敲低EEF1A2 增強(qiáng)拉帕替尼對HER2+乳腺癌細(xì)胞的藥效

梁馨予， 劉佳君， 劉建文

（華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室，上海 200237）

乳腺癌已成為世界范圍內(nèi)女性最普遍并首要致死的癌癥[1]，其中HER2+乳腺癌占全部乳腺癌病例的15%～20%，表現(xiàn)為腫瘤組織中HER2 過表達(dá)，并與癌癥的迅速惡化相關(guān)[2]。拉帕替尼（Lapatinib，C29H26ClFN4O4S）是繼曲妥珠單抗之后第二個針對HER2+乳腺癌的分子靶向藥，可阻斷HER2 和表皮生長因子受體（EGFR）的催化作用[3-4]。然而拉帕替尼單藥治療的臨床反應(yīng)較為短暫，腫瘤的獲得性耐藥嚴(yán)重影響其療效，成為亟待解決的問題[5-8]。真核翻譯延伸因子1α2（EEF1A2）是翻譯機(jī)制的關(guān)鍵組成部分，它與GTP 相互作用傳遞氨酰-tRNA 至核糖體以轉(zhuǎn)譯mRNAs，通常只在腦、心臟和骨骼肌等組織中存在；但研究發(fā)現(xiàn)EEF1A2 還在乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌和肝癌等多種癌癥中顯著上調(diào)，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[9-10]。關(guān)于EEF1A2 與乳腺癌臨床特征及腫瘤進(jìn)展關(guān)系的研究尚存在爭議；而EEF1A2 表達(dá)水平與乳腺癌HER2 表達(dá)亞型的相關(guān)性和對耐藥性的改善作用值得深入探究[11-12]。

本文旨在研究EEF1A2 的表達(dá)對HER2+乳腺癌及拉帕替尼體外藥效的影響：首先借助生信技術(shù)分析不同HER2 亞型乳腺癌中EEF1A2mRNA 的表達(dá)情況及預(yù)后意義；其次通過對相關(guān)細(xì)胞進(jìn)行實驗，研究EEF1A2敲低對拉帕替尼抑制HER2+乳腺癌細(xì)胞體外增殖、轉(zhuǎn)移、存活作用的影響；最后揭示下調(diào)EEF1A2 增強(qiáng)拉帕替尼體外藥效的作用機(jī)制。本研究首次探討了HER2+乳腺癌中EEF1A2 的表達(dá)意義和對拉帕替尼作用效果的影響，為拉帕替尼耐藥性的改善提供新思路，有助于更加全面地理解EEF1A2的致癌功能，為HER2+乳腺癌患者的個性化治療提供優(yōu)化方案。

1 實驗部分

1.1 主要試劑和藥物

DMEM 培養(yǎng)基（Dulbecco's modified eagle medium）和胎牛血清（FBS）購自GIBCO 公司；2.5 g/L胰蛋白酶、轉(zhuǎn)染試劑Lipo8000、RIPA 蛋白裂解液（RIPA Lysis Buffer）、苯甲基磺酰氟（PMSF）、二硫蘇糖醇（DTT）、亮肽試劑、電化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒、Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、凝膠回收試劑盒和高純度質(zhì)粒小提試劑盒購自碧云天公司；磷酸緩沖鹽溶液（PBS）購自博士德生物公司；噻唑藍(lán)（MTT）、牛血清白蛋白（BSA）粉末購自Sigma-Aldrich公司；二甲基亞砜（DMSO）、多聚甲醛固定液購自上海凌峰化學(xué)試劑公司；結(jié)晶紫粉末、拉帕替尼購自上海源葉生物科技公司；基質(zhì)膠（Matrigel）和碳酸脂膜（Transwell）小室購自Corning 公司；聚偏氟乙烯（PVDF）膜購自Life Technologies 公司；ErbB-2 抗體購 自Santa Cruz 公 司；EGFR 抗 體、Phospho-EGFRY1068 抗 體 和EEF1A2 抗 體 購 自ABclonal 公 司；Akt 抗體、Phospho-Akt-Ser473 抗體購自Cell Signaling Technology 公 司；β-actin 抗 體、辣 根 過 氧 化 物 酶（HRP）標(biāo)記的二抗購自GeneTex 公司；T4 連接酶、BamHI 限制性內(nèi)切酶和HindIII 限制性內(nèi)切酶購自寶生物工程有 限公司；TransScript II First-Strand cDNA Synthesis SuperMix、EasyTaq DNA Polymerase PCR 試劑盒和Prestain protein marker 購自全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要儀器

高速冷凍離心機(jī)（Dynamica 公司，V14/14R 型）；超凈工作臺（上海博迅實業(yè)有限責(zé)任公司，SW-CJIFD 型）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國賽默飛世爾，F(xiàn)orma 3110型）；電泳儀（北京六一儀器廠，DYY-8C 型）；化學(xué)發(fā)光儀（天能公司，Tanon 5200S 型）；熒光顯微鏡（日本尼康，TI-S 型）。

1.3 實驗方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人源乳腺癌細(xì)胞SKBR3（ER-/PR-/HER2+）和MDA-MB-453（ER-/PR-/HER2+）從中國科學(xué)院細(xì)胞庫（上海）購得。使用FBS 體積分?jǐn)?shù)為15%的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，其中青霉素和鏈霉素終濃度均為100 U/mL，將其置于 CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的空氣、37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

1.3.2 EEF1A2（NM_001958.5）敲低載體的構(gòu)建 根據(jù)pSilencer2.1_U6 載體說明書設(shè)計引物。從Sigma-Aldrich 網(wǎng)站（http://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/）獲 得shRNA EEF1A2 引 物 序 列；正 義 鏈（Forward strand）：5’-GATCCGCAGGACGTGTACAA GATTGGTTCAAGAGACCAATCTTGTACACGTCCT GCTTTTTTGGAAA-3’；反義鏈（Reverse strand）：5'-AGCTTTTCCAAAAAAGCAGGACGTGTACAAGAT TGGTCTCTTGAACCAATCTTGTACACGTCCTG CG-3’，設(shè)計的寡核苷酸鏈在派諾森生物公司合成。PCR 儀進(jìn)行退火形成雙鏈，退火反應(yīng)體系如表1 所示，退火程序為：（1）95 ℃，2 min，變性；（2）每8 s 下降0.1 ℃，降至25 ℃（即循環(huán)700 次），約90 min，退火，4 ℃保存；（3）稱取3.0 g 瓊脂糖粉末于147 mL 超純水和3 mL 10×核酸電泳緩沖液（TAE）中煮沸溶解，并滴加2 μL 溴乙錠（EB），獲得0.02 g/mL 瓊脂糖凝膠，進(jìn)行電泳驗證PCR 產(chǎn)物是否成功連接雙鏈。隨后將pSilencer?2.1-U6 neo 載體酶切，酶切位點為BamHⅠ和Hind Ⅲ，37 ℃ PCR 過夜，體系如表2 所示。瓊脂糖凝膠電泳驗證酶切產(chǎn)物成功后，運(yùn)用凝膠回收試劑盒將PCR 雙鏈產(chǎn)物切膠收回。采用T4 連接酶，使酶切后的質(zhì)粒載體和shRNA 進(jìn)行酶連，16 ℃過夜（約14 h）。將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，擴(kuò)增并提取質(zhì)粒，將擴(kuò)增得到的質(zhì)粒送至華大基因公司測序，使用NCBI網(wǎng)站Blast 工具將公司反饋測序結(jié)果和設(shè)計插入的shRNA 序列進(jìn)行比對檢驗。

表1 引物退火反應(yīng)體系Table 1 Primer annealing reaction system

表2 酶切反應(yīng)體系Table 2 Enzyme digestion system

1.3.3 細(xì) 胞 轉(zhuǎn) 染 將 細(xì) 胞SKBR3 和MDA-MB-453分別以每孔5×105個的密度接種于6 孔板，過夜貼壁生長；將每孔更換2 mL 新鮮培養(yǎng)液，取數(shù)個無菌離心管對應(yīng)于每孔細(xì)胞，每管加入125 μL 不含青鏈霉素及血清的DMEM 培養(yǎng)液和2.5 μg EEF1A2 敲低或?qū)φ蛰d體質(zhì)粒，混勻；再加入4 μL Lipo8000?轉(zhuǎn)染試劑，輕柔混勻；均勻滴加至對應(yīng)孔，輕柔劃十字混勻；繼續(xù)培養(yǎng)約24～48 h 后，進(jìn)行后續(xù)相關(guān)實驗。

1.3.4 MTT 法檢測細(xì)胞增殖活性 預(yù)先將對數(shù)生長期的細(xì)胞SKBR3 及MDA-MB-453 均設(shè)置shEEF1A2組和shCtrl 組：對于shEEF1A2 組細(xì)胞，轉(zhuǎn)染以EEF1A2 shRNA 敲低質(zhì)粒；對于shCtrl 組細(xì)胞，轉(zhuǎn)染以空載對照質(zhì)粒。將各組細(xì)胞均消化制成密度為每微升500 個細(xì)胞的懸液，分別在對應(yīng)的96 孔板中以每孔100 μL 接種，然后于37 ℃、φ為5% CO2培養(yǎng)箱中過夜貼壁培養(yǎng)。用不同濃度（0、0.625、1.25、2.5、5、10 μmol/L）拉帕替尼溶液處理各組細(xì)胞48 h；每孔加入20 μL、5 mg/mL MTT 溶液，放回細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)額外培養(yǎng)4 h；小心吸除上清液，每孔加入100 μL DMSO，選擇酶標(biāo)儀雙波長（λ1= 492 nm，λ2= 630 nm，快速振蕩60 s）檢測各孔細(xì)胞的吸光度值（OD），計算不同濃度拉帕替尼作用下的各組細(xì)胞存活率(加藥處理過的細(xì)胞溶液的吸光度值與不加藥處理的細(xì)胞溶液的比值)。

1.3.5 克隆形成實驗 預(yù)先將對數(shù)生長期的細(xì)胞SKBR3 及MDA-MB-453 均設(shè)置shCtrl 組（轉(zhuǎn)染以空載對照質(zhì)粒）、shCtrl+Lap組（細(xì)胞同時接受空載對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和拉帕替尼的處理）、shEEF1A2 組（轉(zhuǎn)染以shEEF1A2 敲低質(zhì)粒）和shEEF1A2+Lap 組（細(xì)胞同時接受shRNA eEF1A2 敲低質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和拉帕替尼的處理）。將各組細(xì)胞用0.0025 g/mL 胰蛋白酶消化，之后吹打成單個細(xì)胞懸浮于完全培養(yǎng)基中，并于顯微鏡下計數(shù)，計算細(xì)胞密度。將細(xì)胞以每孔500 個的密度接種至24 孔板中，輕柔吹打分散均勻，于37 ℃、φ為5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。隨后將shCtrl+Lap 組和shEEF1A2+Lap 組細(xì)胞每孔更換為300 μL 含5 μmol/L拉帕替尼，將shCtrl 組和shEEF1A2 組細(xì)胞每孔更換為φ＝0.1% DMSO 的新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)2～3 d；隨后更換不含拉帕替尼的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)約3 d。當(dāng)顯微鏡下觀察到多于100 個細(xì)胞聚集的多個細(xì)胞團(tuán)時終止培養(yǎng)，棄去上清液，PBS 洗3 遍，每孔加入300 μL、4 g/L 多聚甲醛，細(xì)胞固定15 min。小心吸去液體，用PBS 浸洗3 遍，每孔加入300 μL、5 g/L 結(jié)晶紫溶液，染色10 min，然后用超純水輕柔淋洗去除染色液，放入通風(fēng)櫥內(nèi)晾干。對每孔的克隆情況拍照，對照片用軟件ImageJ 進(jìn)行計數(shù)。最后計算克隆形成率（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）。

1.3.6 Transwell 遷移侵襲實驗 預(yù)先將對數(shù)生長期的細(xì)胞SKBR3 和MDA-MB-453 設(shè)置為shCtrl 組、shCtrl+Lap 組、shEEF1A2 組和shEEF1A2+Lap 組。

Transwell 遷移實驗：以含有5 μmol/L 拉帕替尼的無血清培養(yǎng)基將shCtrl+Lap 組和shEEF1A2+Lap組以每孔2×105個細(xì)胞的密度分別接種于對應(yīng)的Transwell 上室；以含有φ為0.1% DMSO 的無血清培養(yǎng)基將shCtrl 組和shEEF1A2 組以每孔2×105個細(xì)胞的密度分別接種于對應(yīng)的Transwell 上室。各組細(xì)胞的下室均加入含有φ為10% FBS 的相應(yīng)培養(yǎng)基；在37 °C、φ為5%CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h 后，用4 g/L 多聚甲醛固定并用結(jié)晶紫染色小室膜背面；用熒光顯微鏡拍照，記錄小室膜上細(xì)胞個數(shù)。

Transwell 侵襲實驗：預(yù)先將不含血清和抗生素的DMEM 培養(yǎng)液和Matrigel 膠以1∶6 的體積比混合，向每個上室中加入100 μL 混合液，放入37 ℃培養(yǎng)箱中凝固30 min。其余操作與遷移實驗一致。

1.3.7 流式細(xì)胞術(shù)凋亡檢測實驗 將處于對數(shù)生長期 的SKBR3 及MDA-MB-453 細(xì) 胞 以 每 孔5×105個的密度接種于6 孔板，按要求均設(shè)置為4 組：shCtrl 組、shCtrl+Lap 組、shEEF1A2 組和shEEF1A2+Lap 組。置于37 ℃、φ為5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞過夜貼壁。將shCtrl+Lap 組和shEEF1A2+Lap 組每孔更換為含10 μmol/L 拉帕替尼的培養(yǎng)基，將shCtrl 組和shEEF1A2 組每孔更換含φ為0.1%DMSO 的培養(yǎng)基，隨后再培養(yǎng)48 h。將培養(yǎng)基吸出備用，PBS 輕輕浸洗細(xì)胞，吸出PBS 與舊培養(yǎng)基共同存放，向每孔細(xì)胞加入300 μL 不含EDTA 的胰酶，于37 ℃、φ為5% CO2環(huán)境中完全消化細(xì)胞，加入之前備留的舊培養(yǎng)基以終止消化。收集細(xì)胞至1.5 mL EP 管，1 000 r/min 離 心7 min，吸 除 上 清 液，使 用PBS 重 懸 細(xì) 胞 沉 淀，1000 r/min 離 心7 min；根 據(jù)Annexin V-FITC 試劑盒說明書配制含熒光探針的凋亡檢測孵育液，待上述離心過程結(jié)束后，棄去上清，加入孵育液重懸，并于37 ℃、φ為5% CO2環(huán)境下避光孵育30 min，期間不定期重懸細(xì)胞；孵育結(jié)束后置于4 ℃存放，隨后運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測各組SKBR3 和MDA-MB-453 細(xì)胞的凋亡水平。

1.3.8 Western blot 實驗 使用RIPA（Radio Immuno Precipitation Assay)裂解液提取細(xì)胞蛋白，用考馬斯亮藍(lán)G250 定量，蛋白樣品在10% SDS-PAGE 膠中分離并轉(zhuǎn)印至PVDF 膜；使用5% BSA-TBST 液封閉膜2 h，隨后孵育相應(yīng)的一抗（ErbB-2、EGFR、Phospho-EGFR-Y1068、Akt、Phospho-Akt-Ser473、EEF1A2、βactin)，其中β-actin 作為上樣控制；用TBST 緩沖液浸洗孵育過一抗的PVDF 膜，并對PVDF 膜孵育HRP標(biāo)記的二抗，運(yùn)用ECL 顯色技術(shù)檢測各類蛋白表達(dá)結(jié)果；使用ImageJ 軟件對印跡灰度定量。

1.3.9 數(shù) 據(jù) 分 析 所 有 數(shù) 據(jù) 運(yùn) 用GraphPad Prism 軟件分析。Student's t-tests 計算實驗數(shù)據(jù)的差異性，結(jié)果均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。顯著性差異表示：*為P< 0.05; **為P< 0.01; ***為P< 0.001。

2 結(jié)果與討論

2.1 EEF1A2 mRNA 在乳腺癌組織中過表達(dá)

在線分析工具GEPIA2 整合了包括TCGA 和GTEx項目在內(nèi)的大量腫瘤和正常樣本的RNA-seq 數(shù)據(jù)集，彌補(bǔ)了單一數(shù)據(jù)庫中正常樣本檢測不足的情況，可實現(xiàn)癌癥基因全面表達(dá)分析。首先通過GEPIA2預(yù)測乳腺癌中EEF1A2mRNA 的水平，綜合了1 085份乳腺腫瘤樣本和291 份正常樣本的數(shù)據(jù)，合理考慮“統(tǒng)計量”和“自由度”因素，排除兩組樣本間的數(shù)量差異對P值及統(tǒng)計推斷正確性的影響。結(jié)果如圖1所示，腫瘤組織中的EEF1A2mRNA 水平高于正常組織（P<0.05），證明EEF1A2 在乳腺癌組織中過表達(dá)。

圖1 GEPIA2 在線分析乳腺癌中EEF1A2 的表達(dá)Fig. 1 EEF1A2 expression in breast cancer from GEPIA2 online database

2.2 不同HER2 表達(dá)狀態(tài)下EEF1A2 mRNA 在乳腺癌中的水平及預(yù)后影響

通過GEPIA2 工具進(jìn)行生信分析，研究不同HER2 表達(dá)狀態(tài)下乳腺癌EEF1A2mRNA 的水平及對患者生存的影響。結(jié)果如圖2(a)所示，HER2+乳腺癌組織中EEF1A2mRNA 表達(dá)水平顯著高于正常組織（P<0.05），而三陰性（ER?, PR?, HER2?）乳腺癌中的EEF1A2mRNA 表達(dá)水平與相應(yīng)正常組織無顯著差異（P>0.05）；同時，對比分析HER2+和三陰性乳腺癌組織，發(fā)現(xiàn)HER2+乳腺癌中EEF1A2mRNA的表達(dá)水平顯著更高（P<0.05）。進(jìn)一步進(jìn)行Kaplan-Meier 生存分析研究EEF1A2對乳腺癌患者生存狀況的影響，結(jié)果如圖2(b)和圖2(c)所示，發(fā)現(xiàn)對于HER2+及Luminal B（ER+/PR+, HER2+）型 乳 腺 癌，EEF1A2mRNA 高表達(dá)患者的總生存率顯著低于低表達(dá)患者（P<0.05）；而對于三陰性及Luminal A（ER+/PR+, HER2?）型乳腺癌，總生存率在EEF1A2mRNA高表達(dá)患者和低表達(dá)患者之間并沒有顯著的差異（P>0.05）。由此，乳腺癌中EEF1A2mRNA 的水平及預(yù)后影響與HER2 狀態(tài)相關(guān)，EEF1A2在HER2+乳腺癌中表達(dá)水平更高，并且降低了HER2+乳腺癌患者的總生存率。

圖2 不同HER 表達(dá)狀態(tài)下，乳腺癌中EEF1A2 mRNA 表達(dá)水平及對患者生存的影響Fig. 2 EEF1A2 mRNA expression in breast cancer and its influence on the survival of patients under different HER subtypes

2.3 EEF1A2 敲低拉帕替尼對HER2+乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響

上述研究表明EEF1A2基因的表達(dá)水平及其預(yù)后影響在不同HER2 亞型乳腺癌之間存在顯著性差異，本文基于拉帕替尼對乳腺癌細(xì)胞中HER2 的抑制作用，研究EEF1A2 敲低是否會影響HER2 過表達(dá)乳腺癌細(xì)胞的相關(guān)表型以及細(xì)胞對拉帕替尼的敏感性。通過使用EEF1A2 敲低質(zhì)粒（shEEF1A2）和空載對照質(zhì)粒（shCtrl）轉(zhuǎn)染HER2 過表達(dá)乳腺癌細(xì)胞SKBR3 和MDA-MB-453，Western Blot 法驗證了細(xì)胞中EEF1A2 蛋白的敲低效果（圖3）。

圖3 Western blotting 測定SKBR3(a)和MDA-MB-453(b) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染shRNA EEF1A2 的敲低效果Fig. 3 Knockdown effect of SKBR3 (a) and MDA-MB-453 (b) cells transfected shRNA EEF1A2 by Western blotting

使用系列濃度（0、1.25、2.5、5、10 μmol/L）的拉帕替尼處理EEF1A2 敲低或?qū)φ盏募?xì)胞SKBR3 及MDA-MB-453，通過MTT 實驗檢測細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果如圖4(a)和圖4(b)所示。由圖可得EEF1A2 敲低顯著增強(qiáng)了拉帕替尼對細(xì)胞SKBR3 和MDA-MB-453 生存活性的抑制作用，各組細(xì)胞IC50值列于表3 中。綜合拉帕替尼作用機(jī)制相關(guān)研究文獻(xiàn)中對SKBR3 和MDA-MB-453 細(xì)胞的常用處理劑量[13-16]，以及上述MTT 實驗中拉帕替尼作用于細(xì)胞的IC50值，同時考慮拉帕替尼持續(xù)作用可能使細(xì)胞MDA-MB-453 的耐藥性被進(jìn)一步激發(fā)[13-14,17]，最終選定5 μmol/L 作為隨后實驗中拉帕替尼的工作濃度。克隆形成實驗結(jié)果如圖4(c)和圖4(d)所示，EEF1A2 敲低抑制了SKBR3 和MDA-MB-453 細(xì)胞的生長；而相比于敲低或拉帕替尼單用，EEF1A2 敲低聯(lián)合拉帕替尼的處理更加明顯地抑制了細(xì)胞的集落形成及生長。綜上所述，EEF1A2 敲低增強(qiáng)了拉帕替尼對HER2+乳腺癌細(xì)胞生長增殖的抑制作用。

表3 拉帕替尼作用細(xì)胞SKBR3 和MDA-MB-453 48 h 的IC50 值Table 3 IC50 values of SKBR3 and MDA-MB-453 cells were treated by lapatinib for 48 h

圖4 敲低EEF1A2 增強(qiáng)拉帕替尼對SKBR3 和MDA-MB-453 細(xì)胞增殖能力的抑制作用Fig. 4 Enhancing inhibitory effect of laptinib on SKBR3 and MDA-MB-453 cells proliferation by EEF1A2 knockdown

通過Transwell 實驗檢測處理后細(xì)胞的遷移、侵襲能力，結(jié)果如圖5 所示。結(jié)果表明EEF1A2 敲低減少了細(xì)胞SKBR3 和MDA-MB-453 在Transwell 小室內(nèi)的遷移和侵襲數(shù)量；同時，相比于單獨的拉帕替尼處理或EEF1A2 敲低，兩者的聯(lián)合處理更為顯著地抑制了兩株細(xì)胞的遷移侵襲情況。由此證明，EEF1A2 敲低增強(qiáng)了拉帕替尼對HER2+乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移及侵襲的抑制作用。

圖5 敲低EEF1A2 增強(qiáng)拉帕替尼對SKBR3 和MDA-MB-453 細(xì)胞遷移、侵襲能力的抑制作用Fig. 5 EEF1A2-knockdown enhanced the inhibitions on migration and invasion of SKBR3 and MDA-MB-453 cells induced by lapatinib

同時，已有研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞中EEF1A2 的表達(dá)抑制了細(xì)胞凋亡[10,18]，因此本研究進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)凋亡分析，驗證EEF1A2 敲低對HER2+乳腺癌凋亡情況的影響，并檢測敲低對拉帕替尼作用下HER2+乳腺癌細(xì)胞凋亡水平的改變（圖6）。結(jié)果表明下調(diào)EEF1A2 的表達(dá)能促進(jìn)細(xì)胞SKBR3 和MDA-MB-453 的凋亡，并且在EEF1A2 敲低聯(lián)合拉帕替尼的作用下，SKBR3 和MDA-MB-453 細(xì)胞的凋亡水平被進(jìn)一步顯著提高。由此表明，EEF1A2 蛋白的敲低增強(qiáng)了拉帕替尼對HER2+乳腺癌細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用。

圖6 敲低EEF1A2 增強(qiáng)拉帕替尼對SKBR3 和MDA-MB-453 細(xì)胞促凋亡作用Fig. 6 EEF1A2-knockdown enhanced the promotion on apoptosis of SKBR3 and MDA-MB-453 cells induced by lapatinib

2.4 EEF1A2 敲低增強(qiáng)拉帕替尼對HER2+乳腺癌細(xì)胞中HER2/AKT 通路的影響

眾多研究已證明HER2 過表達(dá)和EGFR 活化在促進(jìn)乳腺癌進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[19-20]，從而在此基礎(chǔ)上研發(fā)了包括HER2/EGFR 雙靶點抑制劑拉帕替尼在內(nèi)的眾多靶向藥。同時，PI3K/AKT 被視為HER2 及EGFR 下游的重要作用通路，該通路的異常激活會促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移和運(yùn)動，抑制細(xì)胞的凋亡；而另有研究表明乳腺癌中EEF1A2 致癌功能的發(fā)揮需依靠AKT 的活化[18,21-24]。上述生信分析和細(xì)胞實驗結(jié)果顯示EEF1A2mRNA 的表達(dá)水平及作用與乳腺癌的HER2 狀態(tài)存在明顯關(guān)系，并且EEF1A2 蛋白的下調(diào)增強(qiáng)了拉帕替尼對HER2+乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移及存活等的抑制作用。因此本文將探究EEF1A2 敲低對乳腺癌細(xì)胞中HER2 表達(dá)、EGFR 及AKT 活化情況的影響，并揭示下調(diào)EEF1A2 蛋白以增強(qiáng)拉帕替尼對HER2+乳腺癌細(xì)胞藥效的作用機(jī)制。本文對SKBR3和MDA-MB-453 細(xì)胞進(jìn)行EEF1A2 敲低以及拉帕替尼（5 μmol/L）處理，隨后的Western blot 結(jié)果如圖7所示，結(jié)果表明拉帕替尼作用后SKBR3 和MDAMB-453 細(xì)胞中EEF1A2 的表達(dá)無顯著變化。

圖7 拉 帕 替 尼 對 SKBR3 和 MDA-MB-453 細(xì) 胞 中EEF1A2 蛋白表達(dá)的影響Fig. 7 Effect of lapatinib on EEF1A2 expressions in SKBR3 and MDA-MB-453 cells

對于HER2 表達(dá)情況的檢測結(jié)果如圖8 所示，發(fā)現(xiàn)敲低EEF1A2 降低了細(xì)胞中HER2 的表達(dá)水平；并且相比于單用拉帕替尼，EEF1A2 蛋白的敲低進(jìn)一步增強(qiáng)了拉帕替尼對SKBR3和MDA-MB-453 細(xì)胞中HER2表達(dá)的抑制作用。EGFR 的檢測結(jié)果表明，在拉帕替尼正常抑制細(xì)胞中EGFR 磷酸化的情況下，敲低EEF1A2 并未對p-EGFR 的相對表達(dá)水平產(chǎn)生明顯影響，也未顯著加強(qiáng)拉帕替尼對EGFR 磷酸化的抑制作用（圖9）。然而，對于HER2 及EGFR 的重要下游效應(yīng)器AKT，EEF1A2 的敲低抑制了SKBR3 和MDA-MB-453 細(xì)胞中AKT 的磷酸化，并且進(jìn)一步顯著降低拉帕替尼處理下p-AKT/AKT 的相對水平（圖9）。本研究表明拉帕替尼的處理對細(xì)胞中EEF1A2 表達(dá)無明顯影響；而敲低EEF1A2 顯著增強(qiáng)了拉帕替尼對HER2 過表達(dá)乳腺癌細(xì)胞中的HER2/AKT 通路的影響，促進(jìn)了拉帕替尼對HER2 表達(dá)及AKT 活化的抑制作用（圖10）。

圖8 敲 低EEF1A2 后 拉 帕 替 尼 對 細(xì) 胞SKBR3 和MDAMB-453 HER2 表達(dá)的影響Fig. 8 Effect of EEF1A2-knockdown on HER2 expressions induced by lapatinib in SKBR3 and MDA-MB-453 cells

圖9 SKBR3 和MDA-MB-453 細(xì)胞中敲低EEF1A2 后拉帕替尼對AKT 磷酸化的抑制作用Fig. 9 Inhibition of lapatinib on AKT phosphorylation in SKBR3 and MDA-MB-453 cells by EEF1A2 knockdown

圖10 HER2+乳腺癌細(xì)胞中EEF1A2 作用機(jī)制簡圖Fig. 10 Summary of mechanism involving EEF1A2 for HER2-positive breast cancer cells

3 討 論

當(dāng)前研究證明EEF1A2 不僅是一種重要的翻譯因子，還是乳腺癌中的高表達(dá)蛋白[10]，它能通過凋亡抑制、錯折疊蛋白降解、熱休克反應(yīng)和氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)等多種途徑促進(jìn)乳腺癌的惡性進(jìn)展[25]，而對于EEF1A2 與乳腺癌HER2 表達(dá)特征及不同亞型腫瘤進(jìn)展關(guān)系的研究尚存在爭議[26-27]。在該項研究表明EEF1A2 在乳腺癌組織中高水平表達(dá)（圖1），與已有報道相一致。同時，分析結(jié)果還顯示EEF1A2 在HER2+乳腺癌中高表達(dá)，并且顯著降低了HER2+乳腺癌患者的生存率（圖2）。

為驗證EEF1A2 對HER2 過表達(dá)乳腺癌細(xì)胞生長和存活的影響，探究EEF1A2 表達(dá)下調(diào)對HER2+乳腺癌靶向抑制劑拉帕替尼藥效作用的改變，本研究借助shRNA 質(zhì)粒敲低SKBR3 和MDA-MB-453 細(xì)胞中EEF1A2 的表達(dá)（圖3），在拉帕替尼的作用下進(jìn)行MTT、克隆形成、Transwell 和凋亡檢測實驗。結(jié)果表明敲低HER2+乳腺癌細(xì)胞SKBR3 和MDA-MB-453 中的EEF1A2 后，細(xì)胞的體外增殖、遷移能力被抑制，凋亡被促進(jìn)；同時令人意外的是，EEF1A2 的敲低還會顯著增強(qiáng)拉帕替尼對乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制，并且進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞的凋亡（圖4～圖6）。雖然不同乳腺癌細(xì)胞株在遺傳學(xué)和表型上的差異表現(xiàn)，可能造成了SKBR3 和MDA-MB-453 細(xì)胞間生物學(xué)行為以及對HER2 抑制劑的敏感性存在一定差異[13,28]，不影響整體實驗結(jié)果及結(jié)論。

為探究HER2+乳腺癌細(xì)胞中EEF1A2 蛋白表達(dá)敲低后拉帕替尼抑制效果增強(qiáng)的作用機(jī)制，本文進(jìn)行了相關(guān)的Western blot 檢測。結(jié)果顯示，拉帕替尼的處理不會影響SKBR3 和MDA-MB-453 細(xì)胞中EEF1A2 的表達(dá)（圖7）。而本研究首次發(fā)現(xiàn)EEF1A2敲低抑制了細(xì)胞中HER2 的表達(dá)；且相比于單獨處理，EEF1A2 敲低聯(lián)合拉帕替尼進(jìn)一步顯著降低了HER2 的表達(dá)水平（圖8）。同時，對于乳腺癌細(xì)胞中拉帕替尼的另一作用靶點EGFR，其磷酸化水平基本不受EEF1A2 表達(dá)敲低的影響（圖9）。許多研究表明EEF1A2 需要依賴AKT 的激活來表達(dá)其促癌功能[18,21-24]，且拉帕替尼耐藥的HER2+乳腺癌細(xì)胞常表現(xiàn)PI3k/Akt/mTOR 信號的再度激活[29]；本研究發(fā)現(xiàn)EEF1A2 蛋白的下調(diào)或拉帕替尼的處理都能抑制SKBR3 和MDA-MB-453 細(xì)胞中HER2 下游AKT的磷酸化，并且聯(lián)合處理的結(jié)果進(jìn)一步驗證了敲低EEF1A2 增強(qiáng)拉帕替尼對p-AKT 的抑制作用（圖9）。因此，本文證明了下調(diào)EEF1A2 蛋白會增強(qiáng)拉帕替尼對HER2+乳腺癌細(xì)胞中HER2/AKT 通路的影響（圖10）。

綜上所述，HER2 過表達(dá)乳腺癌中HER2 和EEF1A2 之間可能存在功能性關(guān)聯(lián)。在運(yùn)用HER2抑制劑治療HER2+乳腺癌的同時，可以考慮對EEF1A2 進(jìn)行阻斷以增強(qiáng)治療效果。關(guān)于EEF1A2靶向藥，例如Plitidepsin[30]的研發(fā)，將有助于解決乳腺癌耐藥性問題。同時，鑒于EEF1A2 在乳腺癌中的高表達(dá)及其促癌功能[10-12,31]，參考EEF1A2 在HER2+乳腺癌組織中的表達(dá)水平明顯高于HER2?乳腺癌組織的臨床數(shù)據(jù)，推測EEF1A2 具有作為診斷HER2+乳腺癌標(biāo)志蛋白的潛力。