guān)聯(lián)，這與王克華等［17］的研究結(jié)果相似，他們在如皋黃雞上發(fā)現(xiàn)2 個SNPs（C+29329A，G+51411A）與開產(chǎn)日齡顯著相關(guān)聯(lián)。在茶花雞群體中，SNPs（g.35000C→T）與43 周齡產(chǎn)蛋數(shù)也顯著相關(guān)，其中CT 型43 周齡產(chǎn)蛋數(shù)顯著高于CC 型和TT 型。所以FSHR基因SNPs（g.35000C→T）可能對茶花雞的產(chǎn)蛋有重要影響。另外Li 等［18］在北京油雞的FSHR基因上發(fā)現(xiàn)了5 個與產(chǎn)蛋性能顯著相關(guān)的SNPs；其 中 位 點g.-181A>T，g.159C>T 和g.-310A>G 與不同周齡產(chǎn)蛋數(shù)相關(guān)聯(lián)，位點g.75470A>G 和g.75860G>A 與開產(chǎn)蛋重顯著相關(guān)聯(lián)?？蝶惖龋?9］研究發(fā)現(xiàn)，新楊褐雞FSHR基因5，調(diào)控區(qū)的-868 和-237 兩個SNPs 顯著影響開產(chǎn)日齡和37 周總產(chǎn)蛋數(shù)；Li 等［15］在對東鄉(xiāng)雞和蘇肯雞的研究中發(fā)現(xiàn)FSHR基因SNP（C1684T）上CC 基因型43 周齡產(chǎn)蛋數(shù)高于TC 基因型。此外，Xu 等［20］對 番 鴨 研 究，也 在FSHR基 因 上 檢 測 到SNP（C320T）與59 周齡產(chǎn)蛋量顯著相關(guān)。以上各個研究結(jié)果與本研究結(jié)果相互佐證，說明FSHR基因可能是影響雞產(chǎn)蛋性狀的潛在遺傳標記基因，是控制產(chǎn)蛋性狀的基因之一。可為茶花雞的選育提供一定的理論依據(jù)。

FSHR基因雖然被認為是卵母細胞特異的關(guān)鍵因子，但在除卵巢外的其他性腺器官中也有表達，而基因的表達會受遺傳和環(huán)境等因素的影響，具有性別、組織等特異性［21-23］。陳蘭等［24］研究表明FSHR基因在卵巢和睪丸中高表達，極顯著高于其他組織且該基因基因在母雞卵巢和公雞睪丸組織中均有表達，在公雞的表達呈先高后低持續(xù)下降的趨勢。他的研究結(jié)果與產(chǎn)舒恒等［25］的研究結(jié)果相同。在本研究中FSHR基因在卵巢、下丘腦和垂體中的表達量均是高產(chǎn)組高于低產(chǎn)組，F(xiàn)SHR基因在高低產(chǎn)組卵巢組織中的表達量最高，下丘腦和垂體表達差異不大，這與張響英等［26］的研究結(jié)果相似，她們的研究結(jié)果表明FSHR基因在獅頭鵝的垂體和卵巢組織中均有表達，在卵巢中的表達量顯著高于垂體。張寧波等［27］研究比較了FSHR基因在性早熟品種濟寧百日雞和羅曼褐商品蛋雞卵巢和卵泡中的表達情況，發(fā)現(xiàn)這2 個品種在開產(chǎn)前后卵巢和卵泡中FSHR的表達呈顯著差異。綜上可知，F(xiàn)SHR基因在家禽的生產(chǎn)、繁殖過程中起著重要作用。

4 結(jié)論

本研究在茶花雞FSHR基因第1 外顯子上發(fā)現(xiàn)2 個SNPs 位點，其中g(shù).35000C→T 位點為中度多態(tài)，屬于錯義突變，顯著影響茶花雞的開產(chǎn)日齡和43 周齡產(chǎn)蛋數(shù)。FSHR基因在茶花雞高產(chǎn)組卵巢中的表達量均顯著高于低產(chǎn)組，高低產(chǎn)組卵巢中的表達量均高于下丘腦和垂體，且卵巢中的表達量與30 周齡產(chǎn)蛋數(shù)和43 周齡產(chǎn)蛋數(shù)極顯著相關(guān)。