基于GC-MS的川牛膝酒制前后化學成分變化分析△

童凱，李素峰，賴鑫，趙佳，鐘偉萍，田孟良，張鑫，李東*

1.四川輕化工大學 生物工程學院/釀酒生物技術(shù)及應用四川省重點實驗室，四川 宜賓 644000；2.四川農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院，四川 成都 611130；3.巴中市綠色農(nóng)業(yè)創(chuàng)新研究院，四川 巴中 636000；4.四川省中醫(yī)藥發(fā)展服務中心，四川 成都 610011

川牛膝Cyathula officinalisKuan是我國常見川產(chǎn)道地中藥材之一，也是原中華人民共和國衛(wèi)生部批準可以用于保健食品生產(chǎn)的中藥材原料之一，具有逐瘀通經(jīng)、通利關(guān)節(jié)、利尿通淋的功效。截至2017年10 月，全國已注冊的含“牛膝”類（川牛膝或懷牛膝Achyranthes bidentataBl.）的保健食品共44 個，涉及的功能主要包括增強免疫力、增加骨密度、緩解疲勞等，涉及的劑型有膠囊劑、酒劑、片劑、顆粒劑等，其中酒類劑型約占總數(shù)的18%，是繼膠囊劑后的最常見劑型[1]。在中藥藥品生產(chǎn)或中藥保健食品生產(chǎn)中，川牛膝通常需要經(jīng)過酒制處理以達到增進功效的目的[2]。中醫(yī)認為，藥材經(jīng)酒制處理后可增加或增強其上行、行散的功效，以及祛寒、去腥、助溶、減少不良反應等作用[3]。但是關(guān)于酒制處理對川牛膝化學成分譜的具體影響尚不明確，這限制了川牛膝酒制工藝的改進和產(chǎn)品質(zhì)量控制水平的提升[4]。近年來，從化學成分角度的研究發(fā)現(xiàn)，酒制后川牛膝中除阿魏酸含量略有升高外[5]，其他已知的功效成分，如杯莧甾酮、大豆苷元、葛根素等含量均未出現(xiàn)顯著提升[6]。這提示酒制處理對川牛膝成分譜的影響研究還需要進一步篩選鑒定新的質(zhì)量控制指標成分。因此，本研究采用氣相色譜-質(zhì)譜法（GCMS）聯(lián)合主成分分析（PCA）、偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）及系統(tǒng)聚類分析多變量統(tǒng)計分析方法，對川牛膝酒制前后的化學成分進行測定和分析，以期篩選出更多差異性成分，為含酒制川牛膝的中藥藥品或保健食品的深入開發(fā)和質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

7890型氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；Heraeus Fresco 17 型冷凍離心機（美國賽默飛科技有限公司）；JXFSTPRP-24 型研磨儀（上海凈信科技有限公司）；D24 UV 型純水儀（德國密理博有限公司）；PS-60AL 型超聲儀（深圳市雷德邦電子有限公司）；DHG-9023A 型烘箱（上海一恒科學儀器有限公司）；LNG-T98 型真空干燥儀（太倉市華美生化儀器廠）。

1.2 試藥

川牛膝藥材采集自四川省雅安市寶興縣蜂桶寨鄉(xiāng)，經(jīng)四川農(nóng)業(yè)大學田孟良教授鑒定為莧科植物川牛膝Cyathula officinalisKuan的根。

色譜純甲醇（上海安譜實驗科技股份有限公司）；色譜純乙醇（天津市科密歐化學試劑有限公司）；色譜純?nèi)燃淄椤⑦拎ぃㄉ虾０⑦_瑪斯試劑有限公司）；甲氧胺鹽酸鹽[梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司]；三氟乙酰胺（BSTFA，含1%氯三甲基硅烷，美國Regis公司）；對照品核糖醇（貨號：A5502-5G，純度≥99%，美國Sigma公司）。

2 方法

2.1 藥材處理

取川牛膝新鮮根，除去雜質(zhì)和蘆頭，洗凈、潤透、切薄片，于65 ℃烘干即得生川牛膝。取生川牛膝50 g，按1∶5 加入無水乙醇，參照《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版（四部）附錄（炮制通則）制成酒川牛膝[7]。合計制備生川牛膝和酒川牛膝各6批，分別編號C1～C6（生品）和P1～P6（酒制品），烘干后粉碎過20 目篩，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 分析樣品的制備

分別精密稱取生川牛膝和酒川牛膝樣品50 mg，加入75%甲醇450 μL，加入核糖醇（內(nèi)標物）10 μL，瓷珠研磨儀處理4 min（45 Hz），冰水浴條件下超聲提取5 min（40 kHz，600 W），4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min（離心半徑為10 cm），取上清液，置于真空濃縮器中干燥。然后在干燥后的提取物中加入甲氧胺鹽試劑（20 mg·mL-1，甲氧胺鹽酸鹽溶于吡啶）80 μL，輕輕混勻后，放入烘箱中80 ℃孵育30 min。向每個樣品中加入BSTFA 100 μL，將混合物于70 ℃孵育1.5 h；冷卻至室溫，即得供試品溶液。從各批次樣品中等比例取適量樣品混勻，即得質(zhì)量控制樣品（QC1～QC3）。

2.3 檢測條件

色譜 柱：Agilent DB-5MS（30 m × 250 μm，0.25 μm）；載氣：氦氣；進樣量：1 μL，不分流進樣；隔墊吹掃流速：3 mL·min-1；柱流速：1 mL·min-1；柱箱升溫程序：起始溫度50 ℃，保持1 min，以10 ℃·min-1速度升高至310 ℃，保持8 min；前進樣口溫度：280 ℃；傳輸線溫度：280 ℃；離子源溫度：250 ℃；電離電壓：-70 eV；質(zhì)量范圍：m/z50～500。

2.4 數(shù)據(jù)處理

使用Chroma TOF 4.3x 軟件對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行峰提取、基線矯正、解卷積、峰積分、峰對齊等分析。使用LECO-Fiehn Rtx 5 數(shù)據(jù)庫，根據(jù)質(zhì)譜匹配及保留時間指數(shù)匹配對檢出物質(zhì)進行初步定性。使用MetaboAnalyst 5.0 軟件對數(shù)據(jù)進行預處理和PCA、PLS-DA和系統(tǒng)聚類分析等。

3 結(jié)果與分析

3.1 檢測結(jié)果質(zhì)量控制分析

3 個QC 樣品按上述方法進樣檢測，計算內(nèi)標物質(zhì)（核糖醇）在3 個QC 樣品中的峰面積RSD 為6.67%，計算3 個QC 樣品所有峰面積的數(shù)據(jù)相關(guān)系數(shù)，平均為0.97，以上提示檢測數(shù)據(jù)重現(xiàn)性較好，儀器運行和數(shù)據(jù)采集穩(wěn)定，進一步說明整個方法穩(wěn)定性較好，數(shù)據(jù)質(zhì)量較高，可以用于后續(xù)統(tǒng)計分析。

3.2 酒制前后成分譜輪廓比較

經(jīng)GC-MS 檢測后，從總離子流圖（圖1）可以看出，川牛膝生品和酒制品的化學成分譜輪廓總體相似，難以從直觀上判別兩者的區(qū)別。圖中未明顯觀察到有新成分的大量生成或原成分的大量消失，但部分離子峰強度可能發(fā)生了顯著的變化，提示需要更加細致的數(shù)據(jù)分析。

圖1 川牛膝樣品GC-MS總離子流圖

因此，對各色譜峰進行掃描后，從12 個供試樣品和3 個QC 樣品中共提取出646 個物質(zhì)信號。采用無監(jiān)督分析模式的PCA，對所有樣品酒制前后的全部物質(zhì)峰面積數(shù)據(jù)進行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分析提取出的前2 個主成分PC1 和PC2 共表征了原始數(shù)據(jù)集39%的變異信息。在PC1 和PC2 構(gòu)成的二維得分圖上，來自于同一組別的樣本具有相對集中的分布趨勢，而C 組和P 組之間有較明顯的分離分布趨勢（圖2），這說明酒制處理對川牛膝的總體成分輪廓具有明顯的影響，而且這種影響并不僅針對少數(shù)指標成分，而是針對多成分的總體影響。因此，有必要采用更細致的分析方法進一步篩選造成炮制前后成分譜差異的主要貢獻物質(zhì)。除此之外，在主成分得分圖上，3 個QC 樣品的分布相對集中，這進一步說明所建立的檢測方法穩(wěn)定可靠。

圖2 酒制前后川牛膝樣品差異成分的PCA

3.3 酒制前后差異變化成分篩選

根據(jù)質(zhì)譜匹配相似度及保留時間指數(shù)匹配對檢出物質(zhì)進行初步定性，一共初步鑒定60 個化學成分（表1），主要涉及有機酸、脂肪酸、糖類、氨基酸類等，根據(jù)酒制前后峰面積進行相對定量比較，有18 個成分顯示升高，42 個成分顯示下降，其中山梨醇、氧化脯氨酸、4-氨基丁酸、丙氨酸、丙三醇峰面積發(fā)生顯著下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表1 川牛膝酒制前后GC-MC檢出成分及其峰面積變化趨勢

續(xù)表1

利用上述60 個已鑒定成分的峰面積數(shù)據(jù)，并將各供試川牛膝樣本的分組信息納入分析模型，建立有監(jiān)督的PLS-DA 模型。交叉檢驗顯示，模型擬合度（R2）=0.94，預測度（Q2）=0.54，說明建模效果良好。在此基礎(chǔ)上，提取前2 個主成分繪制得分圖顯示（圖3），C 組和P 組樣本的空間分布仍然可以被明顯地區(qū)分為2 個集群，說明這60 個已鑒定的成分中包含了可以反映川牛膝酒制前后主要差異的物質(zhì)成分信息。在PLS-DA 模型中，第一主成分的變量重要性投影（VIP）值是篩選差異貢獻成分的常用參數(shù)[8-9]，VIP 值＞1 則可視為對于樣本分組具有顯著作用（表1）。在本實驗中，通過分析各成分的VIP值最終篩選得到20個差異貢獻成分，其中包括6個氨基酸類成分、6 個糖類成分、4 個有機酸類成分、2個醇類成分、2個含氮化合物。采用這20個差異成分的峰面積數(shù)據(jù)對各樣品進行系統(tǒng)聚類分析（圖4），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，C組和P組樣品被分別聚為一組，這提示篩選出的20 個差異變化成分可以作為區(qū)別川牛膝生品與酒制品的潛在化學標記。

圖3 酒制前后川牛膝樣品差異成分的PLS-DA

圖4 川牛膝酒制前后20個差異貢獻成分相對含量變化

4 討論

中藥飲片是中成藥和中藥保健食品的直接原料。2019 年針對全國中藥飲片質(zhì)量的抽檢結(jié)果表明，炮制不規(guī)范、加工不到位的問題較多，進而對中藥產(chǎn)品的安全性和有效性形成潛在威脅，這與中藥飲片質(zhì)量標準研究滯后密切相關(guān)[10]。在《中國藥典》2020 年版中，川牛膝無論酒制與否均以杯莧甾酮質(zhì)量分數(shù)不低于0.03%作為含量測定項的質(zhì)量控制指標，缺乏針對酒制飲片的專屬質(zhì)量控制指標?？紤]到中藥產(chǎn)品化學成分的復雜性，以及中藥多成分、多靶點、多途徑作用的特點，以揭示中藥化學成分總體輪廓特征為目標的化學模式識別技術(shù)被廣泛用于中藥加工品的鑒別研究[11-12]。本研究建立的GC-MS從成分整體特征角度將生品與酒制品區(qū)分開來，可以為評價川牛膝酒制品提供參考。

酒制法作為一種常用的中藥材加工方法，在中醫(yī)臨床上通常用以達到引藥上行，增強祛風通絡、矯味矯臭的作用，其原理一般可從藥性、成分、藥理等方面進行闡釋[13]。相關(guān)研究表明，酒制可以顯著影響藥材中有機酸、糖苷、氨基酸、生物堿、黃酮、萜類等多種成分的轉(zhuǎn)化和積累[14-16]，藥材中的氨基化合物（蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸等）和羰基化合物（還原糖、不飽和脂肪酸、醛、酮等）在炮制時經(jīng)縮合、聚合等復雜反應而生成類黑精物質(zhì)的過程，即美拉德反應，可能在中藥的品質(zhì)形成和調(diào)控中發(fā)揮重要作用[17]。美拉德反應不僅能改變中藥的色澤、香味，延長中藥的貨架期和保質(zhì)期，還可能產(chǎn)生新的活性物質(zhì)[18]。在本研究中，利用GC-MS 結(jié)合PLSDA等分析方法，分析川牛膝酒制前后化學成分的變化，一共篩選鑒定了20 個主要的差異變化成分，其中多數(shù)為美拉德反應底物（如糖類和氨基酸類），這提示美拉德反應可能是酒制川牛膝品質(zhì)形成的重要因素。