鯽魚(yú)血液、肝臟、卵巢組織轉(zhuǎn)錄組比較分析

李 青， 何 斌， 陳群利， 游 萍

(貴州工程應(yīng)用技術(shù)學(xué)院生態(tài)工程學(xué)院，貴州畢節(jié) 551700)

鯽魚(yú)()隸屬于鯉形目鯉科鯽屬，由于其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、味鮮肉嫩、生長(zhǎng)速度快、雜食性和適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，是我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)。鯽魚(yú)多生活于水域的中下層，冬天低溫條件下可以忍受缺氧數(shù)月，具有極強(qiáng)的低氧耐受性，被公認(rèn)為是低氧耐受力極強(qiáng)的魚(yú)類(lèi)之一。此外，鯽魚(yú)具有二倍體、三倍體和四倍體3種不同的染色體倍性類(lèi)型，不同類(lèi)型具有不同的繁殖方式。二倍體通過(guò)兩性繁殖方式產(chǎn)生雌雄同體后代；四倍體通過(guò)雌核發(fā)育產(chǎn)生全雌后代；而三倍體鯽魚(yú)同時(shí)存在這2種繁殖方式，即通過(guò)精子激活雌核發(fā)育成全雌后代和雌雄交配產(chǎn)生雌雄同體三倍體后代，鯽魚(yú)是研究魚(yú)類(lèi)進(jìn)化發(fā)育基因組學(xué)和低氧脅迫適應(yīng)分子機(jī)制的適當(dāng)模型。

近年來(lái)，隨著測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，在研究目標(biāo)物種全基因組數(shù)據(jù)未知的情況下，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序已成為一種短期、低成本得到海量基因數(shù)據(jù)的高效方法?；虻谋磉_(dá)具有組織特異性，研究生物過(guò)程相關(guān)組織中基因的表達(dá)模式，可以為進(jìn)一步闡明其分子機(jī)制提供基礎(chǔ)依據(jù)。目前，關(guān)于魚(yú)類(lèi)多倍體起源、遺傳多樣性和耐低氧機(jī)制尚未完全了解。血液可以反映低氧應(yīng)激時(shí)機(jī)體代謝水平和器官機(jī)能狀態(tài)的變化，肝臟作為動(dòng)物體最大的代謝器官，低氧環(huán)境會(huì)導(dǎo)致魚(yú)類(lèi)肝臟中氧化氫酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和超氧化物歧化酶等活性上升。此外，研究表明，低氧可能導(dǎo)致魚(yú)類(lèi)產(chǎn)生強(qiáng)烈的應(yīng)激反應(yīng)而影響其生殖、生長(zhǎng)和發(fā)育等。

因此，本研究通過(guò)RNA-Seq測(cè)序技術(shù)對(duì)鯽魚(yú)肝臟、血液和卵巢組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，旨在發(fā)掘鯽魚(yú)低氧脅迫相關(guān)調(diào)控功能基因，以期為水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中魚(yú)類(lèi)適應(yīng)低氧脅迫策略提供參考；此外，開(kāi)發(fā)一批分子標(biāo)記，以期為鯽魚(yú)種質(zhì)資源評(píng)價(jià)、分子育種和群體遺傳多樣性分析等方面提供基礎(chǔ)信息。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

試驗(yàn)用鯽魚(yú)為個(gè)體大且體表無(wú)損傷的成魚(yú)(體質(zhì)量為120～150 g，體長(zhǎng)為 20～25 cm)，于2019年購(gòu)自貴州省畢節(jié)市水產(chǎn)品交易市場(chǎng)，實(shí)驗(yàn)室充氣暫養(yǎng)1周后，尾部取血后，分別取肝臟和卵巢組織，經(jīng)液氮速凍后于-80 ℃保存、備用。

1.2 總RNA提取

分別取肝臟、血液和卵巢組織各150 mg，采用TRIzol法提取其總RNA。瓊脂糖凝膠電泳分析RNA降解程度及是否有污染，Nanodrop檢測(cè)RNA純度，Qubit2.0對(duì)RNA濃度進(jìn)行精確定量，Agilent 2100精確檢測(cè)RNA的完整性。將5尾個(gè)體相同組織樣品mRNA等量混合，用于cDNA文庫(kù)的構(gòu)建。

1.3 建庫(kù)測(cè)序和拼接組裝

使用NEBNext? UltraRNA Library Prep Kit方法構(gòu)建鯽魚(yú)肝臟、血液和卵巢轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)，庫(kù)檢合格后，進(jìn)行Illumina HiSeq高通量測(cè)序。得到的原始數(shù)據(jù)經(jīng)CASAVA堿基識(shí)別分析轉(zhuǎn)化為原始測(cè)序序列(raw data)，對(duì)原始測(cè)序序列過(guò)濾，得到clean reads。采用Trinity對(duì)clean reads進(jìn)行拼接，轉(zhuǎn)錄本序列信息以FASTA格式儲(chǔ)存。

1.4 基因功能注釋

測(cè)序數(shù)據(jù)采用無(wú)參考基因組分析方法，為獲得全面的基因功能信息，進(jìn)行七大數(shù)據(jù)庫(kù)的基因功能注釋?zhuān)ǚ侨哂嗟鞍仔蛄袛?shù)據(jù)庫(kù)(Non-Redundant Protein Sequence Database，NR)，核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)(Nucleotide Sequence Database，NT)，蛋白質(zhì)家族的集合數(shù)據(jù)庫(kù)(Protein Family，Pfam)，蛋白相鄰類(lèi)的聚簇?cái)?shù)據(jù)庫(kù)(Cluster of Orthologous Groups of Proteins，COG)，真核生物蛋白質(zhì)同源簇?cái)?shù)據(jù)庫(kù)(euKaryotic Orthologous Groups，KOG)，Swiss-Prot蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)(Manually Annotated and Reviewed Protein Sequence Database，Swiss-Prot)，京都基因和基因組百科數(shù)據(jù)庫(kù)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)和基因本體數(shù)據(jù)庫(kù)(Gene Ontology，GO)。

1.5 SNP、InDel和SSR分析

使用Samtools和PicardTools工具對(duì)比，將結(jié)果進(jìn)行染色體坐標(biāo)排序，去掉重復(fù)的reads，通過(guò)變異檢測(cè)軟件GATK2分別進(jìn)行單個(gè)核苷酸變異多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNP)和核苷酸插入或缺失(insertion-deletion，InDel)，并對(duì)原始結(jié)果進(jìn)行過(guò)濾，過(guò)濾掉質(zhì)量值小于30，距離小于5的SNP。采用MISA 1.0對(duì)Unigene進(jìn)行重復(fù)序列標(biāo)記(simple sequence repeats，SSR)檢測(cè)，并對(duì)不同SSR類(lèi)型在基因轉(zhuǎn)錄本的密度分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用RESM軟件，以Trinity拼接得到的轉(zhuǎn)錄組作為參考序列(ref)，將每個(gè)樣品clean reads往ref上做mapping，得到每個(gè)樣品比對(duì)到每個(gè)基因上的readcount數(shù)目，使用每百萬(wàn)fragments中來(lái)自某一基因每千堿基長(zhǎng)度的fragments數(shù)目(expected number of fragments per kilobase of transcript sequence per millions base pairs sequenced，F(xiàn)PKM)表示基因的表達(dá)水平。使用DEGSeq軟件分析不同組織樣品基因表達(dá)差異，從而篩選出差異基因，然后使用K-means和SOM進(jìn)行差異基因聚類(lèi)分析，獲得3種組織中差異基因表達(dá)量的聚類(lèi)模式。為了更好地對(duì)差異基因的功能進(jìn)行研究，分別使用GOSeq和KOBAS軟件對(duì)3個(gè)組織間差異基因進(jìn)行GO富集和KEGG富集分析，同時(shí)將差異基因根據(jù)上調(diào)或下調(diào)分別進(jìn)行富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估與序列組裝分析

經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)質(zhì)量控制，肝臟、卵巢和血液組織分別得到20 332 138、20 209 531、20 451 910個(gè)clean reads，平均GC含量為46.21%。將3個(gè)組織的reads片段拼接組裝，共得到219 192條轉(zhuǎn)錄本(transcript)，平均長(zhǎng)度為1 088 bp，最長(zhǎng)的片段長(zhǎng)度為17 286 bp，最短的片段長(zhǎng)度為181 bp，N50和N90(將拼接轉(zhuǎn)錄本按照長(zhǎng)度從長(zhǎng)到短排序，累加轉(zhuǎn)錄本的長(zhǎng)度，到不小于總長(zhǎng)50%～90%的拼接轉(zhuǎn)錄本的長(zhǎng)度)分別為2 096 bp和397 bp。共得到127 801條unigene，平均長(zhǎng)度為735 bp，最長(zhǎng)的片段長(zhǎng)度為17 286 bp，最短的片段長(zhǎng)度為201 bp，N50和N90分別為1 288 bp和283 bp。轉(zhuǎn)錄組拼接組裝的數(shù)據(jù)已提交至BioProject數(shù)據(jù)庫(kù)(BioProject ID：PRJNA735422)。

2.2 功能基因注釋與分類(lèi)

2.2.1 功能注釋與相似性 通過(guò)BLAST與相應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，最終獲得有注釋信息的unigene數(shù)量為117 414個(gè)，約占總unigene數(shù)量的91.87%。比對(duì)到NT數(shù)據(jù)庫(kù)的unigene數(shù)量最多，為116 885條，占總unigene數(shù)量的91.45%，其次，為NR(39.44%)、KO(17.23%)、KOG(16.21%)、Swiss-Prot(6.52%)、GO(0.08%)，而沒(méi)有unigene比對(duì)到Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)。在以上7個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中至少1個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)注釋成功的unigene有117 414個(gè)，占總unigene數(shù)量的91.87%。

以NR數(shù)據(jù)庫(kù)為例，對(duì)鯽魚(yú)unigene序列的相似性進(jìn)行分析，在斑馬魚(yú)()中相似序列匹配的比例(73.1%)最高，其次為墨西哥麗脂鯉()(52)、虹鱒()(3.4%)、鯉魚(yú)()(1.2%)和羅非魚(yú)()(1.2%)。匹配序列的相似度都大于40%，其中相似度在80%～95%占的比例(45.1%)最高，其次為相似度介于95%～100%(29.6%)、60%～80%(21.1%)、40%～60%(4.2%)。值在0區(qū)間內(nèi)的unigene數(shù)量最多，占總體的19.2%，值介于10～10之間的unigene數(shù)量占總體的15.0%，值介于10～10之間的unigene數(shù)量最少，占總體的10.5%。

2.2.2 unigene的GO注釋分類(lèi) 由圖1可知，鯽魚(yú)3個(gè)組織的轉(zhuǎn)錄組共有105條unigene在GO數(shù)據(jù)庫(kù)生物學(xué)過(guò)程(biological process)、細(xì)胞組分(cellular component)和分子功能(molecular function)三大類(lèi)42個(gè)功能中找到對(duì)應(yīng)。其中，生物學(xué)過(guò)程獲得的注釋信息最多，分子功能獲得的注釋信息最少。在生物學(xué)過(guò)程類(lèi)中，獲得的注釋信息多集中于細(xì)胞學(xué)過(guò)程、單一有機(jī)體過(guò)程、生物調(diào)節(jié)、代謝過(guò)程、生物過(guò)程調(diào)節(jié)、應(yīng)激反應(yīng)和信號(hào)等功能。細(xì)胞組分類(lèi)中，獲得的注釋信息多集中于細(xì)胞、細(xì)胞組件、大分子復(fù)合物和細(xì)胞器等方面。分子功能類(lèi)中，在綁定和催化活性中分布較多，在酶調(diào)節(jié)器活性中分布最少。GO數(shù)據(jù)庫(kù)注釋分類(lèi)有助于從整體上大致了解目的組織全部基因產(chǎn)物的功能，為進(jìn)一步探究基因的功能提供參考。

2.2.3 unigene的KOG注釋分類(lèi) 由圖2可知，KOG數(shù)據(jù)庫(kù)可以對(duì)基因產(chǎn)物進(jìn)行直系同源分類(lèi)，結(jié)果顯示共有20 725條unigene得到注釋?zhuān)罁?jù)功能分為26個(gè)直系同源功能類(lèi)型。其中，參與一般功能預(yù)測(cè)和信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制功能的最多，其次為翻譯后修飾、蛋白質(zhì)折疊與分子伴侶，轉(zhuǎn)錄，細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、分泌與囊泡運(yùn)輸。

2.2.4 unigene的KEGG注釋 由圖3可知，通過(guò)與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，鯽魚(yú)unigene歸屬于A(細(xì)胞過(guò)程)、B(環(huán)境信息處理)、C(遺傳信息處理通路)、D(代謝)和E(有機(jī)系統(tǒng)通路)五大類(lèi)；有機(jī)系統(tǒng)通路注釋比例最高，而遺傳信息處理通路所占比例最低。其中注釋數(shù)量最多的代謝途徑是信號(hào)傳導(dǎo)途徑(3 856個(gè))，注釋數(shù)量大于1 000的為內(nèi)分泌系統(tǒng)(1 776個(gè))，免疫系統(tǒng)(1 769個(gè))，運(yùn)輸和分解代謝途徑(1 426 個(gè))，細(xì)胞群落(1 356個(gè))，折疊、排序和降解途徑(1 191個(gè))，神經(jīng)系統(tǒng)(1 190個(gè))，信號(hào)分子與相互作用途徑(1 086個(gè))。

2.3 不同組織差異表達(dá)基因分析

FPKM是每100萬(wàn)個(gè)fragments中來(lái)自某一基因每千個(gè)堿基長(zhǎng)度的fragments數(shù)目，其同時(shí)考慮了測(cè)序深度和基因長(zhǎng)度對(duì)fragments計(jì)數(shù)的影響，是目前最為常用的基因表達(dá)水平估算方法。因此，筆者所在課題組將readcount數(shù)進(jìn)行了FPKM轉(zhuǎn)換，以不同樣品作為橫坐標(biāo)，不同樣品表達(dá)量(FPKM+1)的對(duì)數(shù)值作為縱坐標(biāo)，繪制3個(gè)組織基因表達(dá)量的FPKM箱線圖，由圖4可知，3種組織表達(dá)量依次為血液>卵巢>肝臟，表明基因在不同組織中轉(zhuǎn)錄水平具有明顯差異。

進(jìn)一步比較差異表達(dá)基因數(shù)目，由表1可知，卵巢vs血液差異表達(dá)基因數(shù)量最多(9 726個(gè))，肝臟vs卵巢次之(8 390個(gè))，肝臟vs血液最少(6 142個(gè))，且卵巢vs血液上調(diào)基因數(shù)量最多，肝臟vs卵巢上調(diào)基因數(shù)量最少，與之相反，肝臟vs卵巢下調(diào)基因數(shù)量最多，卵巢vs血液下調(diào)基因數(shù)量最少。

表1 差異表達(dá)基因數(shù)目(DEGs) 個(gè)

由圖5可知，卵巢vs血液和卵巢vs肝臟差異表達(dá)基因模式相似，多集中于細(xì)胞組分中的胞內(nèi)、細(xì)胞內(nèi)組分、細(xì)胞器、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器和細(xì)胞質(zhì)，和生物學(xué)過(guò)程中的初級(jí)代謝過(guò)程、細(xì)胞大分子代謝過(guò)程、細(xì)胞蛋白代謝過(guò)程、細(xì)胞組分組織或生物合成；在分子功能方面，僅在核糖體結(jié)構(gòu)組成部分有少量差異表達(dá)基因，而肝臟vs血液差異表達(dá)基因數(shù)量最少，多集中于細(xì)胞組分中的蛋白質(zhì)復(fù)合體、中間絲狀體和中間絲狀體細(xì)胞骨架，在生物學(xué)過(guò)程中的氣體運(yùn)輸和氧氣運(yùn)輸，分子功能中的氧氣轉(zhuǎn)運(yùn)子活性、氧氣結(jié)合、鐵離子結(jié)合、亞鐵血紅素結(jié)合和四吡咯結(jié)合方面有少量差異表達(dá)基因(圖5-C)。差異基因的富集分析，為進(jìn)一步篩選組織特異性表達(dá)基因及探究組織特異功能分子調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

在生物體內(nèi)，不同基因相互協(xié)調(diào)行使其生物學(xué)功能，通過(guò)Pathway顯著性富集能確定差異表達(dá)基因參與的最主要生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。由圖6可知，KEGG是有關(guān)Pathway的主要公共數(shù)據(jù)庫(kù)，依據(jù)KEGG代謝途徑數(shù)據(jù)庫(kù)，找出差異基因相對(duì)于所有有注釋的基因顯著富集的Pathway，繪制差異基因KEGG富集散點(diǎn)圖，KEGG富集程度通過(guò)Rich factor、Qvalue和富集到此通路上的基因數(shù)量來(lái)衡量。其中，Rich factor指差異表達(dá)的基因中位于該P(yáng)athway條目的基因數(shù)量與所有有注釋基因中位于該P(yáng)athway條目的基因總數(shù)的比值。Q-value是做過(guò)多重假設(shè)檢驗(yàn)校正后的P-value，Q-value的取值范圍為[0，1]，越接近于0，表示富集越顯著，筆者所在課題組挑選富集最顯著的20條Pathway在圖6中展示，不足20條的則全部展示。由圖6可知，肝臟vs卵巢和卵巢vs血液中，差異表達(dá)基因富集數(shù)量在細(xì)胞周期和核糖體Pathway都較多；卵巢vs血液和肝臟vs血液中，差異表達(dá)基因富集數(shù)量在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工Pathway富集較多，肝臟vs卵巢在錯(cuò)配修復(fù)Pathway富集數(shù)量最少，卵巢vs血液在脂肪酸延長(zhǎng)Pathway富集數(shù)量最少，肝臟vs血液在藥物代謝-細(xì)胞色素P450 Pathway富集數(shù)量最少。

2.4 SNP和SSR統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析

統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，在鯽魚(yú)卵巢組織中檢測(cè)到的SNP位點(diǎn)最多(348 795個(gè))，其次為血液(343 516個(gè))，肝臟組織中最少(307 740個(gè))。其中，肝臟和卵巢組織編碼區(qū)SNP數(shù)量多于非編碼區(qū)，而血液中非編碼區(qū)SNP數(shù)量多于編碼區(qū)數(shù)量。由表2可知，3個(gè)組織中同義突變數(shù)量都多于非同義突變數(shù)量。

表2 SNP統(tǒng)計(jì)

利用MISA從鯽魚(yú)127 801條unigene中共檢測(cè)到48 808個(gè)SSR位點(diǎn)，其中，具有SSR位點(diǎn)的unigene 32 769個(gè)，SSR位點(diǎn)大于1的unigene 10 260個(gè)。不同類(lèi)型SSR出現(xiàn)頻率不同，由圖7可知，單堿基、二堿基和三堿基重復(fù)類(lèi)型所占比例較高，其他3種重復(fù)類(lèi)型所占比例較少。其中，單堿基重復(fù)類(lèi)型中以9～12次重復(fù)數(shù)目的SSR最多，其次為 13～16次重復(fù)數(shù)目的SSR。二堿基重復(fù)類(lèi)型中以 5～8次重復(fù)數(shù)目的SSR最多，9～12次重復(fù)數(shù)目的次之。三堿基、四堿基、五堿基和六堿基重復(fù)類(lèi)型中均以5～8次重復(fù)數(shù)目的SSR最多。且發(fā)現(xiàn)二堿基重復(fù)基元中，AC/GT含量最高，其次為AT/AT，三堿基重復(fù)基元中，AAT/ATT含量最高，ATC/ATG次之。

3 討論與結(jié)論

鯽魚(yú)不僅是一種重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖物種，而且還是研究進(jìn)化基因組學(xué)和生理性適應(yīng)機(jī)制的模式生物，近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)其開(kāi)展了大量研究，獲取了不同組織(嗅覺(jué)上皮、腦、肌肉、肝臟、腎臟和皮膚)的轉(zhuǎn)錄組信息。為進(jìn)一步豐富其基因組數(shù)據(jù)，本研究對(duì)其肝臟、血液和卵巢組織進(jìn)行了高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

3.1 轉(zhuǎn)錄組質(zhì)量

本研究利用Trinity軟件對(duì)所得的reads片段進(jìn)行組裝，得到127 801條unigene，所得unigene的長(zhǎng)度為201～17 286 bp，平均長(zhǎng)度為735 bp。其N(xiāo)50為1 288 bp，N50值越大說(shuō)明組織得到的長(zhǎng)片段越多，組裝效果越好。Q30值在80%以上就認(rèn)為測(cè)序質(zhì)量非常可靠，本研究中鯽魚(yú)肝臟、卵巢和血液轉(zhuǎn)錄組Q30值分別為90.42%、89.59%和90.21%，均大于80%，表明本研究構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)準(zhǔn)確可信，可以為后續(xù)鯽魚(yú)基因克隆及功能基因驗(yàn)證提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

3.2 數(shù)據(jù)庫(kù)注釋與差異表達(dá)基因

數(shù)據(jù)庫(kù)注釋結(jié)果顯示，鯽魚(yú)3個(gè)組織轉(zhuǎn)錄組拼接組裝的127 801條unigene在NR、NT、KO、Swiss-Prot、GO、KOG和KEGG公共數(shù)據(jù)庫(kù)中均得到注釋?zhuān)兄谶M(jìn)一步深入了解基因的功能。其中GO、KOG和KEGG注釋結(jié)果表明，肝臟、卵巢和血液組織中除了參與一般功能預(yù)測(cè)外，參與信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制功能的基因數(shù)量最多，其次是內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)，這可能與肝臟肩負(fù)免疫防御功能、血液是體液調(diào)節(jié)的聯(lián)系媒介，機(jī)體分泌的激素、酶和維生素等物質(zhì)也是依靠血液傳遞才能發(fā)揮對(duì)代謝的調(diào)節(jié)作用，及與類(lèi)淋巴細(xì)胞的免疫防御功能、卵巢主要承擔(dān)雌性生殖與內(nèi)分泌兩大重要功能等密切相關(guān)。

不同組織的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)基因量往往存在差異，如紅鰭東方鲀鰾的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)基因量高于鰓的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)基因量，日本七鰓鰻肝臟組織轉(zhuǎn)錄組表達(dá)基因量則低于血液組織轉(zhuǎn)錄組表達(dá)基因量，本研究中鯽魚(yú)肝臟、血液和卵巢組織的基因表達(dá)量分布顯示，血液的表達(dá)量最高，這可能與血液是體液調(diào)節(jié)的聯(lián)系媒介，參與機(jī)體許多生命活動(dòng)的調(diào)節(jié)過(guò)程有關(guān)。差異表達(dá)基因數(shù)量顯示，卵巢和血液差異表達(dá)基因數(shù)量最多，肝臟和血液差異表達(dá)基因數(shù)量最少，這可能是由于卵巢主要參與雌性生殖的調(diào)控，與血液在功能上重合的較少，二者表達(dá)的基因存在較大差異。肝臟是機(jī)體的代謝中心，而調(diào)節(jié)機(jī)體代謝過(guò)程的一些物質(zhì)主要依靠血液傳遞才能發(fā)揮對(duì)代謝的調(diào)節(jié)作用，所以肝臟和血液在功能上有較多的重疊，二者表達(dá)的基因也相似。一些差異表達(dá)基因則與組織的特異功能息息相關(guān)，如血液除了傳遞調(diào)節(jié)代謝的物質(zhì)外，還主要承擔(dān)著氣體運(yùn)輸、氧氣結(jié)合和運(yùn)輸、鐵離子結(jié)合和亞鐵血紅素結(jié)合的特異功能。

KEGG注釋結(jié)果顯示，肝臟vs卵巢和卵巢vs血液差異主要體現(xiàn)在細(xì)胞周期和核糖體Pathway，推測(cè)這些活動(dòng)相關(guān)Pathway主要與卵巢組織中雌性生殖細(xì)胞的產(chǎn)生密切相關(guān)。卵巢vs血液和肝臟vs血液差異主要體現(xiàn)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工Pathway，推測(cè)其主要與血液中運(yùn)輸?shù)牡鞍踪|(zhì)物質(zhì)加工過(guò)程相關(guān)。此外，肝臟和卵巢可能共同參與錯(cuò)配修復(fù)Pathway，卵巢和血液共同參與脂肪酸延長(zhǎng)Pathway，肝臟和血液共同參與藥物代謝-細(xì)胞色素P450 Pathway。

3.3 分子標(biāo)記

SNP和SSR是利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)最多的2類(lèi)標(biāo)記，本研究依據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)肝臟組織中307 740個(gè)、卵巢組織中348 795個(gè)和血液組織中343 516個(gè)SNP位點(diǎn)，此外，利用MISA軟件在鯽魚(yú)3個(gè)組織中共檢測(cè)到48 808個(gè)SSR位點(diǎn)。與傳統(tǒng)方法相比較，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可以直接反映基因的表達(dá)情況，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)挖掘和開(kāi)發(fā)與性狀相關(guān)的優(yōu)勢(shì)基因型與分子標(biāo)記更省時(shí)、高效，為選育提供遺傳依據(jù)。因此，本研究將為鯽魚(yú)今后的多態(tài)性檢測(cè)、群體遺傳多樣性分析及分子鑒定等方面打下基礎(chǔ)。

本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)鯽魚(yú)的肝臟、血液和卵巢轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序和分析。經(jīng)組裝后最終獲得有注釋信息的unigene共117 414條，不同組織間比較結(jié)果顯示，卵巢與血液差異表達(dá)基因數(shù)量最多，肝臟與血液的差異表達(dá)基因數(shù)量最少。此外，在鯽魚(yú)肝臟、血液和卵巢組織中分別檢測(cè)到 307 740、343 516、348 795個(gè)SNP位點(diǎn)，共檢測(cè)到 48 808 個(gè)SSR位點(diǎn)。研究結(jié)果為進(jìn)一步克隆和挖掘鯽魚(yú)功能基因、多態(tài)性檢測(cè)及群體遺傳多樣性分析以及探究鯽魚(yú)耐低氧分子機(jī)制等方面研究奠定了基礎(chǔ)。