蘭索拉唑致皮膚炎癥的機(jī)制研究

馬夢(mèng)圓，程紫萍，孫魯寧，錢徐萍，孫詩(shī)鈺，王 雨，陳安九*，王永慶，3*

1徐州醫(yī)科大學(xué)江蘇省新藥研究與臨床藥學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221004；2南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇 南京 210029；3南京醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 211166

質(zhì)子泵抑制劑（proton pump inhibitor，PPI）是一類對(duì)各種原因所致的胃酸分泌增加都有良好效果的抑酸藥，已成為臨床抗酸治療的一線用藥［1-2］。隨著PPI 臨床廣泛應(yīng)用，其潛在的不良反應(yīng)也逐漸顯現(xiàn)［3］。長(zhǎng)期使用PPI可誘發(fā)骨質(zhì)疏松癥、肝腎損害及潛在的心血管風(fēng)險(xiǎn)等［4-6］已被證實(shí)，且誘發(fā)皮膚不良反應(yīng)（cutaneous adverse drug reaction，cADR）的報(bào)道也在逐漸增加［7］。PPI 引起的cADR 大多是免疫性的，包括即時(shí)和遲發(fā)性超敏反應(yīng)，多數(shù)情況下表現(xiàn)為斑丘疹、紅斑和瘙癢等，一般措施如停藥和外科基礎(chǔ)護(hù)理即可緩解。然而，如亞急性紅斑狼瘡、中毒性表皮裂解癥等嚴(yán)重不良反應(yīng)可危及患者生命安全，這些cADR常伴隨炎癥反應(yīng)。研究表明，核因子（nouclear factor，NF）?κB 可調(diào)控細(xì)胞因子等在皮膚組織內(nèi)的表達(dá)，參與皮膚炎癥性相關(guān)疾病的發(fā)生［8］。角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT）是皮膚組成的主要部分，可抵御外源性損傷而保護(hù)機(jī)體。當(dāng)皮膚受到刺激后，HaCaT會(huì)產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，誘導(dǎo)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。蘭索拉唑（lansoprazole，LPZ）是目前臨床常用的二代PPI，與一代的奧美拉唑相比，抑酸作用強(qiáng)烈且持久，耐受性好。Kepil等［9］的研究表明蘭索拉唑是誘發(fā)cADR 的“罪魁禍?zhǔn)住?。因此，本研究首先通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，其次以HaCaT 中NF?κB 信號(hào)通路為基礎(chǔ)，運(yùn)用Western blot等技術(shù)，探究蘭索拉唑誘發(fā)皮膚損傷的可能機(jī)制，為臨床安全用藥提供一定參考。

1 材料和方法

1.1 材料

蘭索拉唑原料藥（純度：99.45%，武漢遠(yuǎn)成共創(chuàng)科技有限公司）；羧甲基纖維素鈉（黏度：600～3 000 Pa.s，上海麥克林生化科技有限公司）；蘭索拉唑標(biāo)準(zhǔn)品（純度：99.6%，批號(hào)：100709?201705，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；青鏈霉素混合液（雙抗）、GAPDH抗體（貨號(hào)：GB11002）、HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG（貨號(hào)：GB23303）等（武漢Servicebio 公司）；Cell Count?ing Kit?8（CCK?8試劑盒）、一抗稀釋液、二抗稀釋液、吡咯烷二硫代甲酸銨（pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC）（貨號(hào)：S1808）、PMSF、RIPA 裂解液等（上海碧云天）；胎牛血清（Biological Industries 公司，以色列）；DMEM 培養(yǎng)基、Trypsin?EDTA 消化液（Gibco 公司，美國(guó)）；DMSO（Sigma公司，美國(guó)）；PVDF 膜（Mer?ck 公司，美國(guó)）；NF?κB p65（D14E12）抗體（貨號(hào)：8242S）、Phospho?NF?κB p65（Ser 536）抗體（貨號(hào)：3033S）、白介素（interleukin，IL）?6 抗體（貨號(hào)：12153S）（Cell Signaling Technology 公司，美國(guó)）；IL?1β抗體（貨號(hào)：AF4006）（Affinity 公司，美國(guó)）；化學(xué)發(fā)光液（Millipore公司，美國(guó)）；人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT 細(xì)胞株（GDC0106）（武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心）；ICR 小鼠（SPF 級(jí)，合格證號(hào)：NO.201905643，（南京市青龍山動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)），雌雄各半，18～22 g，于中國(guó)藥科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)，并獲得倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（動(dòng)物倫理編號(hào)：IACUC?1910006）。

化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)Tanon 5200 Multi（上海天能科技有限公司）；電泳儀PowerPacTMBASIC（Bio?Rad 公司，美國(guó)）；酶標(biāo)儀（Bio Tek 公司，美國(guó)）；超聲破碎儀（Sonics公司，美國(guó)）；離心機(jī)（Eppendorf公司，德國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠分組與給藥

小鼠購(gòu)入后適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，之后隨機(jī)分為3組：①對(duì)照組；②低劑量組：蘭索拉唑250 mg/（kg·d）；③高劑量組：蘭索拉唑1 000 mg/（kg·d）。1 周灌胃給藥7 次，每日灌胃給藥時(shí)間不定，對(duì)照組予0.5%CMC?Na 溶液灌胃，低劑量組予12.50 mg/mL 的蘭索拉唑混懸液，而高劑量組予50.00 mg/mL 的蘭索拉唑混懸液。每日稱量記錄小鼠體重，連續(xù)給藥6 個(gè)月。對(duì)小鼠行脫頸椎處死后，在小鼠頸部涂抹脫毛膏，靜置5 min，脫毛完全，剪下小片表皮放入多聚甲醛中進(jìn)行固定，后期作石蠟包埋。將小鼠皮膚組織的蠟塊交由武漢賽維爾公司制作HE染色和IL?6的免疫組化切片。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

HaCaT用含1%雙抗、10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，隔日換液。按照1∶3傳代，取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)狀態(tài)好的細(xì)胞開(kāi)展實(shí)驗(yàn)。

第一階段實(shí)驗(yàn)用0.1%DMSO、10、20、40 μmol/L蘭索拉唑孵育細(xì)胞24 h或48 h。第二階段實(shí)驗(yàn)分為DMSO 組（0.1%）、PDTC 組（20 μmol/L）、PDTC+LPZ組、LPZ 組（40 μmol/L）共4 組。各組間DMSO 含量一致，共同培養(yǎng)24 h或48 h。

1.2.3 CCK?8法檢測(cè)不同濃度蘭索拉唑作用于細(xì)胞24 h后細(xì)胞活力

設(shè)立空白培養(yǎng)基，培養(yǎng)基（含0.1%DMSO）孵育HaCaT為對(duì)照組，另予10、20、40、80、160、200 μmol/L的蘭索拉唑孵育細(xì)胞24 h 后，CCK?8 試劑盒檢測(cè)，37 ℃孵育2.5 h 后測(cè)定吸光值，通過(guò)與各對(duì)照組分析比較，評(píng)價(jià)不同濃度蘭索拉唑?qū)?xì)胞活力的影響。

1.2.4 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)

蘭索拉唑孵育細(xì)胞后，加裂解液于冰上靜置10 min 后刮下細(xì)胞。細(xì)胞破碎超聲后，于4 ℃、14 000 r/min 離心15 min 后取上清。BCA 試劑盒測(cè)定蛋白樣品的濃度，調(diào)齊濃度加入5×蛋白上樣緩沖液，蛋白樣品煮沸變性后-20 ℃保存。配膠后每個(gè)泳道均以35 μg 總上樣量進(jìn)行電泳，待蛋白分離后停止電泳。濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉溶液室溫下封閉90 min。經(jīng)1×TBST緩沖液漂洗后，4 ℃冰箱一抗孵育過(guò)夜。隔日用TBST漂洗條帶10 min，重復(fù)3次。搖床上二抗室溫孵育1.5 h，結(jié)束后仍用TBST 緩沖液漂洗，最后進(jìn)行曝光。以GAPDH 為內(nèi)參，用Image J 軟件對(duì)Western blot 條帶的灰度值進(jìn)行半定量分析，各給藥組目的蛋白的表達(dá)通過(guò)對(duì)照組進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用Graphpad Prism 8.0 軟件進(jìn)行畫圖、非線性擬合，多組間的比較使用單因素方差分析和Turkey’s檢驗(yàn)或Dunnett T3檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 長(zhǎng)期灌胃蘭索拉唑后，小鼠皮膚組織出現(xiàn)炎癥損傷

皮膚組織切片的HE染色結(jié)果如圖1所示，與對(duì)照組相比，低劑量組、高劑量組的表皮發(fā)生不規(guī)則增厚，角質(zhì)細(xì)胞壞死，并出現(xiàn)細(xì)胞水腫，炎癥細(xì)胞外滲及疊痂等現(xiàn)象。高劑量組與低劑量組相比炎癥表現(xiàn)更加顯著，增生更嚴(yán)重。IL?6 免疫組化結(jié)果顯示長(zhǎng)期予蘭索拉唑灌胃后，空白對(duì)照組IL?6幾乎不表達(dá)，低劑量組呈低表達(dá)，而高劑量組則高表達(dá)IL?6，提示小鼠出現(xiàn)炎癥損傷。

圖1 小鼠皮膚組織切片的HE染色和IL?6免疫組化Figure 1 HE staining and IL?6 immunohistochemistry of mouse skin tissue sections

2.2 蘭索拉唑可降低HaCaT細(xì)胞活力

選用10～200 μmol/L 蘭索拉唑處理細(xì)胞24 h 或48 h后，統(tǒng)計(jì)吸光值并分析。結(jié)果如圖2所示，隨著蘭索拉唑給藥濃度的增加，細(xì)胞存活率逐漸下降。孵育過(guò)程中，顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，較高濃度培養(yǎng)后細(xì)胞生長(zhǎng)減緩、形態(tài)皺縮、細(xì)胞活力降低。根據(jù)細(xì)胞存活率作折線圖，由Hill 方程計(jì)算得蘭索拉唑孵育24 h 后對(duì)應(yīng)的半抑制濃度（IC50）為134.5 μmol/L，而48 h 對(duì)應(yīng)的IC50為89.98 μmol/L，此時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為50%，這說(shuō)明蘭索拉唑可降低Ha?CaT 細(xì)胞的生長(zhǎng)活力，且與24 h 相比，48 h 的IC50更低，因此孵育時(shí)間越長(zhǎng)，蘭索拉唑?qū)?xì)胞活力的降低程度越大。

圖2 不同濃度蘭索拉唑孵育HaCaT 24 h或48 h后細(xì)胞活力變化Figure 2 Changes in cell viability of HaCaT after 24 h or 48 h incubation with LPZ at different concentra?tions

2.3 蘭索拉唑可活化NF?kB 通路促進(jìn)HaCaT 炎癥因子表達(dá)

選用10～40 μmol/L 的蘭索拉唑處理細(xì)胞24 h、48 h后，同時(shí)予DMSO作對(duì)照，檢測(cè)分析各組細(xì)胞中炎癥因子的表達(dá)量。蘭索拉唑孵育HaCaT 24 h 結(jié)果如圖3所示，與對(duì)照組相比，蛋白p65的磷酸化水平隨著蘭索拉唑濃度的提高而逐漸增加，炎癥因子IL?6、IL?1β的表達(dá)量也逐漸增加，且與對(duì)照組相比，40 μmol/L的蘭索拉唑孵育HaCaT 24 h后IL?1β的表達(dá)量顯著增加。圖4示蘭索拉唑孵育細(xì)胞48 h后，P?p65表達(dá)量逐漸增加，與對(duì)照組相比，不同濃度蘭索拉唑增加P?p65 蛋白表達(dá)量具有顯著性差異。同時(shí)，結(jié)果分析表明，40 μmol/L 組蘭索拉唑可顯著增加HaCaT 中IL?6、IL?1β蛋白的表達(dá)（圖4C、D）。以上結(jié)果說(shuō)明蘭索拉唑可促進(jìn)P?p65 蛋白的表達(dá)，介導(dǎo)NF?kB通路的活化，促進(jìn)細(xì)胞炎癥因子表達(dá)。

圖3 不同濃度蘭索拉唑孵育HaCaT 24 h后P?p65、IL?6、IL?1β含量變化Figure 3 Changes of P?p65，IL?6 and IL?1β in cells cultured with different concentrations of LPZ for 24 h

圖4 不同濃度蘭索拉唑孵育HaCaT 48 h后P?p65、IL?6、IL?1β含量變化Figure 4 Changes of P?p65，IL?6 and IL?1β in cells cultured with different concentrations of LPZ for 48 h

2.4 NF?κB通路抑制劑PDTC能緩解蘭索拉唑誘發(fā)的細(xì)胞損傷

本研究使用PDTC（20 μmol/L）單獨(dú)或聯(lián)合蘭索拉唑孵育細(xì)胞24 h 或48 h，檢測(cè)蛋白表達(dá)水平的變化，進(jìn)一步驗(yàn)證NF?κB信號(hào)通路活化在蘭索拉唑誘導(dǎo)的皮膚炎癥中發(fā)揮的作用。孵育細(xì)胞24 h 結(jié)果見(jiàn)圖5A。如圖5B 所示，與對(duì)照組相比，LPZ 組P?p65 蛋白的表達(dá)量顯著增加，而PDTC 組與PDTC+LPZ 組未見(jiàn)顯著增加。圖5C、D 顯示，與對(duì)照組相比，LPZ組的炎癥因子IL?6和IL?1β的表達(dá)量顯著增加，而PDTC 組未見(jiàn)顯著增加。圖5D 結(jié)果還表明，與LPZ組相比，PDTC+LPZ組炎癥因子IL?1β的表達(dá)明顯下降，而PDTC 組各蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組相比，均無(wú)顯著性增加，說(shuō)明各蛋白表達(dá)量變化均與藥物相關(guān)，不受其他因素影響。細(xì)胞孵育48 h結(jié)果如圖6 示，與對(duì)照組相比，LPZ 組P?p65 蛋白的表達(dá)明顯增加，炎癥因子表達(dá)量也明顯增加，表明通路活化。同時(shí)，PDTC+LPZ組與LPZ組相比，炎癥因子IL?6、IL?1β的表達(dá)量明顯降低，說(shuō)明PDTC能夠通過(guò)抑制蘭索拉唑的作用，減少炎癥因子的表達(dá)。以上結(jié)果表明，蘭索拉唑誘發(fā)皮膚的炎癥損傷可能與NF?κB 信號(hào)通路激活有關(guān)，抑制劑PDTC 能夠阻斷通路的激活，減少炎癥因子的表達(dá)。

圖5 PDTC單獨(dú)或聯(lián)合蘭索拉唑孵育HaCaT 24 h對(duì)P?p65、IL?6、IL?1β表達(dá)的影響Figure 5 Effects of PDTC alone or combined with LPZ on the expression of P?p65，IL?6 and IL?1β in HaCaT for 24 h

圖6 PDTC單獨(dú)或聯(lián)合蘭索拉唑孵育HaCaT 48 h對(duì)P?p65、IL?6、IL?1β表達(dá)的影響Figure 6 Effects of PDTC alone or combined with LPZ on the expression of P?p65，IL?6 and IL?1β in HaCaT for 48 h

3 討論

目前關(guān)于PPI在炎癥方面作用的相關(guān)研究結(jié)論不一。Chen 等［10］認(rèn)為聯(lián)合使用PPI 可減緩炎癥反應(yīng)，降低胰腺炎發(fā)生率，延緩疾病發(fā)生發(fā)展。而Ye等［11］認(rèn)為聯(lián)合使用蘭索拉唑能夠加重順鉑誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，繼而加重急性腎損傷。還有研究表明，PPI 可能會(huì)引起腸道微生物群組成的改變，誘發(fā)腸道并發(fā)癥［12］。目前有關(guān)于PPI對(duì)皮膚損傷的研究較少，蘭索拉唑誘發(fā)的丘疹、斑疹、瘙癢等皮膚反應(yīng)多伴隨炎癥的發(fā)生。NF?κB通路常用于炎癥發(fā)生的機(jī)制研究，p65 的磷酸化水平是證實(shí)通路活化的檢測(cè)指標(biāo)，細(xì)胞受到刺激后，其抑制蛋白（IκB）?α發(fā)生磷酸化或被降解，并刺激p65 的磷酸化和入核。研究表明，NF?κB信號(hào)通路的活化可激發(fā)炎癥因子IL?6、IL?1β的表達(dá)，進(jìn)一步地，炎癥因子的表達(dá)正反饋激活炎癥通路［13］?，F(xiàn)有的研究均從臨床案例分析蘭索拉唑誘導(dǎo)皮損的原因，很少?gòu)捏w內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)層面探討質(zhì)子泵抑制誘發(fā)皮膚炎癥的機(jī)制研究，因此本研究從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和分子學(xué)層面探索蘭索拉唑誘發(fā)皮膚炎癥的可能機(jī)制。

首先，本研究通過(guò)灌胃給藥建立了長(zhǎng)期使用蘭索拉唑的小鼠模型，建立模型之前，通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)灌胃給予蘭索拉唑250 mg/（kg·d）后，峰值濃度約為4 000 ng/mL，幾乎接近臨床常規(guī)劑量治療的血漿峰值濃度。然后，在此基礎(chǔ)上設(shè)立了一個(gè)4 倍的濃度，此濃度的設(shè)立基于Ⅰ期臨床的毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)給藥劑量的設(shè)置。結(jié)果表明，蘭索拉唑長(zhǎng)期灌胃給藥后，小鼠皮膚組織出現(xiàn)炎癥損傷，HE染色和IL?6的免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果也驗(yàn)證了這一現(xiàn)象。其次，本研究通過(guò)CCK?8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蘭索拉唑?qū)aCaT細(xì)胞活力的影響，預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在10～200 μmol/L濃度范圍內(nèi)，隨著蘭索拉唑給藥濃度的增加，細(xì)胞活性逐漸降低。結(jié)果顯示，蘭索拉唑孵育HaCaT 48 h 較24 h 的IC50值更低，說(shuō)明蘭索拉唑能夠明顯降低細(xì)胞活力，且與時(shí)間相關(guān)。其次，研究發(fā)現(xiàn)蘭索拉唑在40 μmol/L 時(shí)能夠活化NF?κB 通路，促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)，從而導(dǎo)致炎癥損傷。為了進(jìn)一步驗(yàn)證蘭索拉唑誘發(fā)的炎癥損傷與NF?κB 信號(hào)通路相關(guān)，本研究將PDTC 單獨(dú)或聯(lián)合蘭索拉唑孵育細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，與LPZ 組相比，PDTC+LPZ 組的P?p65表達(dá)量明顯降低，且炎癥因子表達(dá)也顯著減少，這說(shuō)明PDTC 能夠抑制蘭索拉唑誘導(dǎo)的NF?κB 通路的激活及減少炎癥因子的表達(dá)。

綜上所述，蘭索拉唑誘導(dǎo)的皮膚炎癥和炎癥因子表達(dá)量的增加與NF?κB 通路的激活相關(guān)，而孵育PDTC 后可通過(guò)抑制蘭索拉唑介導(dǎo)的NF?κB 通路的激活，降低炎癥因子的表達(dá)，減輕蘭索拉唑?qū)aCaT 的炎癥損傷。多年來(lái)，隨著PPI在定義不明確的適應(yīng)證中的應(yīng)用、長(zhǎng)期使用出現(xiàn)的不良后果，以及隨之增加的衛(wèi)生保健費(fèi)用引起了人們的關(guān)注［14］，PPI致cADR的報(bào)道也逐漸增多，如何避免CADR的發(fā)生及針對(duì)cADR更優(yōu)效的藥物，值得進(jìn)一步研究，這也對(duì)促進(jìn)PPI 的臨床安全合理使用更加重要。