不同產(chǎn)地黃芩主要化學(xué)成分含量及抗腫瘤活性比較研究

房佳敏，曾偉民，張彥龍

（黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/黑龍江省普通高校微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080）

0 引言

黃芩為唇形科植物黃芩（Scutellaria baicalensis）干燥的根，具有清熱燥濕、瀉火解毒等功效[1]。在《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第八版）》中醫(yī)治療方案中[2]，推薦使用中藥及中成藥明確標(biāo)注黃芩的配方和用量，雙黃連口服液、清肺排毒湯中，黃芩是重要的原材料[3]?，F(xiàn)階段，黃芩在國(guó)內(nèi)的需求量極大，也是出口到國(guó)外最多的藥材之一[4]。

黃芩主產(chǎn)于黑龍江、遼寧、內(nèi)蒙古、河北、河南、甘肅、陜西、山西、山東、四川等地[5]，目前，多以溫帶、熱帶等地區(qū)的黃芩為研究對(duì)象，而寒帶地區(qū)的黃芩未見(jiàn)詳細(xì)的闡述。黑龍江為寒帶地區(qū)的代表，因具有獨(dú)特地理環(huán)境及氣候，所產(chǎn)黃芩的化學(xué)成分含量也較高。據(jù)報(bào)道，黑龍江省種植的黃芩15～16 t鮮品可提取1 t黃芩苷，而其他地區(qū)需要18～19 t左右提取1 t黃芩苷。黃酮類化學(xué)成分是黃芩中主要的活性成分，黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素4種化學(xué)成分含量較高[6-8]。黃芩苷具有抗菌消炎[9-10]、降轉(zhuǎn)氨酶[11]的作用，漢黃芩苷可以抑制癌細(xì)胞增殖[12-13]及轉(zhuǎn)移[14]，黃芩素能夠抑制多種細(xì)菌生長(zhǎng)[15-16]，漢黃芩素具有抗癌[17-18]與利尿[19]的作用。黃芩的質(zhì)量取決于活性成分的含量，且作為主要的參考指標(biāo)[20]。腫瘤是危害人類健康的主要疾病之一，肺癌在全世界范圍內(nèi)的死亡率一直較高。已有研究證明，黃芩提取物是可以通過(guò)誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞增殖、凋亡發(fā)揮抗腫瘤的作用，其作用機(jī)制為誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、阻斷細(xì)胞周期、清除癌細(xì)胞自由基，抑制肺癌的轉(zhuǎn)移從而達(dá)到抑制NF-kB的活性[21]。

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC技術(shù)測(cè)定黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素4種化學(xué)成分的含量，采用CCK-8試驗(yàn)探討不同產(chǎn)地黃芩對(duì)肺癌細(xì)胞增殖的影響，分析不同產(chǎn)地黃芩中主要化學(xué)成分及抗腫瘤活性的區(qū)別，以期為寒地黃芩的開(kāi)發(fā)及合理利用藥用資源提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)于2020年11月—2020年1月在黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院211實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 儀器與試藥

島津LC-20A型高效液相色譜儀，島津SPD-20A型紫外可變波長(zhǎng)檢測(cè)器，7725i手動(dòng)進(jìn)樣器昆山KQ-500TDB型超聲波清洗器，Milli-Q超純水機(jī)，ML-T電子分析天平。

黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)21967-41-9）、漢黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)51059-44-0）、黃芩素對(duì)照品（批號(hào)491-67-8）、漢黃芩素對(duì)照品（批號(hào)632-85-9）均購(gòu)自于南通飛宇公司，純度均大于98%。甲醇、甲酸、乙醇、丙酮均為分析純，購(gòu)自于天津市富宇精細(xì)化工有限公司。山東、山西、甘肅3個(gè)產(chǎn)地的黃芩樣品購(gòu)自于豪州市盟橋藥業(yè)有限公司，黑龍江的黃芩由黑龍江省勃利縣海林藥業(yè)公司提供。A549肺癌細(xì)胞系購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)，Cell Counting Kit-8試劑盒購(gòu)置于北京碧云天公司。

4種不同產(chǎn)地的黃芩樣品見(jiàn)表1，經(jīng)鑒定為唇形科植物黃芩干燥的根，黃芩樣品存放于陰涼干燥處，備用。

表1 黃芩樣品

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件 Diamonsil-C18色譜柱（4.6mm×250mm，5 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)274 nm；柱溫40℃；流速0.8 mL/min，進(jìn)樣量20 μL；流動(dòng)相為乙腈（B）-0.1%甲酸水溶液（A），梯度洗脫見(jiàn)表2。

表2 乙腈B梯度洗脫順序

1.3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取黃芩苷對(duì)照品0.0075 g、漢黃芩苷0.0025 g、黃芩素0.0010 g、漢黃芩素0.0005 g，放置10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度線，即得混合對(duì)照品溶液。

1.3.3 供試品溶液的制備

（1）制備供試品溶劑的篩選。目前多用乙醇、甲醇、丙酮進(jìn)行黃芩樣品的提取[22]。本研究選用70%乙醇、80%甲醇和60%丙酮對(duì)黃芩樣品進(jìn)行初篩，篩選出對(duì)4種成分提取效果較好的溶劑。

（2）供試品溶液的制備。精密稱取黃芩粉末0.5 g，加入1.3.3（1）篩選出的溶劑40 mL于圓底燒瓶中，加熱回流3 h，將其放冷，過(guò)濾，濾液置于100 mL容量瓶中，漏斗以及圓底燒瓶的殘?jiān)?.3.3（1）篩選出的溶劑分次沖洗干凈，洗液流入同一容量瓶?jī)?nèi)，最后加入1.3.3（1）篩選出的溶劑至刻度線，搖勻即得供試品溶液。

1.3.4 A549肺癌細(xì)胞培養(yǎng) 將A549細(xì)胞放置于RPMI-1640培養(yǎng)基中，37℃下在濕潤(rùn)的CO2培養(yǎng)箱中（5% CO2，95%空氣）培養(yǎng)。

1.3.5 CCK-8試驗(yàn) Cell Counting Kit-8試劑盒用于檢測(cè)各產(chǎn)地黃芩抑制肺癌細(xì)胞的增殖。將96孔板中加入密度為5×105個(gè)細(xì)胞/mL的A549肺癌細(xì)胞過(guò)夜，以不同濃度的4個(gè)產(chǎn)地黃芩乙醇提取物（25、50、100、200、400 μg/mL）處理細(xì)胞，未加樣處理為對(duì)照組，只加培養(yǎng)基且不加細(xì)胞為空白組。將處理好的細(xì)胞放置于CO2培養(yǎng)箱中37℃、5% CO2條件下培育24 h。將培育好的細(xì)胞每孔加入10 μL CCK-8溶液，37℃、5% CO2條件下培育1 h，酶標(biāo)儀測(cè)定OD450。計(jì)算A549肺癌細(xì)胞的存活率，如式（1）。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)3次，采用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA），各組之間采用Fishers LSD test進(jìn)行多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 混合對(duì)照品溶液色譜圖結(jié)果

如圖1所示，黃芩苷對(duì)照品在41.338 min出峰，漢黃芩苷對(duì)照品在51.845 min出峰，黃芩素對(duì)照品在63.217 min出峰，漢黃芩素對(duì)照品在72.983 min出峰。

圖1 混合對(duì)照品溶液色譜圖

2.2 制備供試品溶劑篩選結(jié)果

從表3中可以看出，采用相同的提取方法，80%甲醇對(duì)4種化學(xué)成分的提取明顯高于其他3種，因此選用80%甲醇作為實(shí)驗(yàn)提取溶劑。

該量表由Leary[15]編制，用于評(píng)定獨(dú)立于行為之外的主觀社交焦慮體驗(yàn)的傾向，共15條自陳條目，采用5級(jí)評(píng)分，得分越高，交往焦慮水平越高.國(guó)內(nèi)由馬弘[16]將其翻譯成中文版.2004年彭純子等[17]對(duì)其信效度進(jìn)行了檢驗(yàn)，內(nèi)部一致性系數(shù)為0.81，重測(cè)系數(shù)為0.78，可以作為我國(guó)大學(xué)生社交焦慮研究的有效工具.

表3 3種溶劑提取結(jié)果 mV

2.3 供試品溶液色譜圖結(jié)果

從圖2中可以看出，各產(chǎn)地的4個(gè)化學(xué)成分與對(duì)照品的出峰時(shí)間依次對(duì)應(yīng)，黃芩苷的峰面積最大，即在黃芩中的含量也較多，其次為漢黃芩苷。黃芩素、漢黃芩素的峰面積較小，在黃芩中的含量也較少。

圖2 各產(chǎn)地黃芩色譜疊加圖

勃利黃芩的黃芩苷峰面積最高，其次是山東莒縣、甘肅定西，最后是山西運(yùn)城。漢黃芩苷峰面積由大到小依次為黑龍江勃利、甘肅定西、山東莒縣、山西運(yùn)城。黃芩素峰面積由大到小依次為黑龍江勃利、山東莒縣、山西運(yùn)城、甘肅定西。漢黃芩素峰面積由大到小依次為黑龍江勃利、山西運(yùn)城、山東莒縣、甘肅定西。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 精密吸取1.3.2中的混合對(duì)照品溶液，并將混合對(duì)照品溶液中黃芩苷配制濃度為750、600、450、300、150 μg/mL，漢黃芩苷配制濃度為 250、200、150、100、50 μg/mL，黃芩素配制濃度為100、80、60、40、20 μg/mL，漢黃芩素配制濃度為50、40、30、20、10 μg/mL，測(cè)定并記錄峰面積。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。4種成分的線性回歸方程、線性范圍以及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表4。

表4 4種成分回歸方程以及線性范圍

2.4.2 精密度實(shí)驗(yàn) 取勃利地區(qū)黃芩供試品溶液按1.3.1色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定并記錄峰面積，計(jì)算各成分的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值，得出黃芩苷RSD值為1.34%、漢黃芩苷RSD值為1.25%、黃芩素RSD值為1.59%、漢黃芩素RSD值為1.39%（n=6），說(shuō)明該儀器的精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取勃利地區(qū)黃芩供試品溶液，放置0、2、4、8、12、24 h后按1.3.1色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄各成分的峰面積并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值，黃芩苷RSD值為1.37%、漢黃芩苷RSD值為1.55%、黃芩素RSD值為1.60%、漢黃芩素RSD值為1.42%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取勃利地區(qū)黃芩樣品，精密稱定后按1.3.3（2）方法平行制備6份供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定并記錄峰面積，計(jì)算得出黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均值分別為149、24.35、1.56、0.55 mg/g，其黃芩苷RSD值為1.29%、漢黃芩苷RSD值為1.48%、黃芩素RSD值為1.56%、漢黃芩素RSD值為1.44%，說(shuō)明該方法重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取各對(duì)照品適量，加入到10 mg已知含量的勃利地區(qū)黃芩樣品中，按1.3.3（2）方法平行制備6份供試品溶液，依據(jù)1.3.1色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果（表5）表明各待測(cè)成分回收率良好。

表5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）

續(xù)表5

2.4.6 樣品含量測(cè)定 將各產(chǎn)地的黃芩樣品，按1.3.3（2）方法平行制備3份供試品溶液，并依據(jù)1.3.1色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算4種成分的含量，結(jié)果如表6所示。

表6 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=3） %

表6 結(jié)果表明，4個(gè)產(chǎn)地黃芩樣品中有效活性成分黃芩苷含量由高到低表現(xiàn)為黑龍江勃利＞山東莒縣＞甘肅定西＞山西運(yùn)城，漢黃芩苷含量由高到低表現(xiàn)為黑龍江勃利＞甘肅定西＞山東莒縣＞山西運(yùn)城，黃芩素含量由高到低表現(xiàn)為黑龍江勃利＞山東莒縣＞山西運(yùn)城＞甘肅定西，漢黃芩素含量由高到低表現(xiàn)為黑龍江勃利＞山西運(yùn)城＞山東莒縣＞甘肅定西。由此可見(jiàn)，不同產(chǎn)地來(lái)源的黃芩樣品中的效活性成分含量有顯著差異，黑龍江勃利地區(qū)黃芩中的化學(xué)成分含量居4個(gè)產(chǎn)地首位，這與黑龍江勃利獨(dú)特的地形地貌、氣候條件以及土壤有關(guān)，特殊的自然環(huán)境條件造就了黑龍江勃利地區(qū)黃芩有效成分的積累[23]。

2.5 黃芩對(duì)A549肺癌細(xì)胞增殖的影響

圖4 ～7的結(jié)果表明，A549細(xì)胞的存活與濃度呈現(xiàn)依賴性，隨著濃度增加，A549細(xì)胞的存活率逐漸降低。勃利黃芩提取物在25 μg/mL與對(duì)照組相比有顯著性差異，當(dāng)濃度達(dá)到100 μg/mL時(shí)呈現(xiàn)極顯著差異。莒縣黃芩在25 μg/mL濃度時(shí)與對(duì)照組呈現(xiàn)顯著性差異，200 μg/mL時(shí)呈現(xiàn)極顯著性差異。當(dāng)定西黃芩提取物濃度在25 μg/mL與對(duì)照組相比有顯著性差異，100 μg/mL時(shí)呈現(xiàn)極顯著差異。當(dāng)運(yùn)城黃芩提取物濃度在25 μg/mL與對(duì)照組相比有顯著性差異，當(dāng)濃度達(dá)到200 μg/mL時(shí)呈現(xiàn)極顯著差異。

圖4 勃利黃芩對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響

圖5 山東莒縣黃芩對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響

圖6 甘肅定西黃芩對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響

圖7 山西運(yùn)城黃芩對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響

不同產(chǎn)地黃芩提取物對(duì)A549肺癌細(xì)胞的增殖均有抑制作用，并呈濃度依賴性，表明黃芩具有抗腫瘤的活性。結(jié)果顯示，與對(duì)照品相比黑龍江勃利地區(qū)的黃芩對(duì)A549肺癌細(xì)胞的存活率抑制作用最明顯，其次為山東莒縣＞甘肅定西＞山西運(yùn)城，這與各產(chǎn)地化學(xué)成分含量有關(guān)，化學(xué)成分含量越高，其活性作用越明顯，抑制肺癌細(xì)胞的增殖效果越強(qiáng)，與表6中所得出的結(jié)果吻合。

3 討論

國(guó)內(nèi)種植黃芩的產(chǎn)地眾多，栽培方式和生長(zhǎng)環(huán)境也有較大差異[24]，不同產(chǎn)地黃芩中的黃酮類成分也有較大的差別。2015版《中國(guó)藥典》規(guī)定，按干燥品計(jì)算，樣品中的黃芩苷不得少于9.0%[25]，本實(shí)驗(yàn)所收集的4個(gè)產(chǎn)地得黃芩樣品均達(dá)到要求。

不同產(chǎn)地的黃芩化學(xué)成分含量差異顯著，與前人的研究結(jié)果一致。其原因與地域差異、氣候條件、栽培方法及取樣范圍都有較大的關(guān)系。但前人的研究?jī)H利用高相液相色譜法測(cè)定不同產(chǎn)地黃芩中化學(xué)成分含量的差異，未探究化學(xué)成分含量對(duì)其活性的影響。本研究采用CCK-8試驗(yàn)，檢測(cè)不同產(chǎn)地黃芩提取物對(duì)A549肺癌細(xì)胞增殖情況的影響，此實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了其化學(xué)成分含量越多抗腫瘤活性越強(qiáng)，并為臨床依據(jù)不同病癥、不同產(chǎn)地合理的調(diào)整用藥提供了一定的理論依據(jù)。

本研究對(duì)不同產(chǎn)地的黃芩樣品測(cè)定的數(shù)量較少，對(duì)其活性研究只進(jìn)行了CCK-8試驗(yàn)，在今后的研究中可以增加樣品的數(shù)量，也可檢測(cè)不同生產(chǎn)年限和野生品的寒地黃芩與其他產(chǎn)地的比較。對(duì)其活性的研究也可增加癌細(xì)胞的凋亡、遷移及作用通路，更加系統(tǒng)地闡述寒地黃芩與其他產(chǎn)地黃芩的區(qū)別。