單寧酸對布氏田鼠抗氧化水平和肝臟自噬相關(guān)基因表達(dá)的影響

范瑞洋 王慧淵 王道晨 戴鑫 楊生妹

（揚州大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚州 225009）

單寧是廣泛存在于植物中的酚類植物次生代謝物，影響植食性動物的營養(yǎng)物質(zhì)消化和吸收(Mehanshoet al., 1987; Chunget al., 1998)，也具有抗氧化功能(Swain, 1979; Pepiet al., 2009)?？寡趸赶抵械墓入赘孰倪^氧化物酶(Glutathione peroxidase, GSH-Px)、過氧化氫酶(Catalase, CAT)和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD) 在應(yīng)對氧化應(yīng)激中發(fā)揮重要作用(Imreet al., 1984;Hazelton and Lang,1985)。SOD 能將超氧自由基轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O2和分子氧，而GSH-Px和CAT則將有害的H2O2轉(zhuǎn)變?yōu)闊o害的水，從而達(dá)到抗氧化效果(Fri‐dovich, 1978; Imreet al., 1984; Hazelton and Lang,1985)。丙二醛(Malondialdehyde, MDA) 是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，能反映細(xì)胞膜受氧化應(yīng)激損害的情況，與機體的氧化應(yīng)激水平高低有關(guān)(Nnaet al.,2020)。自噬是一種進(jìn)化保守機制，它在降解和回收利用折疊錯誤蛋白質(zhì)和功能失調(diào)細(xì)胞器方面有重要作用，也被稱為Ⅱ型細(xì)胞程序性死亡(Gal‐luzziet al.,2007)。Beclin1 蛋白是自噬的起始蛋白(Kiharaet al.,2001)。LC3 蛋白(microtubule-associ‐ated protein 1 light chain 3) 位于自噬體膜上，是自噬體形成的定位蛋白(Pankivet al.,2007;Ichimuraet al.,2008)，LC3A 是LC3 的亞型之一(Yoshimori,2004; Liet al., 2011)，在肝臟有表達(dá)(Zoiset al.,2011）。p62 蛋白可被自噬體吸收，然后降解(Ina‐miet al., 2011)，是自噬的調(diào)節(jié)蛋白(Jianget al.,2015)。氧化應(yīng)激能調(diào)節(jié)自噬，自噬能清除細(xì)胞和器官中被氧化的蛋白質(zhì)和受損傷的線粒體(Slateret al., 1995; Hariharanet al., 2011; Leeet al., 2012;Malaviyaet al., 2014)。肝臟功能易受氧化應(yīng)激的影 響(Cicho?-Lach and Michalak, 2014; Liet al.,2020)，故肝臟是研究具有抗氧化功能的單寧是否同時也有調(diào)節(jié)自噬作用的理想器官。

布氏田鼠(Lasiopodomys brandtii) 為廣泛分布于我國內(nèi)蒙古草原的小型植食性哺乳動物，是內(nèi)蒙古草原的主要鼠害之一(謝小明等，1994；施大釗等，1999；宛新榮等，2002b)。布氏田鼠喜食的植物中均含有豐富的植物次生代謝物——單寧(Daiet al., 2014;Yinet al., 2017)。但單寧對布氏田鼠抗氧化水平和自噬功能的影響仍不清楚。本研究選取4周齡雌雄布氏田鼠，讓其飲用高、低濃度單寧酸溶液9周，測定布氏田鼠肝臟抗氧化水平和細(xì)胞自噬對單寧酸的響應(yīng)程度，旨在揭示野外當(dāng)年生布氏田鼠處理單寧的性別差異，為探討植物次生代謝物在動物種群調(diào)節(jié)中的作用提供理論依據(jù)。

1 研究方法

1.1 實驗動物與分組

本實驗于2018 年3—8 月在揚州大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院行為生態(tài)學(xué)實驗室進(jìn)行。將捕捉于內(nèi)蒙古草原的布氏田鼠帶回實驗室飼養(yǎng)，并建立繁殖系。布氏田鼠自由飲水并喂以鼠飼料(儀征動物科技有限公司，江蘇揚州)。飼養(yǎng)室光照周期為12 L∶12 D (光照時間06: 00—18: 00)，室溫為22℃±1℃，濕度為50%±5%。幼鼠21 d斷奶，然后單籠飼養(yǎng)適應(yīng)7 d(籠壁上注明親本情況)。幼鼠飼養(yǎng)至28 日齡后，挑選體重?zé)o顯著差異的健康雌、雄性布氏田鼠各18 只(確保被選幼鼠間無同胞和半同胞關(guān)系)進(jìn)行實驗。實驗分為3 組，每組雌、雄布氏田鼠各6 只：對照組(飲用蒸餾水)、低劑量組(飲用3 mg/mL 單寧酸溶液)和高劑量組(飲用6 mg/mL 單寧酸溶液)，3 組的飲用量均為10 mL(選擇10 mL 飲用量和高劑量組飲用6 mg/mL 單寧酸溶液是因為預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)24 h 內(nèi)每只布氏田鼠都能飲用完10 mL 濃度不超過6 mg/mL 的單寧酸溶液)。

每隔1 d，在09: 00 分別給予每只布氏田鼠10 mL不同濃度單寧酸溶液或蒸餾水。在布氏田鼠4 周齡稱量第1 次體重，然后每周稱量1 次體重，實驗至布氏田鼠13 周齡時結(jié)束。實驗結(jié)束后，斷頭處死布氏田鼠，并采血；解剖取出肝臟稱量肝臟濕重，隨后迅速將肝臟放入RNA保護(hù)液中，4℃冰箱過夜靜置后放入-70℃冰箱保存，用于qPCR檢測肝臟中自噬相關(guān)基因表達(dá)。血樣經(jīng)3 000 r/min離心30 min 后吸取上層血漿，血漿保存在-70℃冰箱中，用ELISA 法測定血漿中抗氧化酶和MDA 水平。根據(jù)布氏田鼠第4~13周體重計算布氏田鼠飲用單寧酸1~9周的體重增長率。n周體重增長率=［第N周體重(g) -第4 周體重(g)］/第4 周體重(g)×100%，其中n=N-4，N為5 ~ 13，n為1~9。將肝臟濕重除以布氏田鼠體重，計算布氏田鼠肝臟指數(shù)。肝臟指數(shù)=［肝臟濕重(g)/體重(g)］×100%。

1.2 單寧酸溶液的配制

單寧酸母液(6 mg/mL)用3 g單寧酸(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)溶解在500 mL蒸餾水中配制，作為高劑量組單寧酸溶液；稀釋一倍，即3 mg/mL的溶液作為低劑量組溶液，4℃冰箱保存。實驗中高、低劑量組以及對照組的飲用量都為10 mL。

1.3 血漿抗氧化參數(shù)的測定

血漿中3 種抗氧化酶(SOD、CAT 和GSH-Px)以及血漿MDA 水平均采用酶聯(lián)免疫吸附法(En‐zyme-linked Immunosorbent Assay, ELISA) 測定。對于每個抗氧化參數(shù)，每個樣重復(fù)測定2次，操作步驟按照ELISA 試劑盒(上海聯(lián)碩生物科技有限公司) 說明書進(jìn)行，并參考之前的研究(Daiet al.,2020)。GSH-Px 的檢測范圍為12 ~ 400 U/L，CAT的檢測范圍為3 ~ 120 pg/mL，SOD 的檢測范圍為12.5 ~ 1 000 U/L，MDA 的檢測范圍為0.3 ~24 nmol/L。所有ELISA 試劑盒的批內(nèi)和批間差都分別小于9%和15%。

1.4 肝臟自噬相關(guān)基因表達(dá)水平的測定

肝臟總RNA 的提取和保存參考前期研究建立的步驟(Daiet al., 2016)。用PrimeScript 1st strand逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物)對肝臟1 μg RNA 樣品進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA?；虮磉_(dá)水平用熒光定量PCR 測定。目的基因(Beclin1和LC3A) 與內(nèi)參基因(GAPDH) 的引物序列參考前期研究(Daiet al.,2020)(表1)，p62的引物設(shè)計也參考前期研究(Daiet al.,2016)。首先從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取與布氏田鼠親緣關(guān)系相近的脊椎動物p62 蛋白的氨基酸序列，然后用Clustal X (Larkinet al., 2007) 進(jìn)行比對。根據(jù)比對結(jié)果，用軟件(j-CODEHOP from base-by-base) 設(shè)計簡并引物來擴增p62部分cDNA序列，將獲得的cDNA產(chǎn)物送至生工生物工程有限公司(上海)進(jìn)行測序，測序獲得的p62部分cDNA序列提交至GenBank (獲取號：MK477701)。進(jìn)一步用NCBI Primer Blast tool 在線設(shè)計p62的熒光定量PCR 反應(yīng)引物(表1)，并用溶解曲線檢查引物的特異性。熒光定量PCR 反應(yīng)采用SYBR Premix EX Taq II 試劑盒(大連寶生物)，在熒光定量PCR 儀(Applied Biosystems, Foster City, California, USA)上進(jìn)行(Daiet al.,2016)。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線來確保目的基因和內(nèi)參基因的擴增效率在0.9~1.0范圍內(nèi)。基因表達(dá)的差異采用2-??Ct法(Livak and Schmitt‐gen, 2001) 計算，GAPDH為內(nèi)參基因(Xiet al.,2011)。雌性對照組每個目的基因的平均?Ct 值作為參考來計算每個目的基因的相對表達(dá)量。

表1 熒光定量PCR實驗中的引物序列Table 1 Primers used in the qPCR study

1.5 數(shù)據(jù)分析

用Shapiro-Wilk法和Levene法分別檢驗數(shù)據(jù)的正態(tài)分布和方差齊性。對非正態(tài)分布數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)og10 或平方根轉(zhuǎn)換。用雙因素重復(fù)測量方差分析法(Double factors analysis of variance with repeated measures) 分析單寧酸劑量和性別對布氏田鼠體重增長率的影響。用雙因素方差分析法(Double fac‐tors analysis of variance) 分析單寧酸劑量和性別對布氏田鼠肝臟指數(shù)、抗氧化參數(shù)和自噬相關(guān)基因表達(dá)的影響。首先檢驗是否有交互作用，如有交互作用則用syntax 語句進(jìn)行簡單效應(yīng)(Simple ef‐fect) 分析；如無交互作用，則進(jìn)一步進(jìn)行主效應(yīng)(Main effect)分析，事后兩兩比較均采用Tukey法。采用Sperman 相關(guān)分析法(Analysis of bivariate cor‐relations) 分析抗氧化參數(shù)與自噬基因表達(dá)的相關(guān)性。文中數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示，P< 0.05 為差異顯著。統(tǒng)計軟件采用SPSS 16.0 for Windows。

2 結(jié)果

2.1 布氏田鼠肝臟指數(shù)和體重增長率的變化

雙因素方差分析顯示單寧酸劑量(F2,32= 1.364,P= 0.270) 和性別(F1,32= 1.870,P= 0.181) 對布氏田鼠肝臟指數(shù)均無顯著影響，也無明顯的交互作用(F2,30=0.041,P=0.960)(圖1)。

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圖1 飲用蒸餾水(對照組)、低劑量(3 mg/mL)和高劑量(6 mg/mL)單寧酸9周后布氏田鼠肝臟指數(shù)的變化Fig. 1 Variations of liver index of Brandt’s voles fed distilled water(control group),low dose(3 mg/mL)and high dose(6 mg/mL)tannic ac‐id for 9 weeks(n=6)

雙因素重復(fù)測量方差分析顯示，單寧酸劑量(F2,32= 2.878,P= 0.071) 和性別(F1,32= 1.051,P=0.313) 對布氏田鼠的體重增長率均無顯著影響， 也無明顯的交互作用(F2,30= 0.517,P=0.601)(表2)。

2.2 布氏田鼠抗氧化水平的差異

雙因素方差分析顯示單寧酸劑量和性別對布氏田鼠GSH-Px 水平的影響有顯著交互作用(F2,30=4.304,P=0.023)。單寧酸劑量對雄鼠GSH-Px 水平有顯著影響(F2,30=14.839,P<0.001)，雄鼠對照組GSH-Px 水平顯著低于低劑量組和高劑量組(P=0.003,P< 0.001)。低劑量組(F1,30= 5.073,P=0.032) 和高劑量組(F1,30= 18.585,P< 0.001) 的GSH-Px 水平在性別間有顯著差異，雌鼠的GSH-Px水平都低于雄鼠(低劑量組，P=0.032；高劑量組，P<0.001)(圖2A)。

雙因素方差分析顯示單寧酸劑量(F2,32=11.674,P< 0.001) 和性別(F1,32= 34.523,P<0.001) 對布氏田鼠SOD 水平均有顯著影響(F2,32=11.674,P< 0.001)，但無明顯的交互作用(F2,30=2.657,P=0.087)。高劑量組SOD 水平顯著高于對照組和低劑量組(P< 0.001,P= 0.005)。雄鼠的SOD水平顯著高于雌鼠(P<0.001)(圖2B)。

圖2 飲用蒸餾水(對照組)、低劑量(3 mg/mL)和高劑量(6 mg/mL)單寧酸9周后布氏田鼠血漿中GSH-Px(A)、SOD(B)、CAT(C)和MDA(D)水平的變化. 不同字母表示當(dāng)單寧酸劑量與布氏田鼠性別存在交互作用時經(jīng)簡單效應(yīng)分析雄性布氏田鼠的單寧酸劑量組間有顯著差異；*表示雄性與雌性布氏田鼠間有顯著差異；不同的#數(shù)目表示當(dāng)存在單寧酸劑量主效應(yīng)時單寧酸劑量組間有顯著差異(P<0.05)(n=6)Fig. 2 Variations of GSH-Px (A), SOD (B), CAT(C), and MDA(D) levels in the serum of Brandt’s voles fed distilled water (control group), low dose (3 mg/mL) and high dose (6 mg/mL) tannic acid for 9 weeks. Error bars indicate standard error. Different letters marked over the columns in the males mean significant differences between them at P<0.05 in the test of simple effect when there were an interaction effect between tannic acid dose and gender of Brandt’s voles. * means significant differences between males and females at P< 0.05. The different # numbers mean signifi‐cant differences between different dose groups at P<0.05 when there is a main effect of tannic acid dose(n=6)

雙因素方差分析顯示單寧酸劑量和性別對布氏田鼠CAT 水平的影響有顯著的交互作用(F2,30=6.951,P=0.003)。單寧酸劑量對雄鼠CAT 水平有顯著影響(F2,30= 17.424,P< 0.001)，雄鼠對照組CAT 水平顯著低于低劑量組和高劑量組(P=0.018,P<0.001)，雄鼠低劑量組CAT 水平也顯著低于高劑量組(P= 0.018)。高劑量組的CAT 水平在性別間有顯著差異(F1,30= 13.587,P< 0.001），雌鼠CAT水平顯著低于雄鼠(P=0.001)(圖2C)。

雙因素方差分析顯示單寧酸劑量(F2,32=10.148,P<0.001)對布氏田鼠MDA 水平有顯著影響，但MDA 水平在性別間無顯著差異(F1,32=0.194,P=0.662)，單寧酸劑量和性別也無明顯的交互作用(F2,30= 0.671,P= 0.519)。對照組MDA水平顯著高于低劑量組和高劑量組(P=0.012,P<0.001)(圖2D)。

2.3 布氏田鼠肝臟自噬相關(guān)基因表達(dá)的差異

雙因素方差分析顯示單寧酸劑量對布氏田鼠Beclin1表達(dá)有顯著影響(F2,32=21.086,P<0.001)，但性別對Beclin1表達(dá)無顯著影響(F1,32= 2.351,P=0.135)，單寧酸劑量和性別無顯著的交互作用(F2,30= 0.623,P= 0.543)。低劑量組布氏田鼠Beclin1表達(dá)顯著高于對照組和高劑量組(P=0.046,P<0.001)；對照組布氏田鼠Beclin1表達(dá)也顯著高于高劑量組(P=0.001)(圖3A)。

雙因素方差分析顯示單寧酸劑量和性別對布氏田鼠LC3A表達(dá)有顯著的交互作用(F2,30=5.674,P= 0.008)。單寧酸劑量對雄鼠LC3A表達(dá)有顯著影響(F2,30= 11.611,P< 0.001)，雄鼠高劑量組LC3A表達(dá)水平顯著低于對照組和低劑量組(P=0.018,P< 0.001) (圖3B)。對照組(F1,30= 4.823,P= 0.036) 和低劑量組(F1,30= 24.952,P< 0.001)的LC3A表達(dá)在性別間有顯著差異，雌鼠LC3A表達(dá)水平均顯著低于雄鼠(對照組，P=0.036；低劑量組，P<0.001)(圖3B)。

雙因素方差分析顯示單寧酸劑量對布氏田鼠p62表達(dá)有顯著影響(F2,32=14.884,P<0.001)，但性別對p62表達(dá)無顯著影響(F1,32= 0.179,P=0.675)，單寧酸劑量與性別無明顯的交互作用(F2,30=1.775,P=0.187)。高劑量組p62表達(dá)顯著低于對照組和低劑量組(P< 0.001,P= 0.001）(圖3C)。

圖3 飲用蒸餾水(對照組)、低劑量(3 mg/mL)和高劑量(6 mg/mL)單寧酸9 周后布氏田鼠肝臟中自噬相關(guān)基因Beclin1(A)、LC3A(B)和p62(C)相對表達(dá)量的變化. 不同字母表示當(dāng)單寧酸劑量與布氏田鼠性別存在交互作用時經(jīng)簡單效應(yīng)分析雄性布氏田鼠的單寧酸劑量組間有顯著差異；*表示雄性與雌性布氏田鼠間有顯著差異；不同的#數(shù)目表示當(dāng)存在單寧酸劑量主效應(yīng)時單寧酸劑量組間有顯著差異(P<0.05)(n=6)Fig. 3 Variations of relative mRNA expression levels of Beclin1 (A),LC3A(B),and p62(C)in the liver of Brandt’s voles fed distilled water(control group), low dose (3 mg/mL) and high dose (6 mg/mL) tannic acid for 9 weeks. Error bars indicate standard error. Different letters marked over the columns in the males mean significant differences be‐tween them at P<0.05 in the test of simple effect when there is an in‐teraction effect between tannic acid dose and gender of Brandt’s voles. * means significant differences between males and females at P < 0.05. The different # numbers mean significant differences be‐tween different dose groups at P< 0.05 when there is a main effect of tannic acid dose(n=6)

2.4 血漿抗氧化參數(shù)與肝臟自噬相關(guān)基因表達(dá)的相關(guān)性

Spearman 相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，肝臟Beclin1表達(dá)與LC3A和p62的表達(dá)呈顯著正相關(guān)(P<0.05)(表3)，與血漿中SOD 和CAT 水平呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與血漿MDA 水平呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。肝臟LC3A的表達(dá)與p62的表達(dá)也呈顯著正相關(guān)(P< 0.05)。肝臟p62的表達(dá)與血漿SOD、CAT 和GSH-Px 水平都呈顯著負(fù)相關(guān)(P< 0.05)。血漿GSH-Px 水平與SOD 和CAT 水平呈顯著正相關(guān)(P< 0.05)，而與MDA 水平呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。SOD 與CAT 水平間也呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。

表3 飲用單寧酸9周后布氏田鼠肝臟自噬基因表達(dá)與血漿抗氧化參數(shù)的相關(guān)性Table 3 Correlations between the expression of autophagy-related genes in the liver and the parameters of antioxidant in serum of Brandt’s voles fed tannic acid for 9 weeks

3 討論

本研究中單寧酸飲用9周，對雌雄布氏田鼠的體重增長率無顯著影響。之前的研究也表明飼喂含單寧酸的食物5周，對青春期雌雄布氏田鼠的體重?zé)o顯著影響(Yeet al., 2016)；飲用單寧酸4 周，對青春期雄性布氏田鼠的體重?zé)o顯著影響(Daiet al.,2020)；飼喂含3.3%單寧的食物對布氏田鼠的體重?zé)o顯著影響(陳競峰等，2005)；飼喂含單寧酸食物，高原鼢鼠(Eospalax baileyi) 體重?zé)o顯著變化(Linet al., 2012)。與體重變化一致，本研究中肝臟指數(shù)未因單寧酸的攝入而發(fā)生明顯變化。同樣青春期雌雄布氏田鼠取食含單寧酸飼料5周，布氏田鼠肝臟重量無顯著變化(Yeet al., 2016)。單寧酸一直被認(rèn)為能影響動物對營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收(Mehanshoet al., 1987; Chunget al., 1998)，所以本文推測動物可能通過適當(dāng)增加取食量或提高唾液中單寧結(jié)合蛋白的分泌(Yeet al., 2016) 以及腸道單寧降解菌(Shimadaet al.,2006)降解單寧等機制適應(yīng)食物中一定劑量的單寧酸，從而維持體重的變化，但這需要進(jìn)一步深入研究。

本研究中，雄性布氏田鼠飼喂單寧酸高劑量組GSH-Px和CAT水平都高于對照組；雌雄鼠的高劑量組SOD水平也都高于對照組；而雌雄鼠MDA水平則高劑量組低于對照組，這些說明施加6 mg/mL單寧酸9周能提高布氏田鼠的抗氧化水平而降低布氏田鼠的氧化應(yīng)激水平。飼喂含單寧酸的食物5周后，青春期布氏田鼠肝臟的CAT和GSH-Px水平增加(Yeet al., 2016)；飼喂含單寧的石榴汁后雄性大鼠血漿中的CAT 和GSH-Px 水平均增高(Türket al., 2008)；飼喂含單寧的食物能提高獺兔血清中SOD 水平而降低MDA 水平(陳賽娟等，2019)；飼喂含單寧食物增加了奶牛血漿中SOD和GSH-Px水平，降低了MDA 水平(Liuet al., 2013)。飲用3 mg/mL 單寧酸9 周，雌雄布氏田鼠中只有MDA的水平降低，并且僅雄性布氏田鼠GSH-Px 和CAT水平增加，說明3 mg/mL單寧酸對布氏田鼠的抗氧化效果弱于6 mg/mL，單寧酸的抗氧化作用有劑量效應(yīng)。單寧酸的劑量效應(yīng)也在之前研究中發(fā)現(xiàn)，飲用3 mg/mL 單寧酸4 周能提高青春期雄性布氏田鼠的抗氧化水平，而6 mg/mL單寧酸卻降低青春期雄鼠的抗氧化水平(Daiet al.,2020)。綜合本研究與之前青春期布氏田鼠的研究，本文認(rèn)為對于布氏田鼠，過少的單寧酸無明顯的抗氧化效果，而過多的單寧酸則有負(fù)效應(yīng)。青春期雄性布氏田鼠和成年雄鼠對6 mg/mL單寧酸的反應(yīng)不同，說明雄鼠對單寧酸的反應(yīng)與個體發(fā)育時期有關(guān)，成年雄鼠能耐受更高劑量的單寧酸，而較高的單寧酸劑量才能提高其抗氧化水平。本研究中，血漿中GSH-Px 與MDA 水平有顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，同時SOD、CAT 與MDA 水平相關(guān)系數(shù)也為負(fù)值，說明在布氏田鼠中抗氧化酶也發(fā)揮著對抗氧化應(yīng)激的作用。血漿中GSH-Px、SOD 和CAT 水平兩兩間都成正相關(guān)性，進(jìn)一步說明和驗證了GSH-Px、SOD和CAT在抗氧化過程中功能的一致性。

本研究中，雄性布氏田鼠高劑量組LC3A的表達(dá)水平低于對照組；高劑量組Beclin1和p62的表達(dá)水平均小于對照組，說明飲用6 mg/mL 單寧酸9 周能使布氏田鼠肝臟中的自噬水平降低，因此本文認(rèn)為單寧酸能影響動物的自噬水平。自噬被阻斷能使p62 蛋白積聚(Inamiet al., 2011)，因而自噬被阻斷引起的負(fù)反饋效應(yīng)被認(rèn)為是p62mRNA水平降低的可能原因。但LC3A和Beclin1與p62的表達(dá)呈顯著正相關(guān)性，高劑量組p62mRNA水平的降低也伴隨著LC3A和Beclin1的降低，因而本文認(rèn)為布氏田鼠肝臟p62mRNA水平的降低是由自噬體形成減少，而不是自噬被阻斷引起的負(fù)反饋效應(yīng)導(dǎo)致。自噬能清除氧化損害的蛋白和細(xì)胞器，是除氧化還原反應(yīng)信號通路(GSH-Px、SOD 和CAT 屬于該通路) 外能實現(xiàn)抗氧化效果的另一條途徑(Giordanoet al.,2014)。氧化應(yīng)激能調(diào)節(jié)自噬，高氧化應(yīng)激水平能促進(jìn)自噬的發(fā)生(Slateret al.,1995;Leeet al.,2012)。本研究中，Beclin1表達(dá)與MDA 水平呈正相關(guān)；飲用6 mg/mL 單寧酸的布氏田鼠肝臟中自噬水平降低，而血漿中的抗氧化水平升高；3 種自噬標(biāo)志蛋白基因的表達(dá)都與血漿中抗氧化酶水平呈負(fù)相關(guān)，這說明抗氧化水平能影響自噬，高水平的抗氧化水平能降低自噬，這也佐證了氧化應(yīng)激能調(diào)節(jié)自噬，進(jìn)一步說明自噬的功能是清除已被氧化應(yīng)激損害的蛋白和細(xì)胞器，而抗氧化酶的作用是降低氧化應(yīng)激，減少可能受氧化應(yīng)激損害的蛋白和細(xì)胞器。與此一致，飲用3 mg/mL 單寧酸4 周的青春期布氏田鼠睪丸中的自噬水平降低，血漿中抗氧化水平提高(Daiet al.,2020)。

本研究中，雄性布氏田鼠的SOD 水平高于雌性；同時在低劑量組和高劑量組中雄鼠的GSH-Px都高于雌鼠；高劑量組雄鼠的CAT 也高于雌鼠，說明雄鼠抗氧化系統(tǒng)對單寧酸的反應(yīng)強于雌鼠，從而導(dǎo)致相同劑量的單寧酸使雄鼠的抗氧化水平高于雌鼠。同樣雄性大鼠對抗氧化劑的反應(yīng)大于雌性(Bhatiaet al., 2012)。小鼠肝臟GSH-Px 水平對有害的吡咯里希啶類生物堿的反應(yīng)表現(xiàn)出了性別差異(Lianget al., 2011)。有研究表明女性比男性有更高的抗氧化潛能，雄性比雌性更容易受到氧化應(yīng)激的影響(Ideet al., 2002)。據(jù)此，本文推測野生雄性布氏田鼠的抗氧化系統(tǒng)更易受到植物單寧的影響。

野生布氏田鼠食物中的單寧含量的變動范圍為3.5~7.5 mg/g(Yinet al.,2017)，成年鼠每天能取食8~9 g 的植物干物質(zhì)(宛新榮等，2002a)，推算野生成年鼠每天攝入的單寧量為28.0 ~ 67.5 mg，因而本研究單寧酸高劑量組每天30 mg的攝入量達(dá)到野生田鼠單寧攝入量的下限。布氏田鼠飲用單寧酸從青春期4周齡到成年期13周齡，因此本研究在一定程度上可模擬野外當(dāng)年新生布氏田鼠對植物次生代謝物——單寧的響應(yīng)，并提示當(dāng)單寧攝入量維持每天30 mg，則利于野生布氏田鼠提高抗氧化水平并降低組織細(xì)胞自噬水平。在野外，布氏田鼠喜食植物中單寧含量在6 月前較低(~3.5 mg/g)(Yinet al., 2017)，據(jù)此推算該時期布氏田鼠單寧攝入量恰為每天30 mg 左右，因而本文推測6 月前的低量單寧攝入對布氏田鼠為正性作用，這可能是野生布氏田鼠種群增長率6 月最高(Yinet al.,2017)的原因之一。但野外植物中單寧含量有較大季節(jié)性波動，6月植物中單寧含量較5月明顯上升，且直到9 月都維持在較高水平(~ 6 mg/g) (Yinet al., 2017)，據(jù)此推算布氏田鼠夏季單寧每天攝入量遠(yuǎn)高于30 mg。單寧酸對布氏田鼠的作用存在劑量效應(yīng)，過多的單寧酸有負(fù)效應(yīng)，且雄鼠的抗氧化系統(tǒng)對單寧酸的反應(yīng)更強，結(jié)合過量單寧等酚類化合物將會導(dǎo)致肝損傷(覃魯珊等，2014; Hus‐sainet al.,2019)，本文進(jìn)一步推測在植物單寧含量高的季節(jié)，大量單寧攝入對野生布氏田鼠個體及種群的作用可能是負(fù)性的。尤其對雄鼠，6—9月植物單寧含量較高，可能是布氏田鼠7月后種群增長率低于6 月以及8 月中旬后種群數(shù)量下降(Yinet al.,2017)的原因之一，這也可解釋6 月后新出生雄性布氏田鼠一般不參與當(dāng)年繁殖的現(xiàn)象(宛新榮等，2002b;Renet al.,2016)。

總之，本研究表明單寧酸能提高布氏田鼠的抗氧化水平而降低肝臟的自噬，并存在劑量效應(yīng)，單寧酸對雄性布氏田鼠抗氧化系統(tǒng)的影響大于雌性，提示單寧對野生布氏田鼠種群的作用受植物單寧含量季節(jié)性變化的影響，野生雄性布氏田鼠更易受植物單寧的影響，低量植物單寧攝入將提高野生田鼠的抗氧化水平而有利于布氏田鼠種群。