丁酸鈉植物精油復(fù)合制劑對南美白對蝦生長性能、致病性弧菌和非特異性免疫的影響

錢希逸，李慧，徐亞飛，楊彩梅，2*

（1.浙江萬方生物科技有限公司，浙江 安吉 313307；2.浙江農(nóng)林大學(xué)動物科技學(xué)院動物醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 311300）

南美白對蝦于20世紀(jì)80年代末引進(jìn)我國，90年代初期進(jìn)入養(yǎng)殖高峰?；谌斯び绾宛B(yǎng)殖技術(shù)的突破，對蝦養(yǎng)殖向規(guī)?；?、集約化方向發(fā)展，但也造成養(yǎng)殖環(huán)境惡化與病害頻發(fā)，對蝦成活率過低。養(yǎng)殖者將抗生素當(dāng)作對蝦病害防治的“超級守門員”，然而抗生素的大量使用帶來了細(xì)菌耐藥性、藥物殘留、水環(huán)境污染等問題，最終造成惡性循環(huán)。因此尋找環(huán)境友好、綠色安全的替抗添加劑成為當(dāng)前水產(chǎn)營養(yǎng)研究的熱點(diǎn)。

目前，有機(jī)酸及有機(jī)酸鹽因易吸收、無毒害和無殘留等優(yōu)點(diǎn)受到關(guān)注。丁酸可為結(jié)腸上皮細(xì)胞提供能量，利于促進(jìn)細(xì)胞分化與維持結(jié)腸上皮完整性，提高動物生產(chǎn)性能。丁酸鈉是丁酸的主要提供方式。田莉?qū)Σ蒴~投喂含丁酸鈉的飼糧，發(fā)現(xiàn)丁酸鈉能夠促進(jìn)腸道發(fā)育，優(yōu)化腸道菌群結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)草魚對腸炎、赤皮病和爛鰓病的抵抗能力，提高草魚生產(chǎn)性能。劉文舒等發(fā)現(xiàn)包膜丁酸鈉能促進(jìn)腸黏膜修復(fù)，增加微絨毛高度和密度等，促進(jìn)建鯉生長。

植物精油由于其資源豐富、安全、無毒等優(yōu)點(diǎn)，成為替代抗生素的熱門選擇，可作為免疫和生理反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，具有抗應(yīng)激、抗氧化、促進(jìn)胃腸道健康的優(yōu)點(diǎn)。在探究百里香酚對大腸桿菌、沙門氏菌、綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌的體外抑菌效果的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，百里香酚可導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂，使胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，進(jìn)而殺滅病原菌，有效抑制病原菌生長。王猛強(qiáng)等發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加植物精油能有效改善南美白對蝦的生長性能，促進(jìn)腸道健康。Zhou等報(bào)道，乙酸和檸檬酸等有機(jī)酸、香芹酚和百里香酚對傷寒沙門氏菌具有協(xié)同抑菌作用，韓乾杰等研究表明，丁酸鈉與植物精油存在協(xié)同作用，并且能夠減少75%復(fù)合植物精油的使用。

當(dāng)前，對丁酸鈉和植物精油的研究大多是對單一特性進(jìn)行分析，對丁酸鈉與植物精油協(xié)同作用方面的研究相對較少，并且多集中于畜禽養(yǎng)殖，關(guān)于甲殼類動物的應(yīng)用研究較少。本試驗(yàn)以南美白對蝦為試驗(yàn)對象，研究丁酸鈉植物精油復(fù)合制劑對甲殼類動物生長性能、腸道微生物及非特異性免疫的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)選用健康南美白對蝦蝦苗500尾。丁酸鈉植物精油復(fù)合制劑組成為40%丁酸鈉+7.5%肉桂醛+2.5%百里香酚，采用獨(dú)特的固體分散、緩釋微囊工藝。該制劑由浙江萬方生物科技有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 試驗(yàn)飼料配制

試驗(yàn)分為2組，對照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)組飼喂基礎(chǔ)日糧并添加2.5 kg/t丁酸鈉復(fù)合植物精油制劑。南美白對蝦基礎(chǔ)日糧配方及營養(yǎng)水平見表1和2。

表1 南美白對蝦基礎(chǔ)日糧配方含量 %

表2 南美白對蝦基礎(chǔ)日糧營養(yǎng)成分 %

1.2.2 試驗(yàn)分組

正式試驗(yàn)前先將蝦苗暫養(yǎng)于室外水泥池中，待蝦苗長至試驗(yàn)規(guī)格后，將其轉(zhuǎn)入室內(nèi)養(yǎng)殖水桶（4 m），馴化2周以適應(yīng)試驗(yàn)條件。暫養(yǎng)期間根據(jù)蝦苗規(guī)格投喂飼料，試驗(yàn)分組前24 h停止喂食。選取體質(zhì)健壯、規(guī)格基本一致、平均體長為（4.13±0.05）cm、平均體質(zhì)量為（1.08±0.05）g的南美白對蝦300尾，隨機(jī)分為2組，每組設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)50尾。

1.2.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)期間每天正常投喂4次（07：00，11：00，17：00和21：00），投餌量為蝦體質(zhì)量的3%～5%，投喂1 h后觀察對蝦攝食情況調(diào)整投喂量。嚴(yán)格控制養(yǎng)殖用水質(zhì)量，連續(xù)充氧，每日記錄水溫，檢測氨氮、亞硝酸鹽氮、溶解氧及pH值等水質(zhì)指標(biāo)，定期清理桶底殘餌糞便。試驗(yàn)期間保持水溫在（27.5±1.0）℃，ρ（氨氮）≤0.02 mg/L，ρ（亞硝酸鹽氮）≤0.05 mg/L，ρ（溶解氧）≥5.5 mg/L，pH值為（7.6±0.3），鹽度為（20±1.5）。試驗(yàn)周期為42 d，養(yǎng)殖期間出現(xiàn)的死蝦需及時清理并記錄。

1.2.4 生產(chǎn)性能測定

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，對其饑餓處理24 h，將所有蝦進(jìn)行稱量，計(jì)算終末平均體質(zhì)量與平均體長（體長：從眼柄基部到尾節(jié)末端的長度）。計(jì)算成活率、質(zhì)量增加率、增長率、特定生長率和餌料系數(shù)。計(jì)算公式如下：

成活率（%）=（末蝦尾數(shù)/始蝦尾數(shù)）×100；

質(zhì)量增加率（%）=（末均質(zhì)量-初均質(zhì)量）/初均質(zhì)量×100；

增長率（%）=（末均長-初均長）/初均長×100；

特定生長率（%）=（ln末均質(zhì)量-ln初均質(zhì)量）/飼養(yǎng)天數(shù)×100；

餌料系數(shù)=飼料攝入量（g，干質(zhì)量）/蝦體質(zhì)量增加量（g，濕質(zhì)量）

1.2.5 腸道微生物計(jì)數(shù)

試驗(yàn)結(jié)束后測定對蝦腸道弧菌數(shù)及細(xì)菌總數(shù)。每組隨機(jī)選取15尾蝦，在無菌操作臺內(nèi)進(jìn)行解剖，去除腸道內(nèi)糞便，用無菌生理鹽水沖洗干凈，用濾紙吸干多余水分，置于滅菌玻璃勻漿器中，加入1 mL無菌生理鹽水進(jìn)行勻漿，對勻漿液進(jìn)行梯度稀釋，取0.1 mL分別涂布于Marine培養(yǎng)基和TCBS弧菌篩選培養(yǎng)基，每組涂布3個平板，28℃倒置培養(yǎng)24 h，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)。

每尾蝦腸道細(xì)菌總數(shù)（TBC）按下述公式計(jì)算：

TBC（CFU）=細(xì)菌克隆數(shù)目×10×勻漿液稀釋倍數(shù)/對蝦尾數(shù)。

每尾蝦腸道弧菌數(shù)（TCBS）按下述公式計(jì)算：TCBS（CFU）=弧菌克隆數(shù)目×10×勻漿液稀釋倍數(shù)/對蝦尾數(shù)。

1.2.6 非特異性免疫功能檢測

非特異性免疫功能檢測指標(biāo)包括血細(xì)胞總數(shù)、酚氧化酶活力和超氧化物歧化酶活力。每組隨機(jī)選取15尾（5尾×3重復(fù)）對蝦，每個樣品重復(fù)測試3次。

（1）血細(xì)胞總數(shù)。用一次性注射器抽取100μL含10%甲醛的0.45 mol/L NaCl溶液，按1∶1比例抽取對蝦血淋巴，置于1.5 mL干凈離心管中，用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。采用的是25×16型（湯麥?zhǔn)剑┭蛴?jì)數(shù)板，計(jì)數(shù)時數(shù)4個中方格和中央1個中方格的細(xì)胞數(shù)（即80個小格），計(jì)算公式為：每mL細(xì)胞數(shù)（個）=80個小格內(nèi)細(xì)胞總數(shù)×5×10×稀釋倍數(shù)。

（2）酚氧化酶活力。用ACD-BSolution抗凝劑按1∶1比例抽取對蝦血淋巴，水平離心機(jī)800 g，4℃離心10 min，取10μL上清液，與10μL 0.3%的L-DOPA混合，在水浴鍋中40℃條件下反應(yīng)30 min，加入80μL 0.9%的NaCl溶液，充分混勻，酶標(biāo)儀固定檢測OD490的光吸收值，空白對照組用0.9%的NaCl溶液代替血清。每2 min測量1次，共測量10次，以O(shè)D490對反應(yīng)時間作圖，OD值每分鐘增加0.001定義1個酶活力單位。

（3）超氧化物歧化酶活力。用ACD-B Solution抗凝劑按1∶1比例抽取對蝦血淋巴2 mL，水平離心機(jī)800 g，4℃離心10 min，取上清液。根據(jù)Sigma-Aldrich超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒說明書進(jìn)行測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

原始數(shù)據(jù)使用Microsoft Excel 2019進(jìn)行處理，再用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，＜0.05表示差異顯著，＜0.01表示差異極顯著。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”形式進(jìn)行表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 丁酸鈉植物精油復(fù)合制劑對南美白對蝦生長性能的影響

丁酸鈉復(fù)合植物精油對南美白對蝦生長性能的影響見表3，由表3可知，試驗(yàn)組南美白對蝦增長率、質(zhì)量增加率、特定生長率和成活率均顯著高于對照組，與對照組比，試驗(yàn)組南美白對蝦增長率升高11.73%（＜0.01），質(zhì)量增加率升高13.58%（＜0.05），特定生長率顯著升高6.92%（＜0.01），成活率顯著升高5.83%（＜0.01），餌料系數(shù)顯著降低18.24%（＜0.01）。

表3 丁酸鈉復(fù)合植物精油對南美白對蝦生長性能的影響①

2.2 丁酸鈉復(fù)合植物精油對南美白對蝦致病性弧菌的影響

丁酸鈉復(fù)合植物精油對南美白對蝦腸道總菌數(shù)與致病性弧菌的影響見表4，從表4可知，相比對照組，試驗(yàn)組的南美白對蝦的腸道總菌數(shù)無顯著變化，致病性弧菌則顯著減少（＜0.01），減少幅度達(dá)68.3%。

表4 丁酸鈉復(fù)合植物精油對南美白對蝦腸道總菌數(shù)與致病性弧菌的影響① CFU/g

2.3 丁酸鈉植物精油復(fù)合制劑對南美白對蝦非特異性免疫的影響

丁酸鈉植物精油復(fù)合制劑對南美白對蝦非特異性免疫的影響見表5，由表5可見，相較于對照組，試驗(yàn)組的南美白對蝦血細(xì)胞總數(shù)、酚氧化酶活力和超氧化物歧化酶活力均顯著提高，分別提高11.45%（＜0.05），21.39%（＜0.01）和7.67%（＜0.01）。

表5 丁酸鈉植物精油復(fù)合制劑對南美白對蝦非特異性免疫的影響①

3 討論

3.1 丁酸鈉復(fù)合植物精油促進(jìn)南美白對蝦生長

丁酸鈉可以促進(jìn)水產(chǎn)動物的生長，提高生長性能。在斑節(jié)對蝦飼料中添加包膜丁酸鈉，能顯著提高對蝦質(zhì)量增加率和飼料轉(zhuǎn)化率。丁酸鈉對美洲鰻鱺、羅非魚、鯉和鯽均有顯著促生長作用。丁酸鈉的特殊氣味也對水產(chǎn)動物具有良好的誘食作用。而植物精油能誘導(dǎo)水產(chǎn)動物主動進(jìn)食，促進(jìn)胃腸道興奮，提高生產(chǎn)性能與飼料利用率。在南美白對蝦飼料中添加0.02%的植物精油，能促進(jìn)對蝦采食，并且有效改善對蝦的生長性能，維持腸道健康。Wigraiboon等發(fā)現(xiàn)魚腥草油能夠促進(jìn)紅羅非魚生長，同時有效提高魚肉的蛋白質(zhì)含量，降低脂質(zhì)含量，改善魚肉品質(zhì)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在南美白對蝦飼料中添加丁酸鈉復(fù)合植物精油，能顯著提高對蝦增長率、質(zhì)量增加率和特定生長率，有效降低餌料系數(shù)，表明適量的丁酸鈉復(fù)合植物精油能夠促進(jìn)南美白對蝦的生長。

3.2 丁酸鈉復(fù)合植物精油提高南美白對蝦存活率

丁酸鈉能促進(jìn)腸道黏膜上皮細(xì)胞增殖，修復(fù)受損黏膜，促進(jìn)腸絨毛增殖，增加隱窩深度，減少絨毛寬度，增強(qiáng)腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。植物精油同樣可以改善腸道形態(tài)，選擇性抑制某些有害菌群，促進(jìn)有益菌群生長，維持腸道系統(tǒng)穩(wěn)定。鄭瑞耕在鯉飼料中添加丁酸鈉，顯著改善了鯉腸黏膜上皮完整度，腸絨毛粗壯。孫浪在鯽基礎(chǔ)飼料中添加丁酸鈉，顯著提高了鯽前腸絨毛高度/隱窩深度的數(shù)值，有效促進(jìn)了腸道細(xì)胞增殖。本試驗(yàn)中，試驗(yàn)組南美白對蝦存活率顯著高于對照組，表明丁酸鈉復(fù)合植物精油增強(qiáng)了南美白對蝦抵抗力。

3.3 丁酸鈉復(fù)合植物精油有效抑制南美白對蝦腸道內(nèi)有害菌

弧菌屬（）是一類菌體短小，略彎曲呈弧形，具有鞭毛的革蘭氏陰性菌，該菌能生存于海洋和河口環(huán)境中，廣泛存在于魚類、珊瑚、對蝦、浮游生物和哺乳動物中。目前已知幾種弧菌對人類、魚類和海洋無脊椎動物具有致病性，其中鰻弧菌（）是條件致病菌，可感染鮭魚、大菱鲆、鱸、虹鱒、香魚等并致其死亡，Lu等從患病青蟹中分離得到多種弧菌。有研究表明，在凡納濱對蝦飼料中添加丁酸鈉能有效降低其腸道內(nèi)弧菌數(shù)。崔惠敬等發(fā)現(xiàn)富含芳香醛、芳香酚和檸檬醛的植物精油對大菱鲆弧菌具有良好抗菌作用。本試驗(yàn)中，試驗(yàn)組的南美白對蝦的腸道總菌數(shù)無顯著變化，致病性弧菌則顯著減少，表明丁酸鈉復(fù)合植物精油能有效抑制腸道內(nèi)有害菌。

3.4 丁酸鈉復(fù)合植物精油能提升南美白對蝦非特異性免疫力

多項(xiàng)研究證明，丁酸鈉能促進(jìn)動物免疫器官發(fā)育。在飼糧中添加植物精油可有效提高虹鱒血清中總補(bǔ)體含量和溶菌酶活性，植物精油還能通過增強(qiáng)抗氧功能提高動物免疫力。區(qū)別于哺乳動物，南美白對蝦這類甲殼動物不具備特異性免疫，僅依賴于非特異性免疫來抵御病原體。南美白對蝦血細(xì)胞總數(shù)、酚氧化酶活力和超氧化物歧化酶活力均是衡量對蝦非特異性免疫力的重要指標(biāo)。本研究中，試驗(yàn)組南美白對蝦的血細(xì)胞總數(shù)、酚氧化酶活力和超氧化物歧化酶活力均顯著上調(diào)，表明丁酸鈉復(fù)合植物精油能顯著提高南美白對蝦的非特異性免疫力。

3.4.1 血淋巴細(xì)胞

作為甲殼動物免疫系統(tǒng)中最重要的部分，血淋巴細(xì)胞是發(fā)揮細(xì)胞免疫功能的主要物質(zhì)。血細(xì)胞的吞噬作用主要是吞噬外界病原及異物顆粒，血細(xì)胞通過表面受體識別異物，觸發(fā)由血淋巴細(xì)胞分泌的附著因子（如76 ku蛋白）介導(dǎo)的粘連，相互聚集成細(xì)胞團(tuán)，以清除異物。日本對蝦Rab基因已被證實(shí)可以作為一種胞內(nèi)病毒識別蛋白，增強(qiáng)宿主細(xì)胞吞噬功能。

3.4.2 酚氧化酶

酚氧化酶是體液免疫中主要的殺菌物質(zhì)之一，主要存在于顆?；虬腩w粒細(xì)胞中，有助于黑色素的形成。已知黑色素能抑制病原體蛋白與酶活性的發(fā)揮，參與黑化反應(yīng)，產(chǎn)生毒性醌殺滅病原，愈合傷口，也作為一種識別信號，誘導(dǎo)宿主防御系統(tǒng)中其他成分的產(chǎn)生，亦可作為調(diào)理素，影響細(xì)胞吞噬功能。

3.4.3 超氧化物歧化酶活性

甲殼動物血淋巴細(xì)胞在發(fā)揮免疫機(jī)制的過程中會產(chǎn)生大量活性氧，活性氧濃度過高則會損害機(jī)體健康。血細(xì)胞中的超氧化物歧化酶具有清除活性氧的作用，降低機(jī)體受損傷的可能性。其變化可作為動物免疫狀態(tài)檢測指標(biāo)。

4 結(jié)論

綜上所述，在南美白對蝦飼料中添加適量丁酸鈉植物精油復(fù)合制劑能夠有效促進(jìn)南美白對蝦的生長，提高存活率，抑制致病菌的生長，增強(qiáng)對蝦非特異性免疫力，從而提高南美白對蝦養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益。