新型肌肉高效親和AAV 血清型的開發(fā)

陳 穎， 吳佳梅， 凌菲香， 曾步兵， 鄭 靜， 吳 俠， 趙 鍇， 肖 嘯

（華東理工大學藥學院，上海 200237）

自1989 年進行首次人類基因轉移實驗以來，基因治療（Gene Therapy）發(fā)生了翻天覆地的變化，其原理是修復失活或替換導致疾病功能異常的基因，從而重新建立其正常功能[1]。目前用于遺傳疾病的大多數(shù)體內基因治療策略主要圍繞了兩種病毒載體：一是將基因離體轉移到造血干細胞和其他干細胞中的慢病毒載體[2]；二是以腺相關病毒（AAV）為載體將基因轉移到有絲分裂的細胞中進行治療[3]。

AAV 最早于1965 年被發(fā)現(xiàn)為猿猴15 型腺病毒（Simian adenovirus 15，SV15）制劑中的污染物，該病毒來自被SV15 感染的恒河猴腎細胞培養(yǎng)物[4]。AAV 被歸類為細小病毒科的依賴病毒屬，由直徑約26 nm 的 二 十 面 體 蛋 白 衣 殼 和 約4.7 kb 的 單 鏈DNA 基因組組成[5]，其結構中包含3 個基因Rep，Cap和AAP參與病毒基因的復制、包裝、蛋白衣殼表達等，在病毒生命周期中起著重要作用[6]。

AAV 具有廣泛的宿主組織嗜性[7]，可感染分裂細胞和非分裂細胞，且安全性高，這對于全身基因傳遞是一個優(yōu)勢[8]。目前已經從人和動物組織中分離出了多種AAV 血清型，包括至少12 種自然存在的血清型和100 多種變體，但是尚無與任何已知疾病相關的AAV 血清型[9-10]。各種疾病患者的臨床試驗中的流行病學分析表明，40%～80%的人群血清抗AAV 抗體呈陽性[11]，這表明人源衣殼作為基因治療載體可能不是理想的選擇，因為機體可能存在針對其衣殼的抗體，從而降低轉導效率。非人源衣殼可以避免人類本身存在的免疫反應；同時許多AAV 治療策略注重細胞或組織特異性表達，故目前許多研究集中于從其他脊椎動物物種中分離出AAV 衣殼，或者對人源AAV 衣殼進行改造，從而減少中和抗體并且實現(xiàn)靶向治療。

目前已有3 種主要技術來進行AAV 衣殼改造，分別是合理設計、定向改造和計算機輔助設計。改善載體衣殼的首批方法是通過合理設計進行改造，此類策略始于簡單嫁接與細胞類型特異性受體結合的肽序列[12]。此方法不僅可以重新定位衣殼，而且還具有阻止免疫學識別的能力。合理設計方法的局限性主要與AAV 細胞表面結合、運輸、脫膜和基因表達有關的知識不足有關。因此，從頭開始的發(fā)現(xiàn)方法即定向進化策略，在許多情況下都是有利的[13-19]。定向進化技術包括易錯PCR（Polymerase Chain Reaction）、基因改組、蛋白質片段的靶向重組、合理設計和定向進化結合設計，此方法可以改善或改變生物產品的功能，并已用于開發(fā)AAV 載體。最近新穎的衣殼工程的計算機方法已經引起了關注。這種方法是通過計算機設計利用DNA 序列信息和AAV 血清型之間的系統(tǒng)分析來構建潛在的AAV 衣殼庫[20-21]，產生具有增強轉導的新衣殼變體[22]。

本文通過對AAV 衣殼改造并在肌肉細胞C2C12 中進行篩選以期獲得具有高效肌肉親和性的新型AAV 血清型，實驗過程主要通過肽展示的方法在AAV5 的Cap序列573 位氨基酸后隨機插入7 個氨基酸片段，篩選得到具有高效肌肉感染能力的AAV5 突變體，并在體內體外對其進行驗證。結果表明，本文篩選所得的新型AAV 突變體AAVc1 具有更高的肌肉感染效率，同時中和抗體較低。

1 實驗部分

1.1 原料和試劑

AAV5、AAV8、AAV9 3 種血清型腺相關病毒、pAAV-CMV-GFP 質 粒、 輔 助（ pHelper） 質 粒、Ad5（Adenovirus 5，Ad5）質粒為本實驗室所有；Primer STAR 高保真酶、T4 連接酶、Benzonase 酶、DNase I酶購自日本TaKaRa 公司；qPCR SYBR Green Master Mix 購自南京諾唯贊生物科技有限公司；各種限制性內切酶、銀染試劑盒購自賽默飛世爾科技公司；膠回收 試 劑 盒 購 自Omega Bio-Tek 公 司；NucleoBond Xtra 去內毒素大抽試劑盒購自德國Macherey-Nagel 公司；胎牛血清（FBS）、DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle ’s Medium） 高 糖 培 養(yǎng) 基、 雙 抗（Penicillin-Streptomycin，PS）、胰 蛋 白 酶（Trypsin，0.25%）購自美國Gibco 公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）購自美國HyClone 公司；雞胚提取物（Chicken Embryo Extract）購自愛必信（上海）生物科技有限公司；GFP tag antibody 購自武漢三鷹生物技術有限公司；曲拉通（Triton X-100）、BSA（Bovine Serum Albumin）、氯化 鈉、 碘 克 沙 醇、 Tris-HCl、 蔗 糖 購 自Sigma-Aldrich 公司；OCT（Optimal Cutting Temperature）包埋劑購自德國萊卡公司；多聚甲醛組織固定液購自武漢塞維爾生物科技有限公司；HEK293 細胞、C2C12 細胞購自ATCC 公司；C57BL/6 小鼠購自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司；猴血清來自重慶眉山猴廠，編號為11559、13061、13073 等。

1.2 實驗儀器

臺式離心機（FRESCO21 型）、二氧化碳培養(yǎng)箱（BB150 型）購自賽默飛世爾科技公司；超高速離心機（CP70ME 型）購自日本日立公司；PCR 基因擴增儀（Veriti DX 型）購自美國應用生物系統(tǒng)公司；電泳電源（DYY-6D 型）、電泳槽（DYCP-31DN 型）購自北京六一生物科技有限公司；紫外透照臺（TL-TM FL-26 型）購 自 美 國Analytik Jena 公 司；凝 膠 成 像 儀（Tanon-2500 型）購自上海天能科技有限公司；多功能酶標儀（Synery H1 型）購自美國伯騰儀器有限公司；恒溫金屬浴（MK20 型）購自杭州奧盛儀器有限公司；全溫落地搖床（ZWY-211C 型）購自上海智城分析儀器制造有限公司； 實時定量基因擴增儀（QTOWER3.0 型）購自德國耶拿分析儀器公司；冰凍切片機（CM1950 型）、熒光倒置顯微鏡（DMIL 型）購自德國萊卡公司；移液器購自艾本德(中國)有限公司；生化安全柜（BSC-1399IIA2 型）、凈化工作臺（CA-1390-1 型）購自上海上凈凈化有限公司。

1.3 實驗步驟

1.3.1 肽展示（Peptide display） AAV 肽展示是基于單個血清型骨架，在衣殼表面的暴露位置，引入具有隨機序列的寡核苷酸的定向改造AAV 衣殼的方法[23-24]。該方法能產生大量可以用于AAV 進入靶細胞的肽，并鑒定具有增強轉導效率的變體。本研究在AAV5Cap基因573 位氨基酸后隨機插入7 個寡肽核苷酸，并進行合成，用于后續(xù)篩選。

1.3.2 細胞培養(yǎng)、轉染、病毒包裝、純化、感染 將HEK293 細胞用含10% (體積分數(shù)，下同）FBS、1%（體積分數(shù)，下同）雙抗的DMEM 高糖培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。將C2C12 成肌細胞用含20% (體積分數(shù)，下同）FBS、1%雙抗、1%（體積分數(shù)，下同）雞胚提取物的DMEM 高糖培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。為了生產表達GFP的AAV，利用AAV 包裝質粒、pHelper 質粒、pAAVCMV-GFP 質粒在聚乙烯亞胺（Polyethylenimine，PEI）條件下進行三質粒轉染。48 h 后，收集細胞并通過離心沉淀，將細胞重懸于含150 mmol/L NaCl、50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）的PBS 溶液中，冷凍融化數(shù)次，并在37 °C 下用Benzonase 酶（50 U/mL）處理30 min，通過離心去除細胞碎片，并將上清液加到碘克沙醇梯度溶液（PBS 配制體積分數(shù)為10%、20%、40%、50%碘克沙醇溶液）中，在4 °C 下以78000 r/min 的轉速離心2 h，然后從40%碘克沙醇相中收獲病毒顆粒[25]。將收獲的病毒以感染復數(shù)為1×105vg/cell 感染C2C12 細胞，觀察GFP 綠色熒光表達，每組平行進行5 次實驗。

1.3.3 實 時 熒 光 定 量PCR 采 用 實 時 熒 光 定 量PCR 對收集的病毒進行滴度檢測，以pAAV-CMVGFP 為標準品，在GFP基因上設計上游引物和下游引物；將5 μL 病毒樣品，加入1 μL、5 U/μL DNaseI 酶，并用ddH2O 補充體積至20 μL，于37 °C 水浴鍋中消化1 h，然后取出于100 °C 滅活10 min。消化后的樣品稀釋10 倍并進行熒光定量PCR 反應，反應體系總體積為20 μL，依次加入2×qPCR SYBR Green Master Mix 10 μL、上游/下游引物各0.5 μL、稀釋后的病毒模板1 μL、ddH2O 8 μL。反應程序為95 °C, 預變性5 min；95 °C, 變性10 s；60 °C，退火40 s；變性和退火兩個步驟反復40 個循環(huán)。溶解曲線為平衡15 s，△T=1 °C，升溫速率5 °C/s。根據擴增循環(huán)次數(shù)Ct（Cycle threshold）值計算包裝病毒滴度。

1.3.4 銀染 銀染是一種用于檢測聚丙烯酰胺凝膠中蛋白和核酸的高靈敏度方法，其原理是銀離子在堿性條件下被還原成金屬銀，沉淀在蛋白質的表面顯色。AAV 的外殼由VP1、VP2、VP3 3 種蛋白按1∶1∶10 數(shù)量比組成，利用Thermo Scientific 的銀染試劑盒對收集的病毒顆粒進行純度分析。

1.3.5 動 物 實 驗 選 用6～8 周 齡 的SPF（Special Pathogen Free）級 普 通 野 生 型C57BL/6 小 鼠，以3×1011vg/leg 的劑量將AAV9、AAVc1 包裝GFP 的病毒肌肉注射小鼠，每組設5 只小鼠。注射病毒3 周后，分別取小鼠脛前?。═ibial Anterior，TA）、比目魚?。⊿oleus，SO）和腓腸?。℅astrocnemius，GA）作樣品。將樣品置于多聚甲醛組織固定液中浸泡24 h，后取出置于0.15 g/mL 蔗糖溶液中進行脫水沉糖，觀察肌肉沉入底部，換用0.3 g/mL 蔗糖溶液繼續(xù)脫水。梯度沉糖后用OCT 包埋劑進行包埋，并進行冰凍切片，切片厚度為25 μm。

1.3.6 免疫熒光染色 對所得的冰凍切片中的GFP目的基因進行免疫熒光染色。首先將樣品置于56 °C 烘箱中烤片15 min，取出用PBS 沖洗3 次，每次10 min；用5%（體積分數(shù)，下同）BSA，1% （體積分數(shù)，下 同）Triton-X100 的PBS 溶 液 封 閉2 h；取GFP 抗體按1∶500 的體積比溶解 在 含5% BSA、0.5% Triton-X100 的PBS 溶液中，滴加至切片上，于4 °C 冰箱孵育過夜。隔天取出切片用0.5% Triton-X100 的PBS 溶液沖洗3 次，每次10 min；將二抗和DAPI（4′,6-diamidino-2-phenylindole）分 別 按1∶500和1∶1000 的體積比溶解于含5% BSA、0.5% Triton-X100 的PBS 溶液中，滴加至切片上，常溫孵育2 h后，沖洗3 次，每次10 min；然后滴加防熒光淬滅封片劑，蓋上蓋玻片封片，并在熒光倒置顯微鏡下觀察GFP 熒光表達。

1.3.7 中和抗體檢測 將AAV9 和AAVc1 分別包裝高斯熒光素酶報告基因Gluc，根據中和抗體檢測方法進行檢測[26]，將細胞Huh7 以每孔1×105個細胞的密度接種到48 孔板中。將血清樣品按照2 倍梯度進行稀釋，稀釋體積比分別為1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32，將1×108個AAV-Gluc 病毒顆粒與血清樣品稀釋液在4 ℃共同預孵育2 h，將該混合物加入細胞孔板中一起培養(yǎng)。AAV 轉導后48 h，使用多功能酶標儀測量細胞裂解物中的熒光素酶活性。與PBS 預孵育的AAV-Gluc 載體轉導的細胞相比，血清內中和抗體滴度為將熒光素酶活性降低50%的樣品的最高稀釋度。

2 實驗結果

2.1 新型AAV 血清型的研發(fā)

2.1.1 篩 選 高 效 肌 肉 親 和 性AAV5 突 變 體 利 用Peptide display 技 術 構 建AAV5 嵌 合 文 庫 并 從C2C12 細胞中篩選高效肌肉親和性突變體，結果如圖1 所示。在AAV5 的Cap基因N573 后隨機插入7 個氨基酸寡肽片段，經合理設計并合成AAV5 隨機質粒文庫，將構建的病毒包裝質粒與pHelper 質粒共轉染至HEK293 細胞形成感染性的嵌合AAV5文庫。

圖1 從C2C12 成肌細胞中篩選AAV5 突變衣殼Fig. 1 Screen of AAV5 mutant capsids from C2C12 myoblast cell

肌肉細胞對野生型AAV5 的轉導敏感性很低，為了篩選得到高效感染肌肉細胞的AAV5 突變體，將AAV5 嵌合文庫與Ad5 質粒(感染復數(shù)為25 pfu/cell)共感染小鼠C2C12 成肌細胞，48 h 后收取細胞裂解液，用于下一輪的感染，如此反復感染C2C12 細胞4～5 次，將每個感染周期收集的病毒提取病毒DNA，并對Cap基因隨機插入區(qū)域進行測序，分析出現(xiàn)頻次最高的突變體，說明該突變體在細胞C2C12 中有較高的轉導效率，如此得到插入寡肽片段為PGPSPAD 的突變體，以下均稱為AAVc1,將其作為候選新型AAV 血清型用于后續(xù)分析。

2.1.2 不同AAV 血清型效價分析 對AAVc1 以及幾種不同野生型AAV 血清型包裝效率進行熒光定量PCR 和銀染分析，結果如表1 所示。將所得新型突變體AAVc1 包裝質粒、輔助質粒（pHelper）、表達目 的 基 因GFP的 質 粒（ pAAV-CMV-GFP） 按 照1∶2∶1 的質量比共轉染HEK293 細胞，72 h 后收集細胞上清以及細胞，經反復凍融以及純化后收集病毒。選取幾種野生型AAV 血清型AAV5、AAV8、AAV9 重復上述操作，如此獲得不同血清型包裝GFP 的病毒。對4 種病毒進行qPCR 定量分析得到病毒滴度值，同時利用銀染定量AAV 總蛋白量，二者比值為包裝病毒的實心率即實心與總蛋白的比例。通過計算得到AAV5、AAV8、AAV9 和AAVc1的實心率分別為66.06%，47.38%，38.74%和66.32%。這說明AAVc1 與AAV5 的實心率相差不大，但相對于AAV8，AAV9 則有更高的包裝效率，說明篩選所得AAVc1 具有較高且穩(wěn)定的病毒包裝效率。

表1 AAV 血清型效價的定量Table 1 Quantification of AAV serotype titer

2.2 不同AAV 血清型感染C2C12 成肌細胞

為了探究AAVc1 包裝GFP報告基因感染C2C12 細胞的轉染效率，將上述4 種血清型包裝GFP的病毒以感染復數(shù)1×105vg/cell 感染C2C12 細胞，于72 h 后觀察綠色熒光表達，表達情況如圖2（a）所示?？梢钥闯鱿鄬τ趲追N野生型的AAV 血清型，AAVc1 有更強的熒光表達。同時對感染C2C12 細胞中呈現(xiàn)GFP 陽性的細胞進行了定量分析如圖2（b）所示，對其中的GFP 陽性細胞以及總細胞進行計數(shù)，可見AAVc1 陽性細胞數(shù)顯著高于其他3 種野生型AAV。已知AAV5 感染肌肉效率低，而AAV8、AAV9對全身器官和組織有普遍的感染效率，相比較之下，新篩選得到的AAVc1 顯示了強大的肌肉細胞感染效率。

圖2 AAV 在C2C12 成肌細胞中的轉導效率Fig. 2 Transduction efficiency of AAV in C2C12 myoblast cell

2.3 AAV9-GFP 和AAVc1-GFP 肌肉注射小鼠

為了進一步驗證AAVc1 強大的肌肉轉導效率，用AAVc1-GFP（AAVc1 包裝質粒GFP 獲得的病毒）和AAV9-GFP（AAV9 包裝質粒GFP 獲得的病毒）以3×1011vg/leg 的劑量肌肉注射WT 小鼠，觀察其在體內的感染效率，結果如圖3 所示。在病毒注射小鼠3 周后進行解剖取小鼠腿部肌肉，分別取小鼠脛前肌、比目魚肌和腓腸肌進行冰凍切片以及GFP 的免疫熒光染色。因骨骼肌纖維主要分慢肌纖維（I 型）和快肌纖維（II 型），I 型肌纖維收縮慢，靠線粒體氧化磷酸化供能；II 型肌纖維收縮快，主要以糖酵解反應供能。而脛前肌以II 型肌纖維為主，比目魚肌以I 型肌纖維為主，腓腸肌則是混合肌含兩種肌纖維[27]，故可觀察GFP 在不同類型肌肉中的表達。由圖3（a）可以觀察到小鼠3 種腿部肌肉中的綠色熒光表達，AAVc1 顯著高于AAV9；本文量化了轉導效率，對免疫熒光圖中的GFP 陽性細胞以及總細胞計數(shù)，將GFP 陽性肌肉細胞數(shù)的比例以及熒光強度進行了對比，結果如圖3（b）、3（c）所示，AAVc1 和AAV9 在感染小鼠肌肉上有著顯著性差異。同時AAVc1 對不同的肌肉類型均有較強的轉導效率，進一步說明了其強大的肌肉轉導效率。

圖3 AAV 在小鼠肌肉中的轉導效率Fig. 3 Transduction efficiency of AAV in mouse muscle

2.4 猴子血清中和抗體檢測

將AAV9 和AAVc1 分別包裝高斯熒光素酶報告基因Gluc用于中和抗體檢測，檢測10 只猴子血清中對這兩種血清型的中和抗體滴度，結果如表2 所示。定義猴血清的稀釋比為中和抗體滴度，使用多功能酶標儀檢測高斯熒光素酶活性并計算得到中和抗體滴度值，滴度值大于1∶4 為中和抗體陽性，小于或等于1∶4 為陰性，可以看出AAVc1 的中和抗體滴度相對于AAV9 整體偏小，部分猴子對AAV9 顯示有較高的中和抗體，而對AAVc1 的中和抗體滴度很低。這說明相對于AAV9，新型AAV 血清型AAVc1有較低的中和抗體滴度。應用到臨床中時，體內有較高AAV9 中和抗體的患者可以選用AAVc1 這一血清型進行治療，從而擴大了臨床使用AAV 治療疾病的選擇。

表2 猴子血清中不同AAV 血清型的中和抗體檢測Table 2 Detection of neutralizing antibodies of different AAV serotypes in monkey serum

3 討 論

目前AAV 在基因治療中顯示出巨大的潛力，但依舊面臨諸多的挑戰(zhàn)，如AAV 衣殼的免疫反應、無效的病毒生產和純化方法、缺少組織器官特異性以及缺乏評估人類臨床試驗中AAV 轉導效率的可靠系統(tǒng)。AAV 載體的遺傳修飾可以克服其在臨床應用的一些障礙，對AAV 衣殼進行修飾能夠增強轉基因表達并且阻止對AAV 衣殼和轉基因的免疫反應。本研究旨在獲得具有高效肌肉親和性新型AAV 血清型，主要采用肽展示的技術在AAV5cap基因中隨機插入7 個氨基酸寡肽，在C2C12 細胞中經過幾輪篩選得到最頻繁的突變體AAVc1，其插入的7 個氨基酸為PGPSPAD。篩選得到新型AAV 血清型AAVc1，在體內外評價結果均表明AAVc1 具有穩(wěn)定的肌肉親和力，相對于野生型AAV 血清型大大提高了轉導效率，且有較低的中和抗體，從而成功改造得到了具有高效肌肉感染力的AAV 血清型。

據報道研究表明AAV5 對眼睛、肺、神經系統(tǒng)有很好的轉導效率[1]；AAV8 則顯示出能有效將基因轉導至肝臟中[28]、在肌肉中也有較好的轉導效率；而AAV9 在全身組織和器官中有普遍的表達，因其能夠穿過血腦屏障[29-30]，在中樞神經系統(tǒng)疾病上有廣泛的應用；AAV8 和AAV9 雖有較好的肌肉親和力，但缺乏特異性。本研究篩選得到的AAVc1 相對AAV8、AAV9 具有更好的肌肉親和性，實驗研究雖使用小鼠肌肉細胞系進行篩選，對人源肌肉細胞和組織的相關應用也有一定借鑒意義。從生理角度分析，肌肉組織的生長發(fā)育過程以及接受運動神經電信號產生肌肉收縮偶聯(lián)并完成運動功能的過程在哺乳動物中都是相對保守的，人和鼠的肌肉在組織結構和生理功能上是高度相近的[31-32]；從分子生物的角度分析，大約99%的小鼠基因在人類基因組中具有同源物，96%的同源物位于人類基因組中類似的保守同線區(qū)間內。小鼠和人類基因組之間的保守程度允許對鼠類生物學的研究在很大程度上表征了人類的生物學特性[33]。例如下面幾種肌肉代表性基因，根據數(shù)據庫檢測小鼠的這些基因與人源基因有較高的同源性，其 中LMNA（ Lamin A/C） 96.4%、 SYNE1（ Spectrin repeat containing nuclear envelope protein 1）84.8%、FHL1（Four and a half LIM domains 1）94.3%、TMEM43（Transmembrane protein 43）93.0%、SUN2（Sad1 and UNC84 domain containing 2） 81.4%、 TTN（ Titin）89.6%。本研究中使用小鼠成肌細胞C2C12 表明AAVc1 具有感染肌肉的高效性，根據小鼠肌肉細胞與人源細胞的相近程度可以推斷出AAVc1 在人源細胞中會有較高的感染效率。

當AAV 進入人或其他動物宿主后，宿主血液中的中和抗體會與AAV 衣殼蛋白結合，阻斷了病毒和細胞表面受體結合并進入細胞的過程，使病毒失活，同時被抗體結合標記上的病毒顆粒也會被宿主免疫系統(tǒng)更快清除[1]。多數(shù)研究對各種AAV 的中和抗體在不同民族、地域和年齡人群中的分布進行了統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)AAV5 中和抗體在各人群中的分布比率(10%～30%)低于其他AAV 血清型, 如AAV2 (30%～80%)，AAV8 或AAV9 (20%～60%)[11,34-35]。此外進一步的流行病學研究也表明相對于AAV1、AAV2、AAV6、AAV8、AAV9 等血清型，AAV5 具有更低的免疫反應[35-36]。故本研究以中和抗體分布較低的AAV5 作為模板，在衣殼蛋白的可變區(qū)插入新的寡肽段，將進一步改變衣殼蛋白表面的氨基酸序列乃至高級結構，使得本來可以識別并結合到衣殼蛋白的中和抗體無法結合至改造后的AAV 衣殼蛋白上，從而進一步降低中和抗體分布比率。

綜上所述，本研究篩選得到的具有高肌肉感染能力的AAVc1 為基因治療提供了新的AAV 血清型，可用于治療肌肉相關疾病，也可作為疫苗研發(fā)的載體，為之后的臨床實驗提供了新的選擇，也擴大了基因治療的適用人群。